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基于96孔板的可扩展iPSC培养与生产及机器人液体处理系统应用

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DOI：

10.3791/52755

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2015年5月14日

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1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

本文内容

摘要

所述方案可使实验室利用可编程液体处理机器人和96孔板，以较低的劳动力、经验及设备投入成本，实现可扩展的、贴壁培养的干细胞高通量培养。在此系统中传代超过20次的诱导多能干细胞（iPSCs）仍维持了多能性、正常的核型，并可分化为心肌细胞。

摘要

多能干细胞培养技术的持续进步正在缩小这些细胞在再生医学、药物发现和安全性测试中从实验室到临床应用之间的差距。为了生产用于组织工程和移植的干细胞衍生生物制药产品和细胞，一种低成本的细胞制造技术至关重要。在下游应用中维持细胞的多能性及其稳定性能例如细胞分化）随时间的变化对于大规模细胞生产至关重要。然而，这一目标往往难以实现，尤其是在手动培养细胞时，操作者可能引入显著的实验变异，且扩大培养规模的成本可能极为高昂。为实现高通量、大规模的干细胞生产并消除操作者带来的影响，研究人员开发了基于台式多通道液体处理机器人的新型干细胞培养方案，该方案仅需极少的技术人员参与或经验。利用该方案，可在无饲养层条件下直接从冻存细胞开始培养人诱导多能干细胞（iPSCs），并在96孔板中进行维持培养。根据细胞系种类及期望的扩增速率，操作者可依据一系列展示最佳克隆密度的图像，轻松判断传代时机。随后可准备相应试剂，直接将克隆分割转移至新培养板，无需离心步骤。经过20次传代（约3个月）后，两个iPSC系仍保持稳定的核型，表达干细胞标志物，并能高效分化为心肌细胞。该系统还可进一步用于针对96孔板设计的新分化方案或基因操作的高通量筛选。该技术将显著降低生产大量一致性干细胞所需的人力与技术负担，适用于多种应用场景。

引言

自2007年首次成功获得人类诱导性多能干细胞（iPSCs）以来，其在化合物测试、再生医学和疾病建模中的应用已显著增加12–6。这一需求源于iPSC能够大量产生具有多能性的细胞，并可前所未有地分化为体细胞。随着定向分化技术的不断改进7–10，以及人类细胞或组织建模和细胞治疗的发展日益推进11–14，对高质量iPSC的大规模生产需求也随之增长。普遍认为，在包括心肌梗死治疗或β细胞功能替代等在内的多种疾病治疗中，将需要数亿至数十亿个由iPSC分化而来的体细胞15–18。此外，日益复杂的三维组织模型在药物发现与治疗中的应用也将需要大量细胞9,13,19。在所有这些应用中，必须能够稳定获得定义明确、均一且可重复的iPSC，并且其制备过程应简便可行。

为了生产用于组织工程和移植的干细胞来源生物制药产品和细胞，必须具备一种具有成本效益的细胞制造技术。目前，诱导多能干细胞（iPSC）的规模化生产主要集中在悬浮培养20–25或结合微载体基质的悬浮培养26–28，部分原因是这些技术已成功应用于大规模、非iPSC的真核细胞生产体系。多个研究团队已证明可利用悬浮培养系统获得多能干细胞20,21,23,24,29。然而，这些方法依赖昂贵且复杂的系统，而这些系统对于正在开发新型分化方案、推动组织工程研究或进行实验室规模研究的研究人员而言往往难以获得。此外，悬浮培养和微载体iPSC培养需要特定的适应过程、技术或化学试剂，而这些在传统的贴壁iPSC培养中并不存在，例如需持续使用Rho激酶抑制剂、消泡剂以及过滤手段来调控细胞聚集体的形成。在悬浮培养中，细胞所受的物理应力更为显著，主要来源于机械搅拌以及微载体之间的碰撞。这些问题限制了新建立的干细胞系在悬浮培养中扩增的可预测性和速度。另有研究者开发了模仿培养板操作技术的机器人化微孔板处理系统30,31，但这些平台不仅需要在设备和操作技术方面进行大量投入，还面临干细胞培养本身固有的诸多挑战。

