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方法文章

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

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DOI：

10.3791/52737

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2015年8月19日

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1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Imaging, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Memphis, 4Department of Engineering Technology, University of Memphis

本文内容

摘要

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。

摘要

目前，人们对细胞和组织如何响应机械刺激具有浓厚兴趣，但现有方法在实时检测活细胞或可存活组织中响应方面的能力仍有限。本研究建立了一种实验方案，利用细胞促动器拉伸生长于弹性基质上的活细胞或附着于基质的组织，同时结合共聚焦显微镜和原子力显微镜（AFM）进行成像。初步研究表明，持续拉伸人支气管上皮细胞可显著增加线粒体超氧化物的生成。此外，利用该方案对肺泡上皮细胞进行拉伸和成像，结果显示过度扩张直接导致上皮细胞损伤，模拟了某种形式的肺损伤。 体外还提供了一种在拉伸细胞上进行原子力显微镜纳米压痕的方案。

引言

许多组织中的细胞会受到机械负荷的作用，这种机械刺激已被证明可促进基因表达模式的改变、生长因子和细胞因子的释放，以及细胞外基质和细胞骨架的重塑1-4。由这类机械刺激引发的细胞内信号转导过程称为机械转导5-7。在呼吸系统中，机械转导的一个结果是，在周期性张应力存在的情况下，肺上皮细胞内活性氧（ROS）8,9和促炎性细胞因子10水平升高。强有力的证据还表明，过度的张应力不仅会引起细胞的生化反应，还会直接导致肺泡上皮的损伤11-14。尽管本文主要关注肺细胞对机械形变的响应，但由机械转导所激活的信号通路在人体多种组织的基本功能中均发挥关键作用，包括血管张力的调节15和生长板的发育16。

人们对机械转导的研究兴趣日益增长，推动了多种设备的开发，这些设备可用于对培养的细胞和组织施加生理相关的机械负荷。特别是施加拉伸应变的装置，由于拉伸是组织常经历的一种机械负荷形式，因而广受欢迎11,17-19。然而，现有许多设备要么被设计为用于组织工程应用的生物反应器，要么不适用于在拉伸过程中进行实时成像。因此，亟需开发能够在拉伸状态下可视化观察细胞和组织的工具与方法，以促进对机械转导通路的研究。

本文设计了一种平面内机械拉伸装置，并开发了可在实时成像组织和细胞的生物化学与力学响应的同时施加多种应变形式的实验方案（图1A-D）。该装置采用六个沿圆周均匀分布的夹具，用于夹持柔性膜并施加平面内径向扩张，最大应变可达约20%（图1B）。驱动装置可长时间置于细胞培养孵育箱内，而电机（图1C）位于孵育箱外部，由电机供应商提供的专用软件进行控制。电机连接至线性驱动器，驱动其内部凸轮旋转，从而均匀带动六个拉伸夹具进行拉伸与松弛运动。

除了机械装置外，还使用市售的细胞培养预处理膜定制了柔性膜，用于该机械系统。然后，在柔性膜上制作并固定了圆形壁（直径约为28 mm），以便细胞仅在此具有明确应变分布的区域内进行培养。为了确定这些膜在驱动装置中的位置是否能在柔性膜中心区域产生均匀且各向同性的应变，使用市售软件进行了有限元分析（图1E-F）。柔性膜的建模采用了对称边界条件，并在网格划分中全部使用四边形单元。如图1F所示的最大主应变等高线图中的同心环表明了应变的各向同性分布。

通过记录加载过程中标记物的图像来测量膜所经历的应变（图2）。图2D显示，在径向和轴向测得的平均膜应变在达到最大线性应变为20%的范围内，与施加的电机计数呈近似线性关系。在扩张过程中测得的应变水平与回缩至静息位置过程中测得的应变水平之间无显著差异。接下来，测量了培养在定制柔性膜上的人支气管上皮细胞（16HBE）及其细胞核的位移。使用共聚焦显微镜配备20倍物镜对荧光标记（DAPI）的16HBE细胞核进行成像，而全细胞位移则通过数字显微镜记录的相差图像进行测量。如图3所示，通过细胞核位移测得的应变与通过膜上标记物位移测得的应变相似，最高可达约20%的线性应变。这证实了施加于膜的应变被有效传递至贴壁细胞。以下步骤提供了在传统显微镜和原子力显微镜上使用该定制装置的操作方案。

