用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

摘要

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外 描述了一种在生物物理特性可变的环境中，于群体和单个细胞水平上研究细胞迁移时空行为的方法。

摘要

细胞迁移能力在生命过程中多种细胞功能中至关重要 从胚胎发育到伤口愈合 肿瘤和癌症转移。尽管已有大量研究，但细胞迁移的基本生化与生物物理原理仍未被完全阐明，尤其是在具有生理相关性的三维（3D）微环境中。本文描述了一种 体外 一种用于定量研究细胞三维迁移行为的检测方法。该方法利用细胞的力学感知能力及其向先前未占据的细胞外基质（ECM）迁移的倾向性。我们以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 在胶原凝胶中的侵袭作为模型系统。通过活细胞成像技术，可对培养数周过程中细胞群体的扩散以及单个细胞的迁移动态进行监测，并分析获得具有时空分辨率的数据。此外，该方法可轻松适配于多种不同的细胞外基质，因而为研究微环境中生物物理因素对细胞迁移的影响提供了一种简便而强大的手段。

引言

细胞迁移在多种生理反应（如胚胎发育、止血和免疫反应）以及病理过程（如血管疾病、炎症和癌症）中均发挥着关键作用¹因此，解析细胞迁移背后的生化与生物物理因素，不仅对于理解细胞功能的基本原理至关重要，而且对推动组织工程、抗转移及抗炎药物开发等各类生物医学应用具有重要意义。由于 体内 观察在技术上具有挑战性，因此大量研究工作集中于 体外 细胞迁移的重现

体外研究细胞迁移的方法主要是为在二维（2D）表面进行的实验设计的，其中最著名的是划痕或伤口愈合实验²。这类实验具有操作简便、易于进行活细胞成像的优点，并可为理解细胞迁移背后的多种生化机制提供有价值的见解。然而，这些实验未能考虑细胞外基质（ECM）的结构及其重塑过程，而这些因素在理解体内细胞迁移时至关重要。近年来，人们越来越认识到，三维（3D）培养模型（通常基于胶原基质³）能够更好地模拟体内环境。事实上，细胞在3D环境中的迁移行为与在2D表面上显著不同，这主要归因于环境维度的差异⁴。此外，基质的生物物理和力学特性对细胞迁移具有敏感性影响⁵，包括在肿瘤细胞侵袭过程中的作用⁶。

在此，我们介绍一种用于研究细胞在细胞外基质（ECM）中三维迁移行为的方法，该基质的生物物理....

方案

1. 细胞收获

1. 从 37 °C、5% CO₂ 培养箱中取出 MD-MBA-231 细胞。使用 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液从组织培养板上消化细胞。对于 T25 培养瓶中的细胞，使用 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
2. 将细胞在 15 ml 圆锥形离心管中以 200 × g 离心 4 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 ml 培养基中。
3. 使用血细胞计数板计数细胞密度 ρ。
   注意：为制备接种细胞的内层凝胶，后续需将细胞悬液稀释 10 倍以达到最终的细胞接种密度。因此，需要制备 10 倍浓缩的细胞悬液。
4. 计算获得 10 倍细胞浓度所需的培养基体积：
   
   注意：MD-MBA-231 细胞的推荐最终细胞接种密度 c_final 约为 2 × 10⁶ 个细胞/ml，本实验方案中采用此值。其他细胞类型可探索不同的接种密度。
5. 再次....

结果

本文以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 为例，采用 2.4 mg/ml 的内层胶原凝胶和每毫升 2 × 10⁶ 个细胞的接种密度，进行了同心凝胶实验。如图2所示，通常在培养数天后，细胞突破内层与外层凝胶的界面，开始侵入外层凝胶，细胞群体主要呈放射状向外扩散。

可以通过改变外层凝胶的聚合条件，研究基质密度和机械特性对细胞迁移行为的影响。图3展示了在pH 7.4条件下聚合的1.5 mg/ml、2.4 mg/ml和4.0 mg/ml胶原蛋白外层凝胶中单个细胞的运动情况。在内层与外层凝胶交界处，连续8小时采集共聚焦延时图像，三种不同胶原浓度下细胞的位移以白色箭头标示。根据细胞接种密度和增殖速率，通常每个样品中可提取并分析约200条单个细胞的运动轨迹。

我们定量分析了细胞在3种不同胶原蛋白浓度下的运动轨迹，分析指标包括8小时成像期间的平均净位移、迁移距离、方向持续性和平均速度（图4）。结果显示，在4.0 m.......

讨论

在本方案中，我们描述了一种 体外 用于研究细胞在拓扑结构类似细胞外基质的基质环境中三维迁移行为的实验方法 体内与目前其他可用方法相比，本实验方法主要有三大优势。首先，该方法可同时在群体水平和单个细胞水平上研究细胞迁移机制，从而为研究集体细胞迁移提供了可能¹³，迄今为止主要局限于二维检测方法¹⁴，同时观察群体中单个细胞的行为。对于那些不会自然成群或成簇迁移的细胞，该检测方法提供了一种途径，可从大量处于不同局部微环境中的细胞中详细分析其迁移特性，从而有助于深入理解迁移效率和方向持久性的生物物理起源。^7,15.

其次，通过调整内层和外层凝胶的凝胶条件，可直接研究基质力学性能和微观结构对三维细胞迁移行为的影响¹⁰这一点尤为重要，因为已知细胞迁移和癌症侵袭受到基质力学特性和孔隙率的显著影响。^16,17，以及我们体内的软组织具有极为多样的拓扑结构¹⁸此外，该方法可轻松适用于胶原以外的其他基质。这一优势在于，并非所有细胞系都能在基.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养箱	Fisher Scientific Pte Ltd	型号: 371, 序列号 318854-6055
共聚焦显微镜	Nikon A1R		配备培养室的倒置共聚焦激光扫描显微镜
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11965-092
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	10082-147
荧光细胞示踪染料 CMTMR	Life Technologies	C2927
玻璃底培养皿	IWAKI Cell Biology	3931-035	直径35 mm的培养皿，带直径12 mm的玻璃底孔
血细胞计数板	iN CYTO	DHC-N01（改进型Neubauer）
微处理器pH计	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen胶原蛋白	Advanced BioMatrix	#5010-D	酸溶性I型牛胶原蛋白（储存液pH ~ 2）
物镜	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC，工作距离 8.2-6.9 mm，数值孔径 0.45
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
pH计	Sartorius	序列号 29153352	基础型pH计 PB-11
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054