检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

摘要

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αS^D）。

摘要

除了 Western blot 等既定方法外，目前仍需开发新的方法，以快速、简便地在突触核蛋白病（synucleopathies）的实验模型中定量与疾病相关的 α-突触核蛋白（αS^D）。本研究采用了一种转基因小鼠品系（M83），该小鼠过表达人源 A53T 突变型 α-突触核蛋白（αS），并在 8 至 22 月龄期间自发出现显著的临床表型，表现为体重减轻、虚脱及严重运动功能障碍。为对这些小鼠中的 αS^D（即疾病相关型 αS）进行分子分析，本研究设计了一种 ELISA 方法，用于特异性定量病鼠体内的 αS^D。对该小鼠模型中枢神经系统的分析显示，αS^D 主要存在于脑干尾部区域及脊髓中。在不同导致临床疾病的实验条件下，αS^D 的分布无明显差异，即在未接种的自然衰老转基因小鼠与接种了病鼠脑组织提取物的小鼠之间，其分布模式一致。i.e.，通过 ELISA 使用抗 Ser129 磷酸化 αS 的抗体特异性检测 αS^D 的免疫反应性，其结果与 Western blot 和免疫组织化学所获得的结果基本一致。出乎意料的是，使用多种针对 αS C 末端区域的其他抗体也观察到了类似结果。因此，在该小鼠模型中，可通过 ELISA 方法便捷地监测和定量 αS^D 的播散过程，提示其可能涉及“类朊病毒”机制。

引言

目前，在帕金森病（PD）的实验模型中检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αS^D）的方法（如免疫组织化学或蛋白质印迹）大多耗时且无法实现定量分析。这种神经退行性疾病的特点是α-突触核蛋白聚集，主要表现为包涵体形式，其中含有通常可溶性的突触前蛋白αS^1,2的聚集态（即路易小体和路易神经突）。正常情况下仅有轻微磷酸化的αS，在这些包涵体中其丝氨酸129位点出现过度磷酸化³，可通过特异性靶向Ser129磷酸化αS的抗体进行检测，从而为该病理过程提供一个可靠的标志物。

最近的研究表明，在受累患者的神经系统中，αS 聚集的传播可能涉及一种“类朊病毒”机制^4,5。这些研究报道，通过将含有αS^D的脑组织提取物接种到表达A53T突变型人源αS蛋白的转基因小鼠模型（M83）中，可加速突触核蛋白病的发展，该模型随年龄增长出现严重的运动功能障碍⁶。同样地，在相同的M83小鼠模型中接种聚集态的重组αS，也证实可加速αS的聚集过程⁵。此外，将纤维状重组αS或来自人类DLB患者脑组织的提取物接种至C57Bl/6野生型小鼠后，也观察到磷酸化αS沉积物的形成^7,8。Sacino 等⁹最近指出，在注射纤维状人源αS后，可在M83小鼠中诱导出广泛且进行性的脑内αS包涵体形成，但在E46K转基因小鼠或非转基....

方案

所有涉及动物的实验程序和方案均符合欧盟指令86/609/EEC，并经法国动物实验伦理审查国家委员会（ComEth）批准（方案编号11-0043）。动物饲养和护理均在里昂ANSES批准的实验设施内进行（批准号B 69387 0801）。

1. 小鼠的准备

1. 通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠处死小鼠。
2. 从小鼠颅骨中取出完整脑组织，置于冰上预冷的35 mm塑料培养皿中，待提取。
3. 分离颈段脊髓。
   注意：αS可从矢状面切开后的一侧脑半球提取，或从实验（见表1所列）完成后已解剖的小鼠脑组织中获取。

实验

小鼠 接种物（脑组织当量）

存活期 （感染后天数）

中位数/最长生存期 （天龄）

结果

在本研究中，ELISA 特异性地检测了来自发病 M83 小鼠脑组织匀浆液中的疾病相关性 αS（αS^D），该匀浆液使用高盐缓冲液制备。利用一种特异性识别 pSer129 αS 的抗体（p = 0.0074），ELISA 能够清晰区分年老发病小鼠（> 8 月龄）与年轻健康 M83 小鼠（2–5 月龄）（图 1）。其他几种抗体也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号值（> 0.6 OD）。这些抗体包括针对蛋白 C 末端不同序列区域（分别为 124–134、115–122 和 129–140）的 4D6（p = 0.01）、LB509（p = 0.0047）和 8A5（p < 0.001），以及针对蛋白 N 末端（2–12）区域的 syn514，后者信号升高程度相对较小（p = 0.0003）。此外，我们实验室通过用缺失 α-syn 基因座的 C57BL/6S（B6 αS-null）¹⁹ 小鼠免疫人纤维状重组 αS¹⁸ 所制备的 AS11 单克隆抗体，也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号（p < 0.01）。目.......

讨论

在 M83 转基因小鼠模型的疾病过程中，通过 ELISA 方法可直接从鼠脑匀浆中特异性检测 αS^D。事实上，该 ELISA 方法仅使用高盐缓冲液中的全脑匀浆，即可轻松区分患病 M83 小鼠与健康 M83 小鼠。

使用该ELISA方法获得成功结果的最关键步骤包括：通过培养必要的手动技巧来准确解剖小鼠脑部的不同区域，以防止在解剖过程中造成组织损伤；仅使用HS缓冲液进行样本稀释；以及抗体的选择，因为并非所有抗体都适用于ELISA实验体系。

尽管如此，不同小鼠之间的αS^D水平仍表现出一定变异性。这些结果相当于通过抗Ser129磷酸化αS¹⁵抗体检测去污剂不溶性组分时，在患病M83小鼠中观察到的典型αS^D条带的Western印迹检测结果。这表明ELISA免疫反应性对应于αS^D的特异性检测。

与先前的蛋白质印迹分析结果一致¹⁵该ELISA在解剖病理性M8.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB509	Abcam	ab27766	检测抗体 1/2,000
AS11	Anses 实验室制备		检测抗体 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	检测抗体 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	检测抗体 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	检测抗体 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	检测抗体 1/500
克隆 42	BD Biosciences	610787	包被抗体与检测抗体（1/2,000）
8A5	Anderson 博士提供		检测抗体 1/2,000
多克隆抗-α突触核蛋白抗体	Millipore	AB5038P	包被抗体
抗小鼠 IgG HRP 偶联物	Southern Biotech	1010-05
抗兔 IgG HRP 偶联物	Southern Biotech	4010-05
山羊抗小鼠 IgG HRP 偶联物	Dianova	115-035-164
HS 缓冲液			调节至 pH 7.5，并于 4 °C 保存
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			调节至 pH 7.5
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	100 mM 储存液，有毒
1% 磷酸酶抑制剂混合物	Pierce	78428
1% 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	04 693 132 001	50 倍浓缩
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
碳酸盐缓冲液 50 mM，pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L，pH 9.6
Superblock T20 PBS 封闭缓冲液	Pierce	E6423H	10 倍浓缩
TMB	Sigma	T0440	用于 ELISA
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	用于表位定位
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	此步骤需保持在冰上
研磨管	Biorad	355-1197
洗板机	Tecan	Columbus Pro
酶标仪	Biorad	Model 680
低倍放大镜	VWR	630-1062	8 倍放大
镊子 Dumont#7	WPI	14097	用于解剖步骤
1 ml 移液吸头 Samso	Samso	043231
1.5 ml 离心管	Dutscher	033290