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检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

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DOI：

10.3791/52752

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2015年5月30日

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1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

本文内容

摘要

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。

摘要

除了 Western blot 等既定方法外，目前仍需开发新的方法，以快速、简便地在突触核蛋白病（synucleopathies）的实验模型中定量与疾病相关的 α-突触核蛋白（αSD）。本研究采用了一种转基因小鼠品系（M83），该小鼠过表达人源 A53T 突变型 α-突触核蛋白（αS），并在 8 至 22 月龄期间自发出现显著的临床表型，表现为体重减轻、虚脱及严重运动功能障碍。为对这些小鼠中的 αSD（即疾病相关型 αS）进行分子分析，本研究设计了一种 ELISA 方法，用于特异性定量病鼠体内的 αSD。对该小鼠模型中枢神经系统的分析显示，αSD 主要存在于脑干尾部区域及脊髓中。在不同导致临床疾病的实验条件下，αSD 的分布无明显差异，即在未接种的自然衰老转基因小鼠与接种了病鼠脑组织提取物的小鼠之间，其分布模式一致。i.e.，通过 ELISA 使用抗 Ser129 磷酸化 αS 的抗体特异性检测 αSD 的免疫反应性，其结果与 Western blot 和免疫组织化学所获得的结果基本一致。出乎意料的是，使用多种针对 αS C 末端区域的其他抗体也观察到了类似结果。因此，在该小鼠模型中，可通过 ELISA 方法便捷地监测和定量 αSD 的播散过程，提示其可能涉及“类朊病毒”机制。

引言

目前，在帕金森病（PD）的实验模型中检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）的方法（如免疫组织化学或蛋白质印迹）大多耗时且无法实现定量分析。这种神经退行性疾病的特点是α-突触核蛋白聚集，主要表现为包涵体形式，其中含有通常可溶性的突触前蛋白αS1,2的聚集态（即路易小体和路易神经突）。正常情况下仅有轻微磷酸化的αS，在这些包涵体中其丝氨酸129位点出现过度磷酸化3，可通过特异性靶向Ser129磷酸化αS的抗体进行检测，从而为该病理过程提供一个可靠的标志物。

最近的研究表明，在受累患者的神经系统中，αS 聚集的传播可能涉及一种“类朊病毒”机制4,5。这些研究报道，通过将含有αSD的脑组织提取物接种到表达A53T突变型人源αS蛋白的转基因小鼠模型（M83）中，可加速突触核蛋白病的发展，该模型随年龄增长出现严重的运动功能障碍6。同样地，在相同的M83小鼠模型中接种聚集态的重组αS，也证实可加速αS的聚集过程5。此外，将纤维状重组αS或来自人类DLB患者脑组织的提取物接种至C57Bl/6野生型小鼠后，也观察到磷酸化αS沉积物的形成7,8。Sacino 等9最近指出，在注射纤维状人源αS后，可在M83小鼠中诱导出广泛且进行性的脑内αS包涵体形成，但在E46K转基因小鼠或非转基因小鼠中则未见此现象，后两类小鼠中诱导出的αS包涵体仅为一过性，且主要局限于注射部位。近期在灵长类动物中的研究进一步证实，在更接近人类的物种中接种源自帕金森病（PD）患者的提取物后，αS聚集体可发生传播10。

αS 的改变与帕金森病之间的关联表明，αSD 可能是帕金森病的潜在生物标志物11。最近一项研究表明，基于使用同一抗体进行捕获和检测 αS 的传统夹心法 ELISA，可在人脑脊液（CSF）和血浆中检测到α-突触核蛋白的寡聚可溶性聚集体，该聚集体可作为帕金森病的潜在生物标志物12。基于相同方法，由于组装形式中存在多个表位拷贝，可在包括脑组织在内的生物样本中识别出多聚体蛋白13。最近，通过使用针对 αSD（5G4）的高特异性抗体 ELISA 试剂盒以及免疫沉淀法，在经证实具有路易小体病理特征的患者脑脊液中检测到了病理性的 αS14。这些方法能够区分帕金森病/路易体痴呆（PD/DLB）患者与其他类型的痴呆患者。

