在机械拉伸活细胞成像

摘要

使用定制的电机驱动机械致动器开发了一种新的成像方案，以允许测量活细胞对机械应变的实时响应。与机械生物学相关，该系统可以施加高达 20% 的应变，同时允许使用共聚焦或原子力显微镜进行近乎实时的成像。

摘要

目前人们对了解细胞和组织如何对机械刺激做出反应非常感兴趣，但目前的方法在实时测量活细胞或活组织反应的能力方面受到限制。开发了一种使用细胞致动器的方案，以扩增生长在弹性基材上的活细胞或附着在弹性基材上的组织，同时使用共聚焦和原子力显微镜 （AFM） 进行成像。初步研究表明，人支气管上皮细胞的强直性拉伸导致线粒体超氧化物的产生显着增加。此外，使用该方案，对肺泡上皮细胞进行拉伸和成像，结果显示过度膨胀在体外模拟一种形式的肺损伤对上皮细胞的直接损伤。还提供了在拉伸细胞上进行 AFM 纳米压痕的协议。

引言

细胞进行机械载荷在许多组织中，而这种机械刺激已经显示出促进基因表达的变化，生长因子，细胞因子或细胞外基质的重塑释放的模式和细胞骨架^1-4。从这样的机械刺激转导的胞内信号，以通过机械传导^5-7的过程发生。在呼吸系统，机械传导的一个结果是增加的活性氧（ROS）的肺上皮细胞中的环状拉伸应变的存在下^8,9-和促炎细胞因子^10。强有力的证据也表明，过量的拉伸应变导致直接伤害到肺泡上皮中，除了元件^11-14的生化反应。虽然这里的重点主要是对肺细胞的机械变形的响应，诱发力传导通路起到BAS关键作用在人体内许多组织，包括血管紧张¹⁵的调节和生长板¹⁶的发展的集成电路功能。

的在机械传导日益增长的兴趣已经导致许多装置开发用于生理学相关的机械负载的应用，培养细胞和组织。特别是，施加拉伸应变，这是机械负荷经历组织的常见形式，设备是受欢迎^11,17-19。然而，许多现有的装置被设计或者作为生物反应器用于组织工程应用或不利于实时成像伸展。因此，有必要开发工具和方法，可以可视化的细胞和组织中的张力，以促进机械传导的途径的调查。

此处，面内机械拉伸装置被设计和协议被开发应用米到组织，同时允许在实时（ 图1A-D）的生物化学和机械响应的成像ultiple形式株和细胞。该装置利用布置在圆周抓住一个柔性膜和施加在平面内，径向膨高达约20％（ 图1B）6均匀间隔夹具。所述致动装置可放置在细胞培养孵化器在延长的时间周期，而电机（ 图1C）位于所述培养箱外并通过由电动机供应商所提供的专用软件控制。电动机被连接到线性驱动器，其旋转一个内凸轮，驱动六担架夹子均匀地拉伸和放松。

除了机械设备，定制柔性膜由市售细胞培养准备膜产生的机械系统中使用。然后圆形壁（具有直径约28毫米）作了并附着到柔性膜使细胞只能在良好描述应变轮廓的这个区域进行培养。为了确定所述致动装置内的放置这些膜是否会提供均匀的和各向同性的应变在弹性膜的中心，有限元分析，使用市售的软件（ 图1E-F）进行的。灵活的膜仿照对称的边界条件与利用网格的所有四边形单元。见于最大主应变的图1F所示的等高线图的同心圆环指示菌株的各向同性分布。

所经历的膜的应变是由通过负载（ 图2）的记录标记的图像进行测量。 图2D示出了在径向和轴向方向测得的平均膜应力为近似线性相对于所施加的电动机向上计数到20％的最大线性应变。有腹胀期间与回缩回到静止位置时相比，测量测得的应变水平之间没有差异显著。接着，人支气管上皮细胞（16HBE），核上的定制柔性膜培养的位移进行测定。在16HBE细胞的荧光标记的吲哚（DAPI）细胞核使用共聚焦显微镜下一个20X物镜成像，而全细胞位移的测定使用记录用数字显微镜相衬图像。正如在图3中 ，由核位移测量的应变是类似于由斑纹的位移对膜测得的，高达约20％的线性应变。这证实了施加到膜的应变被传递到贴壁细胞。描述在传统显微镜的使用自定义设备的协议和原子力microscope被在下面的步骤提供。