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方案

1. 构建具有完整侧壁的膜以保留细胞培养基（最终产物见图1D）

  1. 使用涂有 I 型胶原蛋白（Collagen I）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材，用手术刀或模具切割出柔性膜的轮廓。
  2. 将每张膜置于 60 mm 的培养皿中保存。
  3. 制备围壁：
    1. 按 10:1 的质量比混合 PDMS 的弹性体 A 与弹性体 B（固化剂）。
    2. 将 5 ml 完全混合的 PDMS 倒入 50 ml 离心管中。
    3. 将装有未固化 PDMS 的 50 ml 离心管水平放置于杂交炉中。
    4. 在固化期间，使用旋转功能以 8 rpm 的转速使 PDMS 均匀涂覆于管内壁。在室温下，PDMS 将在 2 天内完全固化。
    5. 在无菌细胞培养操作台中将 PDMS 从管中取出。
    6. 使用新的剃须刀片将 PDMS 圆柱体切割为高度 4 mm 的段。
    7. 将这些段（作为膜的围壁）放入培养皿容器中，避免围壁产生褶皱。
  4. 在培养皿中，选择一个 PDMS 围壁并将其居中放置于一张膜上，保持两者位置对齐。
  5. 在围壁的外周轻轻涂抹未固化的 PDMS（10:1 比例）作为粘合剂。注意防止围壁与膜之间形成缝隙，以确保其能够有效封存液体。
  6. 将每个含有完整膜结构的培养皿置于 70 °C 的烘箱中固化 24 小时。

2. 电机旋转与夹钳位移或径向生长的相关性校准（图2）

  1. 启动控制电机的软件。
  2. 使用电机软件中的手动设置移动装置的夹具。
  3. 测量并记录夹具在最小和最大位移时相对夹具之间的距离及电机计数位置。
  4. 计算夹具间距离随电机计数（约 0–75k 计数）变化的百分比。该值将反映膜上可达到的最大潜在应变。

3. 在小鼠肺上皮细胞系 (MLE12) 上施加拉伸力的应用

  1. 以每孔250万个细胞的密度将MLE12细胞接种于柔性膜上（步骤1），使其在两天内达到融合状态。不同细胞类型的接种密度可能有所不同。
  2. 确保机械驱动装置处于完全松弛的位置。
    1. 移除细胞培养基。
    2. 使用1.5 mm活检打孔器，在膜的每个夹具（见图1D）标签上打两个孔，共六个夹具。孔的径向位置决定了膜初始所受的预张力大小。若不希望施加预张力，则将孔打在距中心20.5 mm半径处的膜标签上。
    3. 将打孔后的膜置于拉伸装置上，使孔与夹具内的销钉对齐。放置上部夹具，交替逐个拧紧螺丝。
    4. 加入1 ml细胞培养基。
  3. 将装置放置在显微镜载物台上，使膜的中心与光路对齐。
  4. 使用胶带或磁铁（如可行）将装置固定在载物台上。固定后，通过显微镜的载物台控制器调节机械装置在平面内（平行于膜）和垂直方向（z方向）的位置。
  5. 通过制造商提供的软件，手动控制电机旋转的位置和速度来施加拉伸刺激20。

4. 线粒体活性氧（ROS）的检测

  1. 待细胞长至融合状态后，直接向细胞中加入 1-2 ml 室温的 DMEM 培养基，并加入线粒体超氧化物指示剂（终浓度为 5 µM）。
  2. 在 37 °C 条件下孵育 10 分钟。
  3. 用已置于 37 °C 水浴中预热的缓冲液轻柔洗涤细胞三次。
  4. 立即将柔性膜置于已固定在直立共聚焦显微镜下方的担架装置上（步骤 2.2）。
  5. 加入 1 ml 含酚红-free 培养基的 DMEM 及 25 mM HEPES。
  6. 设定激发/发射滤光片波长为 510/580 nm。
  7. 每隔 15 分钟拍摄多个视野图像，以构建所需的线粒体超氧化物生成时间序列。
  8. 根据采集的图像，使用可量化荧光强度的软件记录每个时间点的荧光强度直方图。

5. 拉伸与原子力显微镜（AFM）的应用

注意：这些步骤是针对特定的原子力显微镜（AFM）与光学显微镜组合提供的（图4 和材料列表）。

  1. 为实验准备原子力显微镜（AFM）。
    1. 将AFM探头在z方向上的高度升至最大位置。
    2. 在AFM的支脚上安装延长件，以抬高AFM悬臂与样品接触的平面。需要将样品和AFM探头整体抬升，以适应机械装置的高度。
  2. 准备光学显微镜（如可用）。
    1. 取下AFM扫描器盖板，卸下所需物镜。
    2. 在物镜上添加垫片。垫片的高度取决于具体物镜和AFM装置的配置，但如果需要进行光学成像，则此步骤必不可少，因为观察平面将在z方向上移动，移动量等于拉伸装置和适配器的高度（图5A）。请注意，AFM通常通过设备上方的光路提供低倍率成像。
    3. 将所需物镜重新安装至原位，并将扫描器放回AFM上。
    4. 启动AFM软件，开启所有必要的光源，包括用于荧光测量的光源。
    5. 安装带有适合目标测量的悬臂梁的芯片。在测量活细胞弹性模量时，建议使用刚度为200 pN/nm或更低的悬臂。
    6. 按照制造商的建议，在装置上安装的玻璃盖玻片上对激光进行准直，并校准悬臂刚度。
  3. 按照步骤1的方法制备膜，但进行以下修改。
    1. 在将膜安装到拉伸装置之前，立即将膜壁切割至约1 mm高度。此举可避免膜壁与载荷传感器之间发生干扰。
    2. 按照3.2.1–3.2.3所述方法将膜安装到机械装置上。
    3. 移除细胞培养基，以防液体溢出对AFM扫描器造成损坏。
    4. 使用适配器连接装置（图5A），并将带有适配器的机械装置放置在扫描器上。
    5. 将膜拉伸至所需的拉伸应变水平。
  4. 对拉伸状态下的细胞进行纳米压痕。
    1. 在细胞上加入有限体积（<0.5 ml）的培养基，以防止液体溢出对AFM扫描器或显微镜造成损坏。
    2. 使悬臂梁与膜接触。
    3. 按照特定AFM设备的操作规程扫描感兴趣区域。 

