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方法文章

活体成像观察尼古丁诱导的腹侧海马轴突钙信号传导及神经递质释放

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DOI：

10.3791/52730

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2015年6月24日

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

本文内容

摘要

我们开发了一种腹侧海马-伏隔核环路的基因嵌合体构建方法 体外 可实现直接活体成像，用于分析烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）介导的突触传递的突触前机制。该制备方法还为研究突触可塑性的突触前和突触后机制提供了有效的研究途径。

摘要

通过激活突触前烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）实现轴突信号传导的持续增强以及神经递质释放的增加，是乙酰胆碱（ACh）发挥神经调节作用的重要机制。在完整轴突及神经末梢中研究信号传导机制时，面临的主要困难在于难以对这些微小结构进行有效探查，无论是在 体外 和 体内 在突触可塑性突触前成分的研究方面进展有限。本文介绍一种腹侧海马体（vHipp）–伏隔核（nAcc）环路的基因嵌合制备方法 体外 可实现直接的活体成像，用于分析突触传递的突触前和突触后组分，同时选择性地改变突触前与突触后神经元的遗传特征。我们证明，来自腹侧海马（vHipp）微片的投射作为突触前轴突输入，能够与伏隔核（nAcc）来源的分散神经元这一突触后靶细胞形成多个稳定且可靠的谷氨酸能突触。通过同步进行的电生理记录和活细胞成像，检测到不同亚型的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）在突触前的定位，并监测由突触前烟碱型信号介导的突触传递。该实验体系还为研究谷氨酸能突触可塑性的突触前和突触后机制提供了有力的方法。 体外.

引言

胆碱能系统对神经环路兴奋性的调节作用对认知功能的基本方面具有重要影响，而胆碱能调节功能的异常是包括阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症和成瘾在内的神经退行性疾病及神经精神疾病的重要特征。1-4中枢神经系统中胆碱能增强突触传递的一个已知机制是通过直接激活位于突触前部位的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）。这些突触前受体的激活可导致细胞内Ca²⁺浓度升高2+ ([Ca2+]i在突触前末梢中——既可通过某些nAChR亚型相对较高的钙电导直接介导，也可通过细胞内信号级联反应间接介导5从而增强神经递质的释放。事实上，突触前nAChRs的激活已被证实与多种神经递质释放的变化相关，包括谷氨酸、GABA、ACh和多巴胺。6-10尽管已通过电生理学方法在不同突触处对此过程进行了间接研究，但基于[Ca2+]i 突触囊泡循环能够实现对突触前现象更直接且时间上更精确的测量。

通过电子显微镜（EM）水平下对nAChRs进行直接的免疫胶体金标记，已令人信服地证实了nAChRs的突触前定位11,12。此外，也有多种其他技术被用于间接研究nAChRs的定位，包括在培养神经元中检测nAChRs亚基-荧光蛋白嵌合体的分布位置13,14、在突触末梢进行nAChRs电流的电生理记录15,16、通过活细胞成像监测尼古丁诱导的突触末梢内[Ca2+]i变化17，以及利用荧光指示剂通过活细胞成像技术间接监测突触末梢神经递质的释放，例如使用亲脂性苯乙烯类FM染料（FM1-43和FM4-64）和/或突触pHluorin观察突触囊泡的胞吐过程，或使用特异性荧光神经递质探针，如用于乙酰胆碱的CNiFERs和用于谷氨酸的iGluSnFr18-20。总体而言，目前用于确定nAChRs突触前定位的这些方法较为复杂，需要特殊的系统和技术，才能实现对突触前活动的可靠识别和生理监测。

在此，我们描述了一种实验方案及相关设备 体外 腹侧海马体（vHipp）–伏隔核（nAcc）环路的共培养系统，可直接用于鉴定和分析突触传递的突触前和突触后组分。我们展示了烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）在突触前的定位示例，以及nAChR介导的钙离子活细胞成像2+ 沿vHipp轴突的信号传导和神经递质释放。本方案一个自然且直接的延伸是制备由不同基因型神经元构成的突触前和突触后连接。通过这种方式，可直接评估特定基因产物在突触前和/或突触后调节机制中的作用。

