用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

摘要

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外 描述了一种在生物物理特性可变的环境中，于群体和单个细胞水平上研究细胞迁移时空行为的方法。

摘要

细胞迁移能力在生命过程中多种细胞功能中至关重要 从胚胎发育到伤口愈合 肿瘤和癌症转移。尽管已有大量研究，但细胞迁移的基本生化与生物物理原理仍未被完全阐明，尤其是在具有生理相关性的三维（3D）微环境中。本文描述了一种 体外 一种用于定量研究细胞三维迁移行为的检测方法。该方法利用细胞的力学感知能力及其向先前未占据的细胞外基质（ECM）迁移的倾向性。我们以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 在胶原凝胶中的侵袭作为模型系统。通过活细胞成像技术，可对培养数周过程中细胞群体的扩散以及单个细胞的迁移动态进行监测，并分析获得具有时空分辨率的数据。此外，该方法可轻松适配于多种不同的细胞外基质，因而为研究微环境中生物物理因素对细胞迁移的影响提供了一种简便而强大的手段。

引言

细胞迁移在多种生理反应（如胚胎发育、止血和免疫反应）以及病理过程（如血管疾病、炎症和癌症）中均发挥着关键作用¹因此，解析细胞迁移背后的生化与生物物理因素，不仅对于理解细胞功能的基本原理至关重要，而且对推动组织工程、抗转移及抗炎药物开发等各类生物医学应用具有重要意义。由于 体内 观察在技术上具有挑战性，因此大量研究工作集中于 体外 细胞迁移的重现

体外研究细胞迁移的方法主要是为在二维（2D）表面进行的实验设计的，其中最著名的是划痕或伤口愈合实验²。这类实验具有操作简便、易于进行活细胞成像的优点，并可为理解细胞迁移背后的多种生化机制提供有价值的见解。然而，这些实验未能考虑细胞外基质（ECM）的结构及其重塑过程，而这些因素在理解体内细胞迁移时至关重要。近年来，人们越来越认识到，三维（3D）培养模型（通常基于胶原基质³）能够更好地模拟体内环境。事实上，细胞在3D环境中的迁移行为与在2D表面上显著不同，这主要归因于环境维度的差异⁴。此外，基质的生物物理和力学特性对细胞迁移具有敏感性影响⁵，包括在肿瘤细胞侵袭过程中的作用⁶。

在此，我们介绍一种用于研究细胞在细胞外基质（ECM）中三维迁移行为的方法，该基质的生物物理特性可通过制备条件便捷地调节。细胞被接种于“内层凝胶”中，随后可从中逃逸并侵入原本无细胞的“外层凝胶”。该方法基于细胞识别外层凝胶中无细胞区域的能力及其向该区域迁移的倾向，这一过程与细胞的力学感知能力密切相关。⁷在本研究中，我们采用胶原网络作为高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭的细胞外基质（ECM）。内外层凝胶的力学性能和微结构均可调节。⁸ 并进行表征⁹ 以实现生理相关的条件。细胞轨迹的重建与分析可对群体水平和单个细胞水平上的时空迁移行为进行详细的定量研究。重要的是，该同心凝胶系统的构建模拟了 体内 迁移细胞（尤其是侵袭性癌细胞）所面临的组织拓扑结构，从而为细胞迁移和转移的物理机制提供重要见解。

方案

1. 细胞收获

1. 从 37 °C、5% CO₂ 培养箱中取出 MD-MBA-231 细胞。使用 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液从培养板上消化细胞。对于 T25 培养瓶中的细胞，使用 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
2. 将细胞在 15 ml 圆锥形离心管中以 200 × g 离心 4 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 ml 培养基中。
3. 使用血细胞计数板计数细胞密度 ρ。
   注意：为制备接种细胞的内层凝胶，后续需将细胞悬液稀释 10 倍以达到最终的细胞接种密度。因此，需要制备浓度为 10 倍的细胞悬液。
4. 计算获得 10 倍细胞浓度所需的培养基体积：
   
