本文介绍一种分离小鼠腹腔巨噬细胞的简单方案。该操作随后进行RNA提取，以在Toll样受体刺激后开展基因表达分析。
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本文内容
摘要
摘要
在感染和炎症过程中，循环单核细胞会离开血液并迁移至组织中，在组织中分化为巨噬细胞。巨噬细胞表达表面Toll样受体（TLRs），这些受体能够识别在多种微生物中进化上保守的分子模式。TLRs在巨噬细胞活化过程中发挥核心作用，通常与基因表达的改变相关。巨噬细胞在多种疾病中具有关键作用，并已成为有前景的治疗靶点。在以下实验方案中，我们描述了一种使用Brewer氏巯基乙酸盐培养基分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法。该培养基可促进单核细胞向腹腔迁移，从而使巨噬细胞的得率提高10倍。已有许多研究使用骨髓、脾脏或腹腔来源的巨噬细胞。然而，研究表明，腹腔巨噬细胞在分离后更为成熟，其功能和表型也更加稳定。因此，从小鼠腹腔分离的巨噬细胞是一类重要的细胞群体，可用于多种免疫学和代谢相关研究。分离后的巨噬细胞经不同TLR配体刺激，随后 对基因表达水平进行评估。
引言
网状内皮吞噬系统由骨髓、血液、肝脏和脾脏等不同组织和器官中的细胞组成。巨噬细胞在体内广泛分布，其在控制和清除感染的先天性和适应性免疫应答中发挥重要作用。除了在宿主防御中的作用外，巨噬细胞还在伤口愈合和维持组织稳态中发挥重要作用1,2。此外，巨噬细胞不仅对免疫功能至关重要，还积极参与铁稳态的调节3。在体内，约80%的铁存在于红细胞的血红蛋白中，衰老的红细胞被巨噬细胞吞噬4。这些巨噬细胞每天可循环利用25 mg来源于红细胞的铁，并将其转运至血浆中5。此外，在感染和炎症期间，促炎性巨噬细胞会在全身和局部水平上隔离血清铁，以减少病原体对铁的可利用性6-8。同时，研究显示巨噬细胞和主要是肝细胞产生一种名为铁调素（hepcidin）的抗菌肽，该肽被认为是铁代谢的主要 调控 因子 9,10。铁调素主要由炎症刺激诱导升高，并部分介导慢性炎症状态下巨噬细胞内的铁隔离11-13。 由于巨噬细胞中铁调素的表达机制尚不十分清楚，我们研究了Toll样受体（TLRs）在该调控过程中的可能作用。TLRs 主要存在于 巨噬细胞上，在 其活化过程中发挥核心作用。此外，脂多糖（LPS）诱导肝脏中铁调素的表达依赖于TLR413。因此，为开展本研究，我们采用了一种基于小鼠腹腔巨噬细胞分离的方法。
巨噬细胞系在巨噬细胞研究中被广泛使用；然而长期培养可能导致这些细胞系发生基因丢失和免疫功能下降。因此，从腹腔中分离巨噬细胞至关重要。
小鼠腹腔是获取巨噬细胞的理想部位13-15分离的小鼠腹腔巨噬细胞适用于多种免疫学功能研究。然而，腹腔内的巨噬细胞数量不足以进行大规模研究，其数量估计约为 1 x 106 每只小鼠的巨噬细胞数量。因此，为了提高巨噬细胞产量，在细胞收获前向腹腔注射无菌诱导剂（如巯基乙酸盐）以促进巨噬细胞募集。注射巯基乙酸盐后，每只小鼠获得的巨噬细胞数量可增加10倍。尽管巨噬细胞产量显著提高，但Brewer’s巯基乙酸盐培养基作为一种刺激物可诱导炎症反应，从而招募巨噬细胞，这可能但不一定影响基因表达。因此，每个实验必须设置未经处理的巨噬细胞作为对照组。在我们的实验中，未检测到未经额外处理的巯基乙酸盐诱导型腹腔巨噬细胞中存在炎症高度诱导的铁调素（hepcidin）表达。此外，已有研究表明，Brewer’s巯基乙酸盐可募集大量巨噬细胞，但不会激活这些细胞。16另一方面，经Brewer’s thiogglycollate诱导产生的巨噬细胞表现出溶酶体酶增加，但 杀灭摄入的微生物17然而，与未诱导的巨噬细胞相比，其吞噬能力未受影响16.
在培养皿中培养后，腹腔巨噬细胞会贴壁生长，从而可将其与其他来自腹腔的细胞类型分离。随后，分离得到的巨噬细胞被分别用不同的TLR激动剂刺激。最后提取mRNA 来自培养的 细胞和基因表达采用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行分析。
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方案
所有操作均在蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）机构动物护理委员会批准后，依照加拿大动物护理委员会的指南进行。
1. 小鼠腹腔巨噬细胞的分离、鉴定与培养
- 配制3.8%硫乙醇酸盐培养基。称取38 g硫乙醇酸盐培养基粉末，加入1,000 ml蒸馏水中，加热至沸腾以完全溶解。于121 °C高压灭菌15 min。避光、室温保存，最长可保存3个月。18.