以下工作描述了一种可扩展的iPSC培养系统的开发与实践，该系统利用一套自成一体的标准8通道机器人液体处理系统和96孔板。该方法旨在衔接实验室规模的iPSC培养与高通量iPSC生产例如, 107 – 1.5 × 109 每周每位技术人员可处理的细胞数量）使开发新型iPSC技术的研究人员能够轻松扩大生产规模，而无需大量硬件或人力投入。该方法建立成本相对较低，几乎不需要干细胞培养、编程或工程经验，所需设备占地空间小，无需专用的细胞培养操作台，并利用标准的细胞培养设备实现中高通量的自动化细胞生产。本研究旨在开发一种可扩展的干细胞培养系统，适用于初次开展干细胞培养的实验室、认为手动培养阻碍其研究思路发展的科研人员，或希望以经济方式大量生产干细胞的研究者。本文所展示的平台消除了技术人员对干细胞培养过程的主观影响，标准化了换液和传代操作，从而实现稳定一致的干细胞生产。

方案

机器人液体处理系统（在以下方案中为Gilson公司的pipetmaX）可在96孔板格式中维持传统的贴壁培养条件，同时实现干细胞培养与生产的自动化和可扩展性。与传统的6孔板培养类似，诱导多能干细胞（iPSCs）在此方案中以单层形式生长为独立的克隆集落，但采用的是96孔板格式。每个孔可以是同基因型或不同基因型，且由于机器人能够将各孔分隔开来，因此两种配置均可并行培养。典型的机器人iPSC培养流程包括两个阶段：喂养程序，即按照可自定义的时间表对细胞进行换液；传代程序，由用户选择解离方法和分种比例，从而控制接种密度和扩增速率。以下方案详细描述了如何启动新的培养、如何完成喂养与传代操作，以及支持iPSC培养的辅助程序。

注意：有关以下方案已验证的基质包被材料和解离试剂的具体建议，请参见材料列表。

1. 准备包被细胞外基质凝胶的96孔板

  1. 从六个新的室温 96 孔板中移除包装，并将其放置在液体处理机器人工作台的 2、3、5、7、8、9 号位置（参见 图 1A 以了解工作台位置）。
  2. 将一个预冷的、4 °C 的 4 孔槽放置在工作台 6 号位置。
  3. 在工作台 1 号位置的吸头架第 12 列中装入预冷的、4 °C 的 200 µl 吸头。
  4. 使用无菌操作技术，倾倒一份 aliquot 将 25 ml 4 °C 的 DMEM/F12 加入工作台 6 号位置中最左侧的第一个槽孔中。或者，可使用移液器完成转移。
  5. 取下 96 孔板盖，并将每个板盖滑入专门设计的板盖支架（PLHR，参见 图 1A）。避免接触板盖内部。
    注意：接触板盖内部，或将多个板盖堆叠导致一个板盖内面接触另一个板盖外表面，极易造成污染。
  6. 使用机器人控制触摸屏，按下以下系列按钮以启动孔板预润洗过程：
    1. 点击“运行程序”。
    2. 选择“细胞外基质凝胶预润洗”，然后点击下一步。
    3. 用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。
      注意：机器人不会实际运行，而是软件对协议进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行程序”。
  7. 在预润洗过程（步骤 1.6）进行期间，继续执行步骤 1.8。
  8. 将一份储存在 -80 °C 的 50 ml 锥形管中的 4 mg 生长因子减少型细胞外基质凝胶（GFRM）在冰上解冻。保持该 aliquot 在冰上，直至准备使用。
    注意：若让 GFRM 升至室温，其将凝固并无法使用。
  9. 使用 25 ml 玻璃移液管将 4 mg GFRM aliquot 重悬于 24 ml 4 °C 的 DMEM/F12 中。在转移 DMEM/F12 时，暂停 2–3 秒，使移液管冷却后再重悬 GFRM aliquot。
  10. 当预润洗过程（步骤 1.6）完成后，继续执行步骤 1.11。
  11. 将 24 ml DMEM/F12 与 GFRM 的混合液转移至工作台 6 号位置槽孔的第四个孔中。
  12. 使用机器人控制触摸屏，按下以下系列按钮以启动细胞外基质凝胶包被过程：
    1. 点击“运行程序”。
    2. 选择“细胞外基质凝胶 aliquot”，然后点击下一步。
    3. 用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。
      注意：机器人不会实际运行，而是软件对协议进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行程序”。
  13. 当步骤 1.12 完成后，重新盖上孔板盖。
  14. 将包被了细胞外基质凝胶的 96 孔板转移至 37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中，孵育 24 小时，之后孔板即可使用或储存。
    注意：在特殊情况下，新包被的细胞外基质凝胶孔板可在孵育 15–30 分钟后使用，但推荐孵育过夜至 24 小时。
  15. 重复操作步骤 1.1、1.3、1.5–1.6、1.10 以及 1.12–1.14，直至所有含 GFRM 的 DMEM/F12 用完为止。