使用转基因小鼠模型M83，通过一种专门用于特异性识别αSD15的ELISA方法，进一步研究了αS聚集的“类朊病毒样”传播。在本研究中，我们报告了用于定量检测患病小鼠（无论是否接种了来自患病M83小鼠的αSD）中αSD的详细ELISA实验方案，尤其是针对该M83转基因小鼠模型中病理过程特异性累及的脑区4。

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方案

所有涉及动物的实验程序和方案均符合欧盟指令86/609/EEC，并经法国动物实验伦理审查国家委员会（ComEth）批准（方案编号11-0043）。动物饲养和护理均在里昂ANSES批准的实验设施内进行（批准号B 69387 0801）。

1. 小鼠的准备

  1. 通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠处死小鼠。
  2. 从小鼠颅骨中取出完整脑组织，置于冰上预冷的35 mm塑料培养皿中，待提取。
  3. 分离颈段脊髓。
    注意：αS可从矢状面切开后的一侧脑半球提取，或从实验（见表1所列）完成后已解剖的小鼠脑组织中获取。
实验小鼠
接种物（脑组织当量）		存活期
（感染后天数）		中位数/最长生存期
（天龄）		αSd ELISA检测
/WB/IHC
1未接种小鼠441 ± 166419/7368/8
2接种的小鼠（0.2 mg）150 ± 52140/2419/9

表1. 在M83小鼠上进行的实验列表。 实验2在6周龄时进行，将20 µl病鼠脑匀浆（1% wt/vol，溶于5%葡萄糖）接种至纯合M83小鼠的纹状体皮层区域，接种前使用3%异氟烷吸入麻醉6周龄小鼠。d.p.i.：接种后天数。

2. 从脑半球中提取αS

  1. 将脑组织进行矢状切分，得到两个半脑。将每个半脑放入含有研磨珠的肋裂解管中称重。
  2. 配制高盐（HS）缓冲液，含 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、750 mM NaCl、5 mM EDTA、1 mM DTT 以及 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液。向半脑中加入高盐缓冲液，制成 20%（质量/体积）的匀浆液。
  3. 使用机械匀浆器对半脑样品进行处理，以 6.0 m/s 速度匀浆 23 秒，重复两次。第一次 23 秒匀浆后，将含有匀浆液的管子置于冰上静置 2 分钟，再进行第二次 23 秒匀浆循环。
  4. 将样品以 1,000 ×g 离心 5 分钟，以去除未充分研磨的脑组织碎片。收集上清液，分装为每份 200 µl，于 -80 °C 保存，用于后续 ELISA 分析。

3. 从分离的脑区提取αS

  1. 在冰上的35 mm塑料培养皿中，使用低倍放大镜（8倍放大）和两把镊子进行全脑解剖，除解剖海马体时外，两把镊子的尖端应保持并拢。解剖过程不得超过10分钟，以保持脑组织完整性。将脑组织腹面朝上放置，并按以下顺序分离下列脑区：
    1. 使用镊子夹住其中一个嗅球后方位置，将两个嗅球分开。通过向下移动将其从脑组织上剥离。对另一个嗅球重复此操作。
    2. 用镊子轻轻插入两个皮层之间，并向前移动以促进两个皮层的分离。用一把镊子固定脑组织，另一把镊子将皮层与海马体分开。
    3. 将镊子置于皮层下方2 mm处。保持对镊子的轻柔压力，直至海马体顶部可见。剥离第一部分皮层，随后对第二部分重复此操作。使用镊子从海马体开始，向脑前部方向分离两部分皮层。
    4. 将打开的镊子置于其中一个海马体周围，从海马体底部闭合镊子，然后轻轻取出，尽可能完整回收。对另一侧海马体重复此操作。
    5. 将打开的镊子置于其中一个纹状体下方，轻轻将其与脑组织分离。用镊子清除纹状体上残留的任何皮层组织。对第二个纹状体重复此操作。
    6. 用镊子轻轻下压小脑轮廓约2毫米，以利于将小脑与脑组织分离。将镊子置于小脑后方，向前移动镊子以移除小脑。
    7. 用镊子的宽部抬起中脑，以便清楚地看到其与脑干的连接处。在连接处做一垂直切口，然后移除脑干。
    8. 用镊子置于中脑后方，中脑由四个圆形结构组成。垂直剪切，直至中脑完全与脑的其余部分分离。
  2. 根据可获得的组织量，用 HS 缓冲液制备不同百分比（质量/体积）的匀浆， 即， 组织重量在10至30 mg之间制备5%匀浆，30至80 mg之间制备10%匀浆，超过80 mg则制备20%匀浆。
    1. 向分离的脑区加入适量的HS缓冲液，以获得预期浓度的匀浆。
    2. 涡旋并检查组织是否完全浸没在HS缓冲液中。
    3. 使用由硼硅酸盐玻璃管和两个研杵（A 和 B）组成的组织研磨器，对从脑区或颈段脊髓分离制备的样品进行匀浆处理。
    4. 将待破碎的每个脑区直接倒入管中。插入研杵A并抽出，重复该操作约10次以解离组织。随后使用研杵B继续研磨组织，再进行约20次操作。用1 ml移液器将匀浆液转移至1.5 ml离心管中。
  3. 在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，以去除未破碎的脑组织碎片。收集上清液，分装为每管200 µl，于-80 °C保存，用于后续ELISA分析。