注意：若出现浑浊，表明有细菌污染，应弃用。若保持无菌且避光保存，该溶液可保存长达一年。 - 使用连接23 G针头的1 ml注射器，向每只小鼠腹腔内注射1 ml 3.8% Brewer巯基甘油培养基，注射后等待3天。每只小鼠均需使用新的注射器和针头。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过颈椎脱位实施安乐死。通过检测呼吸频率确认麻醉效果。通常，呼吸急促表明小鼠未达到深度麻醉状态。
- 用70%乙醇擦拭每只小鼠的腹部。使用剪刀沿腹膜底部中线进行侧向切口。
- 用镊子向后牵拉腹部皮肤，以暴露透明的腹膜。使用连接20 G针头的5 ml注射器，向每只小鼠的腹腔内注射5 ml冷DPBS。
- 轻轻按摩腹腔，然后小心抽吸液体，避免刺破任何器官。拔出针头，将腹腔液注入50 ml锥形离心管中。
- 在4°C预冷的离心机中，以400 × g离心10分钟. 整个操作过程中细胞必须保持低温。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数 并调整细胞密度至 1 x 106 cells/ml
- 通过流式细胞术对分离的细胞进行表型鉴定，使用 1 x 106 每只小鼠的细胞数及抗 F4/80 抗体（一种表面抗原） 表达于巨噬细胞上）。
2. 细胞处理
- 分离后立即向每个孔中加入 1 × 106 个细胞。将小鼠腹腔巨噬细胞在 37 °C 条件下培养 1 至 2 小时，使其贴壁。用预热的 PBS 轻柔洗涤 3 次，去除未贴壁的细胞。
- 随后，在含有以下 TLR 配体的无血清 DMEM 培养基（900 µl）中继续培养细胞 24 小时：Pam3CSK4-TLR1/2（0.5 mg/ml）；Poly(I:C)-TLR3（10 mg/ml）；LPS-TLR4（100 ng/ml）；鞭毛蛋白-TLR5（100 ng/ml）；FSL1-TLR6/2（100 ng/ml）；ssRNA40-TLR7（1 µg/ml）；ODN1826-TLR9（1 µM）。
注意：每种配体需预先配制 10 倍浓度的储存液。向每孔加入 100 µl 该储存液，实现 10 倍稀释。
3. RNA 提取
- 移除所有培养基，直接在六孔板中加入1 ml TRIzol裂解细胞，并将细胞裂解液反复通过移液器吹打数次。将匀浆样品在室温下孵育5至10分钟，以确保核蛋白复合物完全解离。
- 将裂解液转移至1.5 ml无RNase和DNase的微量离心管中。每1 ml TRIzol加入0.2 ml氯仿，用手剧烈振荡管子15秒，室温孵育5至10分钟。在4 °C下以12,000 × g离心15分钟。观察到混合物分为下层红色相（苯酚-氯仿相）、中间相和上层无色水相。RNA仅存在于水相中。
- 小心转移上层水相至新的离心管中，避免扰动中间相。加入0.5 ml异丙醇混匀以沉淀RNA。室温孵育10分钟，然后在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。RNA沉淀形成附着于管壁和管底的白色沉淀。
- 弃去上清液。用1 ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀一次。通过涡旋振荡混匀样品，在4 °C下以7,500 × g离心5分钟。短暂干燥RNA（室温晾干约10分钟）。将RNA溶解于0.1 ml DEPC处理水（无RNase的水）中，并在55 °C孵育10分钟。
- 使用分光光度计测定RNA浓度。具体操作为：将样品用DEPC水稀释100倍，在260 nm波长下测定吸光度。RNA浓度计算公式为：OD260 × 40 ng/µl × 稀释倍数。
- 调整RNA浓度一致后，按照逆转录PCR系统第一链cDNA合成试剂盒的说明书合成 cDNA。根据说明书，在实时DNA检测系统中通过实时PCR（45个循环）检测目的基因的mRNA水平。使用两个看家基因（例如β-actin和GAPDH）对基因表达水平进行标准化。
注意：将RNA浓度标准化至500 µg/ml，并使用0.5 µg RNA进行cDNA合成。
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结果
我们首先通过流式细胞术对分离的小鼠腹腔巨噬细胞进行表征。为此，我们使用了F4/80抗体，该抗体可特异性识别仅由巨噬细胞表达的标志物。该表征步骤对于确定所分离巨噬细胞的比例，并将其与分离过程中获得的其他细胞区分开至关重要。如（图1）所示，表达F4/80抗原的细胞比例 consistently 超过95%。接下来，为了研究巨噬细胞中的基因表达，将分离的细胞分别用多种TLR配体处理：Pam3CSK4（TLR1/2）、LPS（TLR4）和FSL1（TLR6/2）。随后，通过RT-PCR检测目的基因Hepcidin（Hamp）的mRNA水平。如（图2）所示，TLR1/2、TLR4和TLR6/2的配体均能够刺激小鼠巨噬细胞中hepcidin mRNA的表达19。综上，这些结果表明本实验方案在成功分离小鼠腹腔巨噬细胞以及精确研究基因表达的分子调控机制方面具有良好的应用价值。
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讨论
巨噬细胞对生存至关重要，并为实现免疫学目标而操纵宿主提供了极具吸引力的靶点。Toll样受体（TLRs）及其他识别分子的发现，使巨噬细胞成为免疫学研究的核心。巨噬细胞可响应多种刺激，包括细胞因子、损伤相关分子模式分子（DAMPs）20以及与病原体群体相关的分子（PAMPs）21。这些不同刺激所引发的反应代表了巨噬细胞活化的进程，通常伴随着基因表达的迅速改变22。
在非炎症状态下，大多数巨噬细胞存在于机体内的战略性位置。它们可分布于所有组织中，并以循环单核细胞的形式存在于血液中。因此，巨噬细胞位于微生物入侵最易感的部位。
宿主防御表现为针对细胞内病原体的炎症反应，与经典活化的巨噬细胞相关。巨噬细胞的经典活化由微生物产物（如脂多糖）在Th1型细胞因子环境中诱导，从而导致促炎性的M1型巨噬细胞极化。炎症的持续存在会引起组织损伤，并促使抗炎机制的建立，而这些机制对宿主的存活至关重要。因此，Th2型细胞因子可诱导抗炎性的M2型巨噬细胞极化，以抑制和调节M1型反应，同时促进组...