2. 储存包被有细胞外基质凝胶的96孔板

  1. 从37 °C、5% CO2、湿润培养箱中取出包被有细胞外基质凝胶的96孔板。
  2. 可选：在进行步骤2.3之前，让包被有细胞外基质凝胶的96孔板恢复至室温（RT）。
    注意：此可选步骤可减少将板置于4 °C时产生的冷凝水。
  3. 将板放置在液体处理机器人工作台的2、3、5、7、8、9号位置（参见图1A中的工作台位置）。
  4. 在1号位的吸头架第12列中装入室温 200 µl 吸头。
  5. 在6号位的工作台上放置一个四槽储液槽。
  6. 用室温DMEM/F12培养基填充储液槽的第4孔（最右侧孔）。
  7. 取下96孔板盖，将每块板滑入PLHR中。
  8. 使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：
    1. 点击“运行程序”。
    2. 选择“细胞外基质凝胶分装”，然后点击下一步。
    3. 用户决定：点击“测试运行”，以使用分步向导预测试所选程序。
      注意：机器人不会实际运行，而是软件对程序进行检测以发现潜在的软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行程序”。
  9. 程序完成后，重新盖上板盖，并将板从机器工作台上取下。
  10. 用一条1英寸×6英寸的石蜡膜条，围绕每块包被有细胞外基质凝胶的96孔板的整个侧面（即板盖与板体接合处）缠绕一圈。务必拉紧石蜡膜，以形成气密性密封。
  11. 可选：在板上标记完成细胞外基质凝胶包被的日期、细胞外基质凝胶批号、使用者姓名及其他相关信息。
  12. 将板储存在4 °C，可在此条件下保存并使用长达两周。
    注意：已有成功使用超过两周的案例，但不推荐。