4. 通过 ELISA 检测 αS

  1. 将包被抗体稀释至 0.01 ng/ml。使用抗-αS 兔多克隆抗体或单克隆抗体 clone 42，溶于 50 mM Na2CO3/NaHCO3 缓冲液（pH 9.6）中。
  2. 每孔加入 100 µl 上述包被液，于 4 °C 过夜孵育。在使用检测抗体 syn514、clone 42、LB509、AS11、4D6 或 8A5 的 ELISA 实验中，包被液应使用抗-αS 兔多克隆抗体。当与抗-pSer129 αS 检测抗体联用时，包被液应使用抗-αS 单克隆抗体 clone 42。
    注意：如有需要，包被后的酶标板可在 4 °C 保存一周后再进行 ELISA 检测。
  3. 使用酶标板洗板机，每孔加入 300 µl 含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST），洗涤 5 次。自此步骤起，所有孵育均在室温下进行。
  4. 每孔加入 200 µl T20 PBS 封闭缓冲液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。
  5. 将脑组织匀浆液用含 1% BSA 的 PBST 缓冲液稀释（20% 匀浆液稀释 1:100，10% 匀浆液稀释 1:50，5% 匀浆液稀释 1:25），每孔加入 100 µl。于 150 rpm 振荡孵育 2 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。
  6. 将不同的 αS 检测抗体按材料列表中所述稀释比例溶于含 1% BSA 的 PBST 缓冲液中，每孔加入相应抗体溶液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。
  7. 根据检测抗体种属来源，选择抗小鼠或抗兔 IgG-HRP 二抗，用含 1% BSA 的 PBST 缓冲液按 1:8,000 稀释，每孔加入适量，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。
  8. 每孔加入 100 µl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液，于 150 rpm 振荡避光孵育 15 分钟。
  9. 每孔加入 100 µl 1 N HCl 终止反应，随后使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。
  10. 数据分析时，以不含任何小鼠脑组织样本的孔（空白孔）所测得的 OD 值为基准，从各待测样本的 OD 值中减去该空白值，进行校正。

5. 表位作图

  1. 根据 Osman 所述方法进行表位作图16。简言之，将包含 12 个氨基酸的人源 α-突触核蛋白序列的肽段点样于硝酸纤维素膜上，相邻肽段之间重叠 10 个氨基酸。
  2. 用含 0.05% Tween 20 和 5% 脱脂奶粉的 50 mM Tris/150 mM NaCl 缓冲液（pH 10）封闭膜。将抗体以每毫升 2 µg 的浓度溶于封闭液中，在 2–10 °C 下孵育过夜。
  3. 使用含 0.05% Tween 20 的 50 mM Tris/150 mM NaCl 缓冲液（pH 10）洗涤膜三次。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体进行孵育。再用相同缓冲液洗涤五次，随后使用 Western blot TMB 显色试剂盒进行染色。