   注意：MD-MBA-231 细胞的最终细胞接种密度 c_final 建议约为 2 × 10⁶ 个细胞/ml，本实验方案中采用此值。其他细胞类型可探索不同的接种密度。
5. 再次将细胞在 15 ml 圆锥形离心管中以 200 × g 离心 4 分钟，并弃去上清液。
6. 将细胞充分重悬于所需体积的无血清细胞培养基中（即步骤 1.3 中计算的 V_medium），以最大程度减少细胞团块形成。
   注意：酚红具有自发荧光，可能干扰荧光/反射成像。为获得最佳图像质量，可考虑使用不含酚红的培养基。

2. 胶原蛋白溶液的制备

1. 获取胶原蛋白储备液、10× PBS缓冲液、Milli-Q H₂O、0.1 M NaOH以及若干微量离心管。将所有试剂置于冰上，以防止胶原蛋白提前聚合，并保持无菌状态。
2. 将无菌的玻底培养皿在37 °C培养箱中预热，以达到平衡。
   注意：本方案中的所有体积均针对直径为12 mm的玻底培养皿进行了优化。若使用其他类型的培养皿，请相应调整体积。
3. 根据胶原蛋白储备液的浓度，计算配制50 µl浓度为2.4 mg/ml的内层凝胶（溶液I）所需的体积。
   注意：内层凝胶也可使用其他浓度的胶原蛋白溶液。
4. 在无菌环境（通常为生物安全柜）中，将5 µl的10× PBS缓冲液缓慢加入步骤2.3中计算出的胶原蛋白储备液体积中，轻轻混匀。注意避免产生气泡。
5. 使用校准过的pH计，以0.1 M NaOH调节混合液的pH至7.4。作为粗略参考，大约使用5 µl NaOH可使pH接近7.4（具体用量因储备液浓度和初始pH而异）。
   注意：此步骤涉及的体积过小，无法使用标准pH计直接测量。可采用以下方法之一：
   1. 为多个样品同时配制胶原蛋白溶液。使用标准pH计对总体积进行pH调节，然后将溶液分装至各样品中。
   2. 或者，配制较大体积的胶原蛋白溶液（i.e.，足以使用标准pH计测量的体积），调节其pH至目标值，记录所需NaOH体积，按比例缩小后用于实际实验，并用石蕊试纸确认最终pH值。
   3. 否则，可使用微型pH电极更精确地调节小体积溶液的pH。
6. 用H₂O将溶液补足至45 µl。所有操作均需在冰上进行，以防止胶原蛋白提前聚合。