3. 在96孔板中从活细胞或冻存细胞培养物进行干细胞克隆接种密度梯度实验：如何启动或恢复干细胞系的正常传代间隔

  1. 若起始材料为冻存细胞，继续进行步骤 3.2；若起始材料为已接种于培养板中的活体干细胞培养物，请从步骤 3.5 开始。
  2. 将冻存管置于 37 °C 水浴中轻轻摇晃，直至仅剩少量冰块未融化，完成细胞解冻。
  3. 可选：将解冻后的细胞用 10 ml 室温干细胞生长培养基（SCGM）稀释，以 300 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，并将干细胞沉淀重悬于 7 ml 含 10 µM Y27632 的新鲜 SCGM 中。
    注：此步骤可去除残留的冻存保护液。
  4. 继续进行步骤 3.6。
  5. 若起始材料为已接种的活体干细胞：使用酶法或非酶法解离细胞，按常规方法传代。尽量收获总计 1.5–3 百万个细胞（通常为六孔板中的一个孔）。将收获的细胞以 300 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，并将干细胞沉淀重悬于 7 ml 含 10 µM Y27632 的新鲜 SCGM 中。继续进行步骤 3.6。
  6. 确保来自冻存或活体培养的细胞均已被重悬于含 10 μM Y27632 的 7 ml 室温 SCGM 中。
  7. 在一号床位置的移液枪头架第 12 列中装入室温 200 µl 枪头。
  8. 在二号床位置放置一个四槽储液槽。
  9. 在五号床位置放置一个预先加热至 37 °C 的、涂有细胞外基质凝胶的新 96 孔板，并取下盖子，将其放入 PLHR 中。
  10. 通过移液或无菌倾倒方式，将 7 ml 重悬细胞液转移至储液槽的第 3 孔中。
    1. 使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：
    2. 点击“运行程序”（Run a Protocol）。
    3. 选择“接种密度梯度”（Seeding Density Gradient），然后点击下一步。
    4. 用户决策：点击“测试运行”（test run）以使用分步向导预测试所选程序。
      注：机器人不会实际运行，软件将检测所选程序是否存在软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”（skip setup）亦可接受。
  11. 点击“运行程序”（Run Protocol）。
  12. 当稀释程序完成后，重新盖上培养板盖子，并将其置于 37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中，等待下一次换液。
  13. 可选：在培养板上标记日期、品系信息、使用者姓名、培养基类型及其他相关信息。
  14. 在接下来的几天中，根据需要按照下方协议 4 对 96 孔板进行换液。
    注：典型的干细胞培养板需每 24 小时进行一次完全换液；用于换液的 SCGM 中不含有 Y27632，Y27632 仅在传代后初次接种时使用。换液前应检查培养板是否存在污染及克隆密度。有关克隆密度监测的更多说明，请参见步骤 3.16。
  15. 在接下来的几天中，培养板中央附近的若干列（通常为第 5–8 列）将接近理想的传代密度；为确定该密度，请结合以下信息，将 96 孔板与图 3B所示的密度范围进行比较：
    1. 当大多数克隆之间的间隙约为相邻克隆直径的 25% 时，进行传代。
      注：确定传代时机的依据是，若再经历一次喂养和生长周期，克隆将发生接触，应避免此情况。
  16. 为启动均匀稀释的培养板并进入常规培养，请选择一个达到理想密度的列进行传代。参见协议 5 进行传代操作。

4. 喂养96孔板中的干细胞克隆

注意：以下方案描述了对一个96孔干细胞克隆板的喂养操作。该技术可扩展至同时处理总共6个板。

  1. 从 37 °C、5% CO2、湿度控制的培养箱中取出 96 孔干细胞克隆板。
  2. 检查培养板是否存在污染及细胞密度。为进行换液，需确保克隆密度低于理想的传代密度。有关密度的信息，请参见 图 3B。
    注意：污染可能表现为培养基浑浊，并伴有难闻气味。在显微镜下检查时，也可能观察到微小且明显非 iPSC 的细胞团块。有关细胞密度的评估，请参见上述步骤 3.16.1。
  3. 将 96 孔干细胞克隆板放置于床位置 3 的倾斜 37 °C 斜坡上。
  4. 在床位置 1 的吸头架第 12 列中装入室温（RT）200 µl 移液吸头。
  5. 在床位置 2 放置一个 4 孔槽试剂槽。
  6. 通过无菌倾倒或移液转移，将 8 ml 新鲜的室温（RT）不含 Y27632 的 SCGM 加入床位置 2 的试剂槽第 3 孔中。
  7. 取下 96 孔干细胞克隆板的盖子，并将其放入 PLHR 中。
  8. 使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：
    1. 点击“运行程序”。
    2. 选择“克隆换液单板程序”，然后点击下一步。
    3. 用户决定：点击“测试运行”，以使用分步向导预测试所选程序。
      ​注意，机器人不会实际运行，软件仅检测程序是否存在软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行程序”。
  9. 当换液程序完成后，重新盖上 96 孔干细胞克隆板的盖子，并放回 37 °C、5% CO2、湿度控制的培养箱中，直至下次换液或传代。通常在 24 小时后需要进行下一步操作。
    注意：建议在培养板盖子上记录换液事件，包括日期、培养基类型、操作者姓名及其他相关信息。