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方案

所有动物实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号，2012年修订版）进行，并经纽约州立大学石溪分校机构动物护理和使用研究委员会批准（#1618和#1792）。

1. vHipp-nAcc 突触共培养

  1. 使用 CO2 处死新生小鼠（出生后第 0–3 天，来自野生型（WT）或 α7 nAChRs 转基因小鼠品系）。将每只幼鼠断头，并将尾巴保存于 1.5 ml 离心管中，用于后续基因分型。以下所有步骤均需在无菌操作台中进行。
  2. 用剪刀和镊子移除颅骨顶部，暴露全脑。在解剖显微镜下，从大脑皮层向后分离的交界处开始，获取包含后部皮层（包括 vHipp5,21 ）的冠状切面。
  3. 根据发育中小鼠脑图谱22（图 1A）分离出包含 CA1-下托区域的 vHipp 组织条带。将其转移至含有冷培养基（4 °C）的 35 mm 培养皿中，切成小而薄的组织片（约 100 µm × 100 µm 的微切片）。
  4. 将 12 mm 的聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片预先放入 24 孔组织培养板中，加入培养基（约 500 μl），在 37 °C 培养箱中孵育至少 30 分钟。接种微切片前移除培养基。
  5. 用火焰抛光的巴斯德移液管将最小量的培养基（约 50 μl，包含约 20 片微切片）转移至盖玻片中央，以促进组织块的贴附。每张盖玻片上接种来自单个动物（转基因 α7 品系的 +/+ 或 -/- 基因型）的 vHipp 微切片。
  6. 待组织块沉降到盖玻片上后，沿孔壁缓慢加入额外培养基（约 100 μl），使培养基液面足够高，能完全覆盖盖玻片边缘的组织块，但不淹没中心区域的组织块。
  7. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜孵育后，从胚胎第 18 天至出生后第 1 天的野生型小鼠中分离 nAcc 神经元，并加入至组织块中。
    1. 根据发育中小鼠脑图谱20（图 1B）分离出 nAcc 组织。
    2. 将其切成小块（约 500 µm × 500 µm 的微切片），并转移至 15 ml 离心管中。
    3. 加入 0.25% 胰蛋白酶（2 ml），在 37 °C 下处理 15 分钟。用冷洗涤液（5 ml，4 °C）清洗组织块三次，再用冷培养基（5 ml，4 °C）清洗一次。每次清洗后静置 5 分钟，小心倾去上清液。
    4. 用轻微火焰抛光的巴斯德移液管在 2 ml 培养基中轻柔吹打，使细胞解离。
    5. 将细胞悬液转移至另一 15 ml 离心管中，以 2,000 × rpm 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于培养基中（每 6 只幼鼠用 1 ml 培养基）。用火焰抛光的巴斯德移液管在培养基中轻柔吹打数次，使细胞充分分散。
    6. 向每张含有 vHipp 组织块的盖玻片中加入 0.25 ml 分散的 nAcc 细胞悬液。
    7. 将培养物置于湿润的 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。将培养板放置在湿润的无菌纱布垫上，以机械稳定并维持湿度，促进突触形成。

2. 免疫细胞化学

  1. 固定培养物（5 - 7天 体外在4%多聚甲醛/4%蔗糖/PBS中固定（每张盖玻片约500 μl，20分钟，室温）。
  2. 用 0.25% Triton X-100/PBS 对细胞进行透化处理（每张盖玻片约 500 μl，5 分钟，室温）。
  3. 用10%正常驴血清在PBS中封闭细胞爬片（每张爬片约500 μl，室温孵育30分钟），然后进行抗体染色。一抗于4 °C孵育过夜。使用以下一抗：抗nAChRs（α4-ECD 1:500；抗-α5 亚基（1:500），抗囊泡谷氨酸转运蛋白1（1:250），抗GAD65（1:100）。
  4. 用 PBS 洗去一抗（每次约 500 μl，每张盖玻片洗 3 次，每次 5 分钟），然后在 37 °C 下用 Alexa 488 标记的二抗（每张盖玻片约 500 μl，1:500）或 Alexa 594 标记的二抗（每张盖玻片约 500 μl，1:500）孵育 1 小时。
  5. 在固定前，将培养物置于含 Alexa 594 标记的 αBgTx（每张盖玻片约 500 μl，按 1:1,000 比例加入培养基）的溶液中，37 °C 孵育 45 分钟，以标记细胞表面 α7*nAChRs。
  6. 安装并封固盖玻片。
  7. 使用配备有 Plan-Apochromat 物镜（20X，0.8 NA 或 63X 油镜，1.4 NA）和 CCD 相机的荧光显微镜拍摄图像。