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结果

活性氧与形变

既往研究表明，循环拉伸可导致气道和肺泡上皮细胞内活性氧（ROS）水平升高21。活性氧包括来源于分子氧的分子和自由基，对脂质、蛋白质、多糖和核酸具有高度反应性22-24。ROS作为常见的细胞内信号分子，可调节离子通道功能、蛋白激酶/磷酸酶活化以及基因表达，但过量或不受调控的ROS生成可能参与凋亡和坏死性细胞死亡、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病及癌症的发生过程24,25。超氧阴离子是其他形式ROS的前体，可作为线粒体呼吸的副产物产生，其生成源于电子传递链中电子的泄漏。既往研究提示，循环机械拉伸通过NADPH氧化酶系统（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶）和线粒体电子传递链（复合物I和III）共同促进超氧阴离子的生成。有研究提出，这种刺激作用可能是由于线粒体直接受到形变所致21，可能与其和细胞骨架之间的连接有关。为了验证这一假设，我们开发了细胞拉伸装置，以便在活细胞中实时观察机械拉伸引起的ROS生成变化。本文利用定制装置和实验方案，检测了支气管上皮细胞在拉伸作用下线粒...

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讨论

开发了一种用于在机械拉伸过程中进行活细胞成像的独特装置，并将该装置应用于研究肺上皮细胞力学生物学的实验方案中。在初步研究中发现，单次持续拉伸可刺激支气管上皮细胞产生线粒体超氧化物。此外，还证明了机械应变水平的增加会直接破坏肺泡上皮细胞单层的完整性。

为开展这些初步实验，首先对装置进行了校准，随后证明了膜的应变能够传递至细胞（图 2-3）。总体而言，该装置性能良好，如图 3E所示，膜应变（通过膜上的标记测量）与细胞应变（通过细胞核之间的距离测量）之间具有高度相关性。然而，如图 2D所示，在标记的加载和回程过程中，测得的膜应变存在一些微小差异。这可能是由于装置存在回程间隙，也可能与夹持问题有关。此外，还需设计一种通用的装置安装机构，以便在不同配置的显微镜上高效使用，从而在保持与显微镜稳固连接的同时，缩短装置定位与图像采集之间的时间。通过在膜上打孔施加轻微的预应变，可防止因夹持弹性材料而产生初始压缩状态。压缩状态还会导致可施加的最大应变降低。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢孟菲斯大学Fedex技术研究所对本研究的支持。作者谨此致谢孟菲斯大学机械工程系高年级设计项目组的学生（David Butler、Jackie Carter、Dominick Cleveland、Jacob Shaffer），感谢孟菲斯大学工程科技系的Daniel Kohn在电机控制方面的协助，并感谢Dr. Bin Teng和Ms. Charlean Luellen在细胞培养方面的帮助。本研究得到基金项目K01 HL120912（ER）和R01 HL123540（CMW）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SmartMotor NEMA 34：3400 系列MOOG AnimaticsSM3416D集成电机、控制器、放大器、编码器和通信总线
Flexcell 膜（I 型胶原包被）Flexcell 国际公司SM2-1010C3.5" × 5.25" × 0.020"
Sylgard 184道康宁公司10:1
Hoechst 33342 Sigma-AldrichH1399DAPI 染色剂
MitoSOXSigma-AldrichM36008
TironSigma-AldrichD7389 线粒体超氧化物标记物
DMEM超氧化物抑制剂
FBS
HEPES
50 ml 离心管赛默飞世尔科技06-443-19任何离心管均可用于创建成像区域。
杂交炉Bellco 玻璃公司
MLE12 细胞ATCCCRL-2110小鼠肺上皮细胞 
16HBE 细胞ATCCCRL-2741人支气管上皮细胞
AFM 压痕实验
纳米压痕用悬臂梁Budget SensorsSi-Ni30
AFM Asylum ResearchMFP3D
奥林巴斯显微镜奥林巴斯IX-71配备 20X 和 40X 物镜的倒置显微镜。
AFM 镜臂延长器Asylum Research未提供AFM 显微镜
有限元分析
ABAQUSSimulia6.12
软件
ImageJNIH
显微镜
数码显微镜Life TechnologiesEVOS XL Core最初为独立公司，现隶属于 Life Technologies。
共聚焦显微镜蔡司LSM 710双光子直立显微镜

参考文献

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