3. 同心凝胶培养物的形成

1. 从培养箱中取出预热的玻璃底培养皿（见步骤 2.2）。
2. 向溶液 I 中加入 5 µl 的 10 倍浓缩细胞悬液（按步骤 1.5 制备），充分重悬。注意避免产生气泡。此时混合物体积为 50 µl，含有终浓度的胶原蛋白（2.4 mg/ml）和细胞密度（c_final = 2 × 10⁶ 个细胞/ml）。
3. 将 20 µl 含细胞的溶液 I 缓慢加至孔中央，使其形成圆顶状液滴（图 1A）。此步骤需注意避免气泡产生。若出现气泡，应迅速而小心地用移液枪头刺破或吸出。轻柔地将培养皿放回培养箱，使内层凝胶聚合 45 分钟。
4. 在内层凝胶聚合结束前约 15 分钟，开始配制溶液 O（用于外层无细胞胶原凝胶）。
   注意：可通过改变外层凝胶的胶原蛋白浓度和聚合 pH 值，获得具有不同微结构的网络¹⁰。本方案中，重点采用在 pH 7.4 条件下聚合的 1.5 – 4.0 mg/ml 胶原蛋白凝胶。
   1. 根据胶原蛋白储备液浓度，计算配制 200 µl 终浓度胶原蛋白溶液 O 所需的体积。
5. 将 20 µl 的 10× PBS 缓冲液缓慢加入步骤 3.4 计算出的胶原蛋白储备液体积中，轻轻涡旋混匀。使用校准的 pH 计，以 0.1 M NaOH 调节混合液至目标 pH 值。有关 pH 调节的细节，请参见步骤 2.5 的注释。
6. 用 H₂O 将溶液补足至终体积 200 µl。所有操作均需在冰上进行，以防止胶原蛋白提前聚合。
7. 在内层凝胶聚合 45 分钟后（见步骤 3.3），从培养箱中取出培养皿。轻柔地将 180 µl 溶液 O 加至内层凝胶上方，确保溶液完全覆盖内层凝胶并填满孔内（图 1B）。
   1. 此步骤应小心操作，避免搅动溶液，否则可能导致外层凝胶纤维排列不均。注意勿用移液枪头触碰内层凝胶，避免产生气泡或空气 pockets。若出现气泡，应迅速而小心地用移液枪头刺破或吸出。轻柔地将培养皿放回培养箱，使外层凝胶聚合。
8. 外层凝胶聚合 45 分钟后，从培养箱中取出培养皿。此时凝胶应已基本固化，但若操作粗暴仍可能从底部脱离。
   1. 轻柔倾倒 2 ml 预热的细胞培养基至培养皿中（图 1C），确保凝胶完全浸没于培养基中。在整个培养期间，每 2 – 3 天更换一次培养基。

4. 活细胞成像

1. 使用配备长期活细胞成像功能的倒置共聚焦显微镜进行成像。显微镜需内置带有温度（37 °C）和 CO₂（5%）控制的培养室。在实验开始前至少1小时开启显微镜，并预热载物台。
   注意：使用长工作距离的物镜，以优化在三维凝胶中对细胞的观察和定位。
2. 将凝胶置于含有5 µl 荧光细胞示踪染料的培养基中孵育30分钟，以便在三维系统中准确标记细胞位置。随后用1× PBS洗涤三次，去除未结合的染料。之后向培养皿中加入细胞培养基。
3. 从培养箱中取出培养皿，放置于显微镜载物台上（图1D）。
   注意：原则上，外层凝胶聚合完成后即可开始活细胞成像。然而此时内层凝胶中的细胞尚未充分铺展。若需观察最早侵入外层凝胶的细胞迁移行为，可在培养开始后24小时（根据细胞类型而定）启动活细胞成像。作为大致参考，内层凝胶中大多数细胞进入外层凝胶通常需要约12至14天的培养时间。
4. 在外层凝胶中围绕内层凝胶的区域选择成像体积（VoV）。
   1. 所选VoV应包括紧邻凝胶界面的区域、中间区域以及靠近外层凝胶边缘的区域⁷。为避免边缘效应，应排除距离凝胶底部、侧壁以及顶部表面50 µm以内的区域。每个VoV的典型尺寸为647 × 647 × 100 µm³（分别对应x、y和z方向），z轴堆栈间隔为5 µm。
5. 确保正确选择成像模式、通道/滤光片、曝光时间和图像分辨率。在进行延时活细胞成像的同时，利用共聚焦反射显微镜对胶原网络进行无标记成像。
6. 拍摄样本图像，绘制强度直方图，并调整增益和偏移，以确保信号充足且不发生饱和，使直方图范围位于零与最大强度之间。在整个实验过程中不得再更改这些设置。
7. 对选定的VoV进行延时成像，时间间隔Δt为10分钟，持续8小时（或根据需要更长时间）。