3. 基于FM1-43的囊泡融合

  1. 维持培养（5 - 7 天 体外将成像腔室置于转盘共聚焦显微镜上，在室温下以每分钟1毫升的速度持续灌注HBS混合液。
  2. 停止灌流，并用含 10 µM FM1-43 的 56 mM K⁺ 溶液孵育培养物+ ACSF（约 500 μl）孵育 90 秒（染色），用含 Ca 的溶液洗涤以去除外部染料，持续 15 分钟2+ 含 ADVASEP-7（0.1 mM）的无钙 HBS，用于清除膜结合的 FM1-43。
  3. 用56 mM K刺激培养物+ ACSF（约500 μl）孵育2分钟（去染色），然后在相同条件下重新加入FM1-43染色，再次用含Ca²⁺的ACSF洗涤2+ 含 ADVASEP-7 的无钙镁 HBS 缓冲液孵育 15 分钟
  4. 使用配备平场复消色差物镜（60倍水镜，数值孔径1.4，激发波长488 nm，发射波长530 nm）的转盘共聚焦显微镜获取FM1-43荧光图像，并用CCD相机采集图像。
  5. 采集尼古丁处理前的基础 FM1-43 荧光图像（每 2 秒一次，持续 1 分钟）作为对照；通过快速灌流（2 ml/min）施加尼古丁（1 µM）持续 1 分钟，随后用 HBS 混合液洗脱尼古丁。在整个尼古丁施加前、施加期间及洗脱后，持续以每 2 秒一次的频率采集时间序列图像，总时长为 5 分钟。
  6. 量化 FM1-43 荧光强度（初始荧光强度，F染色）以及之后（F脱色尼古丁在每个突触小体上的施加
  7. 通过量化尼古丁应用前后vHipp轴突上FM1-43荧光强度的差异（ΔF = F染色- F脱色）。使用以下公式分析尼古丁处理后荧光强度下降的比例：F减少% = ΔF/F染色.

4. 钙成像

  1. 冲洗培养物（5 - 7天 体外用正常HBS快速冲洗，然后用5 µM Fluo-4 Ca2+ 指示剂（AM酯）和0.02% Pluronic F-127溶于HBS（2 ml）中，37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟2.
  2. 用HBS洗去Fluo-4溶液（每次5分钟，共3次）。将培养物放回培养箱（37 °C / 5% CO₂）。2至少 30 分钟。
  3. 在相同的成像腔室和条件下维持培养，具体条件参见基于FM1-43的囊泡融合部分（见步骤3.1）。
  4. 使用平场复消色差物镜（60倍水镜，数值孔径1.4，激发波长488 nm，发射波长530 nm）和CCD相机，采集来自vHipp微切片的轴突投射的Fluo-4荧光图像。
  5. 采集基线Fluo-4荧光图像（每10秒一次，持续2分钟）作为尼古丁前对照，通过快速灌流（2 ml/min）施加尼古丁（1 µM）持续1分钟，然后用HBS混合液洗脱尼古丁。在尼古丁施加前、施加期间及洗脱后，持续每10秒采集一次时间序列荧光图像，总时长30分钟。
  6. 保存所有原始fluo-4荧光图像的帧，并导出为一系列TIFF格式图像，以供进一步分析。
  7. 在尼古丁施加前后，采集vHipp轴突上fluo-4荧光的积分强度。
  8. 使用以下公式对整合荧光强度进行归一化：ΔF/F0 =  (F-F0)/F0，其中 F0 是经背景校正后的尼古丁前整合荧光强度，F 是尼古丁施加后各时间点 vHipp 轴突上的整合荧光强度。分析并绘制归一化的整合荧光强度图。