方案

1.构造膜与井壁为细胞保留培养基（参见图1D为最终产品）

1. 使用涂覆有胶原I聚二甲基硅氧烷（PDMS）片，切开柔性膜的轮廓用手术刀或模具。
2. 将每个膜在60毫米的培养皿进行存储。
3. 创建墙:
   1. PDMS混合在10:弹性体A的1重量比为弹性体B（固化剂）。
   2. 倒入加入5ml充分混合成PDMS 50ml试管。
   3. 放置50ml试管用未固化的PDMS水平在杂交烘箱。
   4. 在固化时使用转子函数来涂覆管的内壁8的转速。在RT，PDMS的将完全固化2天。
   5. 在无菌细胞培养罩除去从管中的PDMS。
   6. 使用一个新的刀片，分区的PDMS的气缸段4毫米的高度。
   7. 放置的部分，这将作为膜わLLS，成不使一个培养皿容器壁变得折痕。
4. 在一个膜选择和中心一面墙上的PDMS同时保持两个培养皿。
5. 轻轻地放在未固化的PDMS:在墙壁上的外周（10比1的比例），以用作胶水。防止形成的壁和所述膜之间的间隙，因为它的存在，以保持液体。
6. 把这个包含完成膜和覆盖在烘箱中于70℃下放置24小时以固化各培养皿。

2.相关电机转动圈与夹具位移或径向生长的校准（图2）

1. 启动软件控制电动机。
2. 置换设备的使用电机软件手动设置的夹子。
3. 测量距离，并记录在最小和最大的夹具位移相对夹钳之间的电动机计数位置。
4. 计算在对d变化百分比夹具作为电动机计数（〜0-75k计数）的功能之间istance。这将表明实现了对膜的最大潜在应变。

拉伸对小鼠肺上皮细胞3.应用（MLE12）

1. 种子MLE12细胞以每孔250万细胞上的柔性膜（步骤1）将在两天内汇合。接种密度可以变化为不同的细胞类型。
2. 确保机械致动器处于完全松弛位置。
   1. 除去细胞的培养基。
   2. 使用1.5毫米活检穿孔，冲两个孔在每六个夹具（参见图1D）膜的标签。孔的径向位置决定预张力的量的膜经历最初。冲孔在20.5毫米的膜片的半径，如果没有预张力是理想的。
   3. 定位膜上与冲压孔排队有夹具内引脚的担架。将顶部夹具到位。拧紧螺钉一次双方交替。
   4. 加入1毫升细胞培养基。
3. 将设备放在显微镜阶段定心与所述光路的膜的中间。
4. 使用磁带或磁体（如果可能的话）将设备固定到舞台上。一旦固定，控制面内（平行于膜）的机械装置与显微镜的载物台控制的和垂直（z方向）。
5. 与由手动控制电动机旋转²⁰的位置和速度由制造商提供的软件应用伸展。

4.测量线粒体活性氧（ROS）

1. 一旦细胞汇合，加入1-2毫升RT DMEM中与线粒体超氧化物指示器（5μM终浓度）直接作用于细胞。
2. 孵育10分钟，在37℃。
3. 洗涤细胞轻轻三次缓冲在水浴温热至37℃。
4. 立即放置在担架上（步骤2.2）已经到位的柔性膜的直立共聚焦显微镜下观察。
5. 加入1毫升的DMEM与无酚红培养基和HEPES 25mM的。
6. 设置激发/发射过滤器五百八十〇分之五百十纳米。
7. 图片多个领域，每15分钟创造线粒体超氧生产所需的时间过程。
8. 从拍摄的图像，记录的荧光强度在每个时间间隔中利用软件能够量化荧光强度直方图。