5. 细胞追踪与数据分析

1. 使用适当的图像处理软件对 z-层图像进行定量图像后期处理。
   1. 对延时图像进行分割，以自动选择三维细胞位置（x、y、z、t）。
   2. 对每一帧手动检查定位准确性，并移除因细胞碎片或细胞突起被误识别为细胞而产生的假阳性信号。从分析中剔除增殖的细胞，并将重叠或相连的细胞拆分为独立的个体。
2. 根据上一步获得的细胞坐标（x、y、z、t），通过连接时间序列中每个细胞的位置生成三维延时细胞轨迹。
3. 通过剔除短于设定阈值长度（通常为 20 分钟）的轨迹，消除随机噪声和系统噪声。
4. 如有必要，通过从轨迹中减去整体净位移来校正样品漂移。
5. 根据观察到的细胞轨迹计算细胞位移量 和细胞迁移距离 ，其中 表示细胞在时间点 的三维位置矢量， 为总时间点数。
   1. 计算细胞速度：S = d/(n • Δt)，其中 Δt 为帧间时间间隔。使用 P = Δd/d 计算细胞迁移方向性（或持续性）。该简单的持续性度量表明，当 P = 0 时，净位移为零；当 P = 1 时，轨迹为一条直线方向性运动。

结果

本文所示的同心凝胶实验以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 为例进行，内层胶原凝胶浓度为 2.4 mg/ml，细胞接种密度为 = 2 × 10⁶ 个细胞/ml。如图2所示，通常在培养数天后，细胞突破内层与外层凝胶的界面，开始侵入外层凝胶，细胞群体主要呈放射状向外扩散。

可以通过改变外层凝胶的聚合条件，来研究基质密度和机械特性对细胞迁移行为的影响。图3展示了在pH 7.4条件下聚合的1.5 mg/ml、2.4 mg/ml和4.0 mg/ml胶原蛋白外层凝胶中单个细胞的运动情况。在8小时内，于内层与外层凝胶交界处采集共聚焦延时图像，三种不同胶原浓度下细胞的位移以白色箭头标示。根据细胞接种密度和增殖速率的不同，通常每个样品可提取并分析约200条单个细胞轨迹。

我们定量分析了细胞在3种不同胶原蛋白浓度下的运动轨迹，分析指标包括8小时成像期间的平均净位移、迁移距离、方向持续性和平均速度（图4）。结果显示，在4...

讨论

在本方案中，我们描述了一种 体外 用于研究细胞在拓扑结构类似细胞外基质的基质环境中三维迁移行为的实验方法 体内与目前其他可用方法相比，本实验方法主要有三大优势。首先，该方法可同时在群体水平和单个细胞水平上研究细胞迁移机制，从而为研究集体细胞迁移提供了可能¹³，迄今为止主要局限于二维检测方法¹⁴，同时观察群体中单个细胞的行为。对于那些不会自然成群或成簇迁移的细胞，该检测方法提供了一种途径，可从大量处于不同局部微环境中的细胞中详细分析其迁移特性，从而有助于深入理解迁移效率和方向持久性的生物物理起源。^7,15.

其次，通过调整内层和外层凝胶的凝胶条件，可直接研究基质力学性能和微观结构对三维细胞迁移行为的影响¹⁰这一点尤为重要，因为已知细胞迁移和癌症侵袭受到基质力学特性和孔隙率的显著影响。^16,17，以及我们体内的软组织具有极为多样的拓扑结构¹⁸此外，该方法可轻松适用于胶原以外的其他基质。这一优势在于，并非所有细胞系都能在基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养箱	Fisher Scientific Pte Ltd	型号: 371, 序列号 318854-6055
共聚焦显微镜	Nikon A1R		配备培养室的倒置共聚焦激光扫描显微镜
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11965-092
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	10082-147
荧光细胞示踪染料 CMTMR	Life Technologies	C2927
玻璃底培养皿	IWAKI Cell Biology	3931-035	直径35 mm的培养皿，带直径12 mm的玻璃底孔
血细胞计数板	iN CYTO	DHC-N01（改进型Neubauer）
微处理器pH计	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen胶原蛋白	Advanced BioMatrix	#5010-D	酸溶性I型牛胶原蛋白（储存液pH ~ 2）
物镜	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC，工作距离 8.2-6.9 mm，数值孔径 0.45
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
pH计	Sartorius	序列号 29153352	基础型pH计 PB-11
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054