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结果

所采用的制备方法包括体外培养 vHipp–nAcc 神经环路的基因嵌合共培养体系。in vitro 条件下，来自 vHipp 微片的投射作为突触前轴突输入，可与突触后靶细胞——即分散的 nAcc 神经元——形成突触连接。尼古丁通过突触前 α7*nAChRs 受体，诱导由 vHipp 轴突支配的 nAcc 神经元的谷氨酸能传递产生持续性（≥ 30 分钟）增强21，并延长 vHipp 轴突中的钙信号5。

图1 直接证明了来自vHipp微切片的投射为谷氨酸能性（vGluT1阳性），并与nAcc中分散的GABA能中等棘状神经元形成接触（GAD阳性，图1C, D）。在vHipp轴突上可检测到α7*和非α7*烟碱型乙酰胆碱受体（包括α4和α5亚基）（图1E-G），且这些受体特异性地位于vHipp投射与nAcc神经元接触的部位。需要注意的是，来自nAcc的分散神经元不表达α7*烟碱型乙酰胆碱受体（图1H

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讨论

所述的共培养体系在体外重现了腹侧海马-伏隔核环路。in vitro。该体系可相对简便且可靠地检测突触前烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）激活后引发谷氨酸能传递增强的空间和时间特征5, 21。

共培养是指在同一个培养皿中生长不同类型的特定细胞，可提供生理条件 体外 用于演示 体内-样功能。传统的神经元-神经元共培养体系已被引入神经科学研究，用于探究不同类型细胞之间的突触相互作用。然而，在这些共培养体系中，突触的突触前和突触后位点难以明确识别。本微切片-离体神经元共培养方案可实现突触前轴突与突触后靶细胞的清晰识别。通过利用表达不同荧光蛋白的转基因小鼠不同脑区的微切片，该方案还可用于研究轴突-轴突之间的相互作用。

该微切片离散神经元共培养方案的关键步骤是提供一个稳定的环境，以促进组织块的贴附、神经突起的生长以及突触的形成。使用最小体积的培养基接种微切片，并将培养板置于湿润的无菌纱布垫上，是实现微切片贴附和突触形成的两个关键步骤。该共培养方案的主要局限性在于，...

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披露

作者无任何披露信息。 

致谢

感谢Yehui Qin和Mallory Myers提供的技术支持。同时感谢Sigismund Huck博士为我们提供抗α4-ECD抗体。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号NS22061，授予L. W. R.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 培养基（50 ml）
Neurobasal GIBCO1088802248 ml
B-27添加剂GIBCO0080085-SA1 ml
青霉素-链霉素GIBCO10908-0100.5 ml
GlutaMAX 补充剂GIBCO35050-0610.5 ml
脑源性神经营养因子（BDNF）GIBCO15140-12220 ng/ml
2. 洗涤液（HBSS，100 ml）
HBSS，无钙，无镁，无酚红 GIBCO14175-09599 ml
HEPES（1 M）GIBCO15630-1301 ml
3. HEPES 缓冲盐水  (HBS)   pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl₂2SigmaM8266 1 mM
CaCl2SigmaC1016 2 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
葡萄糖SigmaG0350500 10 mM
4. 用于活体成像的HBS缓冲液混合物，pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl₂2SigmaM8266 1 mM
CaCl2SigmaC1016 2 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
葡萄糖SigmaG0350500 10 mM
河豚毒素 Tocris10782 µM
荷包牡丹碱Tocris13110 µM
D-AP-5Tocris10550 µM
CNQXTocris104520 µM
LY341495Tocris120910 µM
5. 无钙  HBS   pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl₂2SigmaM8266 1 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
葡萄糖SigmaG0350500 10 mM
6. 56 mM 钾 ACSF，pH = 7.4
NaClSigmaS9888119 mM
KClSigmaP933356 mM
MgSO₄·7H₂OSigmaM18801.3 mM
CaCl2SigmaC10162.5 mM
NaH2PO4SigmaS82821 mM
NaHCO3SigmaS576126.2 mM
葡萄糖SigmaG0350500 10 mM

参考文献

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活细胞成像转盘共聚焦显微镜烟碱型乙酰胆碱受体基因嵌合体制备腹侧海马-伏隔核环路FM 1-43染色Fluo-4钙离子指示剂
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