6. 统计分析

  1. 使用 R 软件及 nlme 包进行混合效应回归分析，以建模光密度（OD）。针对每次比较，构建一个混合效应回归模型。采用固定效应来区分有症状组与无症状组。
  2. 采用随机效应以反映同一只小鼠重复测量间的变异性。通过检查残差来验证同方差性；如有需要，参照 Pinheiro 和 Bates17 的方法，使用方差函数对组内误差的方差结构进行建模。将显著性阈值 P 设定为 0.05。

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结果

在本研究中，ELISA 特异性地检测了来自发病 M83 小鼠脑组织匀浆液中的疾病相关性 αS（αSD），该匀浆液使用高盐缓冲液制备。利用一种特异性识别 pSer129 αS 的抗体（p = 0.0074），ELISA 能够清晰区分年老发病小鼠（> 8 月龄）与年轻健康 M83 小鼠（2–5 月龄）（图 1）。其他几种抗体也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号值（> 0.6 OD）。这些抗体包括针对蛋白 C 末端不同序列区域（分别为 124–134、115–122 和 129–140）的 4D6（p = 0.01）、LB509（p = 0.0047）和 8A5（p < 0.001），以及针对蛋白 N 末端（2–12）区域的 syn514，后者信号升高程度相对较小（p = 0.0003）。此外，我们实验室通过用缺失 α-syn 基因座的 C57BL/6S（B6 αS-null）19 小鼠免疫人纤维状重组 αS18 所制备的 AS11 单克隆抗体，也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号（p < 0.01）。目...

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讨论

在 M83 转基因小鼠模型的疾病过程中，通过 ELISA 方法可直接从鼠脑匀浆中特异性检测 αSD。事实上，该 ELISA 方法仅使用高盐缓冲液中的全脑匀浆，即可轻松区分患病 M83 小鼠与健康 M83 小鼠。

使用该ELISA方法获得成功结果的最关键步骤包括：通过培养必要的手动技巧来准确解剖小鼠脑部的不同区域，以防止在解剖过程中造成组织损伤；仅使用HS缓冲液进行样本稀释；以及抗体的选择，因为并非所有抗体都适用于ELISA实验体系。

尽管如此，不同小鼠之间的αSD水平仍表现出一定变异性。这些结果相当于通过抗Ser129磷酸化αS15抗体检测去污剂不溶性组分时，在患病M83小鼠中观察到的典型αSD条带的Western印迹检测结果。这表明ELISA免疫反应性对应于αSD的特异性检测。

与先前的蛋白质印迹分析结果一致15该ELISA在解剖病理性M8...

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

作者感谢 Damien Gaillard 在动物实验接种及后续工作中的协助。本研究由 ANSES（法国食品、环境与职业健康安全局）资助。 & 安全）以及法国帕金森基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB509Abcamab27766检测抗体 1/2,000
AS11Anses 实验室制备检测抗体 1/1,000
4D6Abcamab1903检测抗体 1/2,000
PSer129Abcamab59264检测抗体 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253检测抗体 1/1,000
syn514Abcamab24717检测抗体 1/500
克隆 42BD Biosciences610787包被抗体与检测抗体（1/2,000）
8A5Anderson 博士提供检测抗体 1/2,000
多克隆抗-α突触核蛋白抗体MilliporeAB5038P包被抗体
抗小鼠 IgG HRP 偶联物Southern Biotech1010-05
抗兔 IgG HRP 偶联物Southern Biotech4010-05
山羊抗小鼠 IgG HRP 偶联物Dianova115-035-164
HS 缓冲液调节至 pH 7.5，并于 4 °C 保存
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBS调节至 pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815100 mM 储存液，有毒
1% 磷酸酶抑制剂混合物Pierce78428
1% 蛋白酶抑制剂混合物Roche04 693 132 00150 倍浓缩
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
碳酸盐缓冲液 50 mM，pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L，pH 9.6
Superblock T20 PBS 封闭缓冲液PierceE6423H10 倍浓缩
TMBSigmaT0440用于 ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302用于表位定位
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120此步骤需保持在冰上
研磨管Biorad355-1197
洗板机TecanColumbus Pro
酶标仪BioradModel 680
低倍放大镜 VWR630-10628 倍放大
镊子 Dumont#7WPI14097用于解剖步骤
1 ml 移液吸头 SamsoSamso043231
1.5 ml 离心管Dutscher033290

参考文献

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ELISA Western Ser129

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