活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

摘要

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。

摘要

目前，人们对细胞和组织如何响应机械刺激具有浓厚兴趣，但现有方法在实时检测活细胞或可存活组织中响应方面的能力仍有限。本研究建立了一种实验方案，利用细胞促动器拉伸生长于弹性基质上的活细胞或附着于基质的组织，同时结合共聚焦显微镜和原子力显微镜（AFM）进行成像。初步研究表明，持续拉伸人支气管上皮细胞可显著增加线粒体超氧化物的生成。此外，利用该方案对肺泡上皮细胞进行拉伸和成像，结果显示过度扩张直接导致上皮细胞损伤，模拟了某种形式的肺损伤。 体外还提供了一种在拉伸细胞上进行原子力显微镜纳米压痕的方案。

引言

许多组织中的细胞会受到机械负荷的作用，这种机械刺激已被证明可促进基因表达模式的改变、生长因子和细胞因子的释放，以及细胞外基质和细胞骨架的重塑^1-4。由这类机械刺激引发的细胞内信号转导过程称为机械转导^5-7。在呼吸系统中，机械转导的一个结果是，在周期性张应力存在的情况下，肺上皮细胞内活性氧（ROS）^8,9和促炎性细胞因子¹⁰水平升高。强有力的证据还表明，过度的张应力不仅会引起细胞的生化反应，还会直接导致肺泡上皮的损伤^11-14。尽管本文主要关注肺细胞对机械形变的响应，但由机械转导所激活的信号通路在人体多种组织的基本功能中均发挥关键作用，包括血管张力的调节¹⁵和生长板的发育¹⁶。

人们对机械转导的研究兴趣日益增长，推动了多种设备的开发，这些设备可用于对培养的细胞和组织施加生理相关的机械负荷。特别是施加拉伸应变的装置，由于拉伸是组织常经历的一种机械负荷形式，因而广受欢迎^11,17-19。然而，现有许多设备要么被设计为用于组织工程应用的生物反应器，要么不适用于在拉伸过程中进行实时成像。因此，亟需开发能够在拉伸状态下可视化观察细胞和组织的工具与方法，以促进对机械转导通路的研究。

本文设计了一种平面内机械拉伸装置，并开发了可在实时成像组织和细胞....

方案

1. 构建具有完整侧壁的膜以保留细胞培养基（最终产物见图1D）

1. 使用涂有 I 型胶原蛋白（Collagen I）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材，用手术刀或模具切割出柔性膜的轮廓。
2. 将每张膜置于 60 mm 的培养皿中保存。
3. 制备围壁：
   1. 按 10:1 的质量比混合 PDMS 的弹性体 A 与弹性体 B（固化剂）。
   2. 将 5 ml 完全混合的 PDMS 倒入 50 ml 离心管中。
   3. 将装有未固化 PDMS 的 50 ml 离心管水平放置于杂交炉中。
   4. 在固化期间，使用旋转功能以 8 rpm 的转速使 PDMS 均匀涂覆于管内壁。在室温下，PDMS 将在 2 天内完全固化。
   5. 在无菌细胞培养操作台中将 PDMS 从管中取出。
   6. 使用新的剃须刀片将 PDMS 圆柱体切割为高度 4 mm 的段。
   7. 将这些段（作为膜的围壁）放入培养皿容器中，避免围壁产生褶皱。
4. 在培养皿中，选择一个 PDMS 围壁并将其居中放置于一张膜上，保持两者位置对齐。
5. 在围壁的外周轻轻涂抹未固化的 PDMS（10:1 比例）作为粘合剂。注意防止围壁与膜之间形成缝隙，以确保其能够有效封存液体。
6. 将每个含有完整膜结构的培养皿置于 70 °C 的烘箱中固化 24 小时。
....

结果

活性氧与形变

既往研究表明，循环拉伸可导致气道和肺泡上皮细胞内活性氧（ROS）水平升高²¹。活性氧包括来源于分子氧的分子和自由基，对脂质、蛋白质、多糖和核酸具有高度反应性^22-24。ROS作为常见的细胞内信号分子，可调节离子通道功能、蛋白激酶/磷酸酶活化以及基因表达，但过量或不受调控的ROS生成可能参与凋亡和坏死性细胞死亡、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病及癌症的发生过程^24,25。超氧阴离子是其他形式ROS的前体，可作为线粒体呼吸的副产物产生，其生成源于电子传递链中电子的泄漏。既往研究提示，循环机械拉伸通过NADPH氧化酶系统（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶）和线粒体电子传递链（复合物I和III）共同促进超氧阴离子的生成。有研究提出，这种刺激作用可能是由于线粒体直接受到形变所致²¹，可能与其和细胞骨架之间的连接有关。为了验证这一假设，我们开发了细胞拉伸装置，以便在活细胞中实时观察机械拉伸引起的ROS生成变化。本文利用定制装置和实验方案，检测了支气管上皮细胞在拉伸作用下线粒.......

讨论

开发了一种用于在机械拉伸过程中进行活细胞成像的独特装置，并将该装置应用于研究肺上皮细胞力学生物学的实验方案中。在初步研究中发现，单次持续拉伸可刺激支气管上皮细胞产生线粒体超氧化物。此外，还证明了机械应变水平的增加会直接破坏肺泡上皮细胞单层的完整性。

为开展这些初步实验，首先对装置进行了校准，随后证明了膜的应变能够传递至细胞（图 2-3）。总体而言，该装置性能良好，如图 3E所示，膜应变（通过膜上的标记测量）与细胞应变（通过细胞核之间的距离测量）之间具有高度相关性。然而，如图 2D所示，在标记的加载和回程过程中，测得的膜应变存在一些微小差异。这可能是由于装置存在回程间隙，也可能与夹持问题有关。此外，还需设计一种通用的装置安装机构，以便在不同配置的显微镜上高效使用，从而在保持与显微镜稳固连接的同时，缩短装置定位与图像采集之间的时间。通过在膜上打孔施加轻微的预应变，可防止因夹持弹性材料而产生初始压缩状态。压缩状态还会导致可施加的最大应变降低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SmartMotor NEMA 34：3400 系列	MOOG Animatics	SM3416D	集成电机、控制器、放大器、编码器和通信总线
Flexcell 膜（I 型胶原包被）	Flexcell 国际公司	SM2-1010C	3.5" × 5.25" × 0.020"
Sylgard 184	道康宁公司		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI 染色剂
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	线粒体超氧化物标记物
DMEM			超氧化物抑制剂
FBS
HEPES
50 ml 离心管	赛默飞世尔科技	06-443-19	任何离心管均可用于创建成像区域。
杂交炉	Bellco 玻璃公司
MLE12 细胞	ATCC	CRL-2110	小鼠肺上皮细胞
16HBE 细胞	ATCC	CRL-2741	人支气管上皮细胞
AFM 压痕实验
纳米压痕用悬臂梁	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
奥林巴斯显微镜	奥林巴斯	IX-71	配备 20X 和 40X 物镜的倒置显微镜。
AFM 镜臂延长器	Asylum Research	未提供	AFM 显微镜
有限元分析
ABAQUS	Simulia	6.12
软件
ImageJ	NIH
显微镜
数码显微镜	Life Technologies	EVOS XL Core	最初为独立公司，现隶属于 Life Technologies。
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 710	双光子直立显微镜