5.应用拉伸和原子力显微镜（AFM）

注:提供的特定原子力显微镜和光学显微镜的组合（ 图4和材料清单）这些步骤。

1. 准备的AFM实验。
   1. 增加的原子力显微镜头的高度，以它的在z方向上的最大位置。
   2. 把扩展在AFM的腿解除平面处的AFM悬臂接触样品。试样和原子力显微镜头需要被提升，以适应机械装置的高度。
2. 准备光学显微镜（如果可用）。
   1. 取出AFM扫描板。删除了预期的目的。
   2. 添加间隔物的目标。的隔离物的高度将取决于目标和具体的AFM设置，但它是必要的，如果光学成像期望因为观察面将是一个等于担架和适配器高度（ 图移在z方向图5A）。需要注意的是在原子力显微镜通常提供低倍率摄像从装置上方的光路。
   3. 安装了预期的目的放回其位置。将扫描仪背面上的原子力显微镜。
   4. 启动AFM软件。启动所有必需的光源包括光源的荧光测量。
   5. 安装有一个悬臂梁的芯片适合于所需的测量。测定活细胞的弹性模量时200 PN / nm以下刚性是优选的。
   6. 对准激光，并根据制造商对安装在该装置上的玻璃盖玻片建议校准悬臂刚度。
3. 制备的膜作为第1步，但进行如下修改。
   1. 立即安装在膜上的拉伸装置之前，切割的壁至约1毫米的高度。这可以防止所经历的膜壁和负载元件之间的干扰。
   2. 如上所述3.2.1-3.2.3安装膜的机械装置上。
   3. 除去细胞的培养基，以防止损坏的原子力显微镜扫描仪中的情况下泄漏的。
   4. 耦合装置与适配器（ 图5A）。将机械装置与扫描仪上的转接器。
   5. 拉伸膜到期望的拉伸应变水平。
4. 纳米压痕拉伸细胞。
   1. 添加的媒体有限的（<0.5毫升）卷上的细胞，以避免AFM扫描仪或显微镜损害，由于泄漏。
   2. 接合悬臂梁与膜。
   3. 按照特定的原子力显微镜装置的协议进行扫描感兴趣的领域。

结果

活性氧和变形

先前的研究已经响应于循环拉伸²¹中所示的增加的活性氧（ROS）的气道和肺泡上皮细胞。活性氧包括分子和来自于分子氧具有高反应性的脂质，蛋白质，多糖和核酸^22-24自由基。 ROS用作共用的细胞内信号来调节离子通道功能，蛋白激酶/磷酸酶的激活和基因表达，但过量的或未调节的产生可以向凋亡和坏死性细胞死亡，神经变性，动脉粥样硬化，糖尿病和癌症^24,25。超氧化物，预光标为其他形式的ROS，可以制造作为线粒体呼吸的副产物，当电子从电子传递链泄漏。以往的研究表明，周期性牵张刺激了生产超氧化物通过NADPH氧化酶系统（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶）和线粒体电子传递链（复合物I和III）的组合。已经提出了这种刺激是由于线粒体²¹可能直接失真由于连接到细胞骨架。为了检验这一假设，细胞拉伸装置的开发，使我们可以在ROS产生于活细胞响应机械拉伸影像学改变。在这里，由因拉伸支气管上皮细胞产生的线粒体活性氧使用自定义设备和协议进行测量。在没有机械拉伸的，ROS产生没有显著在60分钟（ ...

讨论

对于在机械拉伸活细胞成像的独特装置的开发;这个装置是用在协议研究肺上皮细胞的力学生物学。在初步研究中，人们发现，单个保持伸展刺激生产在支气管上皮细胞线粒体超氧化物。此外，证实了机械应变水平的增加造成直接损伤肺泡上皮细胞的一个单层的完整性。

进行这些初步实验中，该装置被第一校准，然后将其结果表明，在膜的应变被传递到细胞中（ 图2-3）。整体的设备执行良好，由图3E中所示的膜应变（用标记在膜上测定）和细胞株（由原子核之间的距离测量）之间的密切相关性所指示的。然而，有斯特拉之间观察到一些细微的差别在测量上的方法中的膜和标记的返回曲线， 如图2D所示 。这可能是由于在该装置后冲和可能与夹紧的问题。此外，需要一种通用的安装机构，用于该装置，使之能够有效地在显微镜用不同的配置中使用。这将减少，同时保持稳固的连接到显微镜的设备和图像采集的定位之间所花费的时间。眼儿的膜用于将次要预应变施加到膜，以防止形成的初始压缩状态由于夹紧弹性材料制成的。压缩状态也导致减少最大适用应变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SmartMotor NEMA 34： 3400 系列	MOOG Animatics	SM3416D	集成电机、控制器、放大器、编码器和通信总线
Flexcell 膜（胶原蛋白 I 涂层）	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	道康宁公司		10：1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI 染色
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	线粒体超氧化物标记
DMEM			超氧化物抑制剂
FBS
HEPES
50 ml 管	Fisher Scientific	06-443-19	任何离心管都可用于创建成像区域。
杂交炉	Bellco Glass
MLE12 细胞	ATCC	CRL-2110	小鼠肺上皮细胞
16HBE细胞	ATCC	CRL-2741	人支气管上皮细胞
AFM压痕实验
用于纳米压痕	预算传感器	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
奥林巴斯显微镜	Olympus	IX-71	具有 20 倍和 40 倍物镜的倒置显微镜。
AFM 腿部扩展器	庇护研究	不可用	AFM 显微镜
有限元分析
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital显微镜	Life Technologies	EVOS XL Core	最初是一家独立的公司，现在归 Life Technologies 所有。
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 710	2 光子正置显微镜