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC，资助号 298515-2011）的资助。 AL 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的博士研究生奖学金， MS 得到了加拿大卫生研究院（CIHR，资助号 MOP123246）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6小鼠 | 查尔斯河实验室公司（美国马萨诸塞州威尔明顿） | 475 | |
| 巯基乙酸盐 | Sigma-Aldrich，（美国密苏里州圣路易斯） | 19032-500G | |
| 70% 乙醇 | |||
| 10% 戊巴比妥钠（用于小鼠麻醉（80 mg/kg，腹腔注射）） | |||
| 杜尔贝科’含磷酸盐缓冲液（DPBS），置于冰上，用于收集巨噬细胞 | 加拿大魁北克省 WISENT 公司 | 311-425-CL | |
| RPMI 1640 培养基（添加青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清） | 加拿大魁北克省 WISENT 公司 | 350-000-CL | |
| 1 和 5 毫升注射器 | BD 美国（新泽西州） | 309659 | |
| 6孔板 | 康宁公司（纽约，美国） | MCT-150-C | |
| 细菌脂蛋白 Pam3CSK4（0.5 mg/ml） | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | TLRL-pm25 | |
| 聚肌苷酸–聚胞苷酸（Poly(I:C)）（10 mg/ml） | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | TLRL-PIC | |
| 大肠杆菌 O55:B5 的脂多糖（100 ng/ml） | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | L2880 | |
| 鼠伤寒沙门氏菌纯化鞭毛蛋白（100 ng/ml） | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | TLR-FLIC-10 | |
| 脂蛋白合成 FSL1（100 ng/ml） | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | TLR-FSL | |
| 源自HIV-1长末端重复序列的ssRNA40（1 μg/ml | InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥） | TLR-LRNA-40 | |
| B型CpG寡核苷酸ODN1826（1 μM | InvivoGen（美国圣地亚哥） | 11B16-MM | |
| TRIzol | 英杰公司，（加拿大安大略省伯灵顿） | 15596-026 | |
| 20 G 和 23 G 针头 | BD 美国（新泽西州） | 305175 | |
| 剪刀 | |||
| 镊子 | |||
| 置于冰上的50 ml锥形管 | Sarstedt（美国马萨诸塞州牛顿） | 62.547.205 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich，（美国密苏里州圣路易斯） | R7757-100ML | |
| 冷藏离心机 | |||
| 血细胞计数板 | |||
| F4/80 抗体 | BIO-RAD（加利福尼亚州，美国） | MCA497APC | |
| CD16/CD32 抗体 | Pharmingen，密西沙加，安大略省，加拿大 | 553141 | |
| 流式细胞仪 | 库尔特Epics Elite计数仪，Coulter，（美国佛罗里达州海厄利亚） | ||
| 1.5 ml 离心管 | Axygen Scientific (CA, USA) | 3516 | |
| 氯仿 | Fisher Scientific（安大略省，加拿大） | UN1888 | |
| 异丙醇 | JT Baker（宾夕法尼亚州，美国） | 70566 | |
| 75% 乙醇（溶于DEPC处理水中） | 加拿大商业酒精公司（QC，加拿大） | 17394 | |
| 0.01% 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（静置过夜后高压灭菌） | Sigma-Aldrich，（美国密苏里州圣路易斯） | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR系统 | Qiagen，（加拿大安大略省密西沙加） | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | 蒙特利尔生物技术公司，（加拿大魁北克省柯克兰） | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR 试剂盒 | Qiagen，（加拿大安大略省密西沙加） | 204141 |
参考文献
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