5. 96孔板干细胞克隆的传代

  1. 经过数个培养周期后，96孔干细胞克隆板将准备进行传代。本方案描述将一列细胞传代至一个完整的96孔板，相当于1:12的传代比例。用户可根据需要自定义传代比例，并选择任意数量的孔或列进行传代，包括非相邻的孔位。
  2. 将96孔干细胞克隆板的密度进行比较 图3B 以确定是否进行传代。理想的传代密度为：大部分菌落之间的间距约为相邻菌落直径的25%，或继续培养将导致菌落相互融合生长。
  3. 在显微镜下检查96孔干细胞克隆板，确保无污染。
  4. 将96孔干细胞克隆板放置在斜置的37 °C斜坡上第3号床位置。
  5. 在1号床位置的吸头装载架上，将第8至12列装载200 µl常温吸头。
  6. 将一个4孔槽置于2号床位置。
  7. 1号孔保持空置，2号孔加入8.5 ml SCGM + 10 µM Y27632，3号孔加入3.5 ml 30% 蛋白水解和胶原水解解离试剂（或EDTA为基础的解离试剂），4号孔加入4.5 ml PBS。
    注意：所有试剂可使用室温或37 °C的溶液。本研究所述的脂肪组织和成纤维细胞来源的iPSC培养使用了以PBS稀释至30%的室温蛋白水解和胶原水解解离试剂。
  8. 将一个预先在37 °C温育的新细胞外基质凝胶包被的96孔板放置于5号位置。
  9. 移除96孔干细胞集落培养板的盖子和新的96孔板盖子，并将两者均放入PLHR中。
  10. 使用机器人控制触摸板，按下以下按钮组合：
    1. 点击“运行实验方案”。
    2. 选择“Colony Split 1:12 Column 1”，然后点击下一步。
    3. 用户决策：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。
      注意：机器人不实际运行，而是由软件对方案进行软件问题测试。对于已建立的方案，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行方案”。
  11. 待传代操作步骤完成后，重新盖好两块培养板的盖子。
  12. 可选：在新培养板上标注所需信息（即日期、细胞系、传代次数、培养基类型、用户名 等等。).
  13. 将两块培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2，置于加湿培养箱中，直至下次换液或传代。注意：通常在24小时后进行下一次换液。
    注意：细胞和克隆在传代后 2–3 小时内应贴附于培养板上，并呈现明显的铺展状态。这是由于存在 Rho 激酶抑制剂，随后细胞将收缩并表现出特征性的干细胞形态（即， 首次无Rho激酶抑制剂培养后，形成鹅卵石样紧密集落，细胞体积与细胞核大小之比较小。

6. 收获96孔板干细胞用于生产

注意：干细胞集落可在培养期间的任意时间点收获并使用。通常在细胞准备传代时进行（参见方案5）。本方案描述了如何从一块96孔干细胞集落板中收获十一列细胞。

  1. 在显微镜下检查96孔干细胞克隆板，确保无污染。
  2. 将96孔干细胞克隆板放置在3号床位置的倾斜37 °C斜坡上。
  3. 在1号床位置的吸头装载架中，装入第11列和第12列的RT 200 µl移液吸头。
  4. 在2号床位置放置一个4孔槽。
  5. 第1孔槽留空，第2孔槽中加入8.5 ml SCGM，第3孔槽中加入3.5 ml 30%蛋白水解和胶原水解解离试剂（或EDTA基解离试剂），第4孔槽中加入4.5 ml PBS。
    注意：所有试剂可置于室温或37 °C。
  6. 取下96孔干细胞克隆板的盖子，并将其放入PLHR中。
  7. 使用机器人控制触摸面板，按下以下按钮组合：
    1. 点击“运行程序”。
    2. 选择“克隆收获第2-12列”，然后点击下一步。
    3. 用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导预测试所选程序。
      注意：机器人不会实际运行，而是软件对所选程序进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。
    4. 点击“运行程序”。
      注意：一旦收集程序完成，细胞将位于第2孔槽中，可进行收集。

结果

基于培养板的机器人干细胞培养平台的开发。

由于诱导多能干细胞（iPSCs）在药物开发和再生医学中的广泛应用，其需求日益增长。然而，目前可放大的生产方法主要集中于悬浮培养32，该方法依赖相对复杂的设备，使许多研究人员难以参与，且偏离了已建立的贴壁培养技术。我们并未彻底改变已被证实的基于培养板的干细胞培养方法（例如转向悬浮培养或使用微载体），而是致力于对现有的贴壁iPSC培养技术进行微型化和自动化。首要目标是实现换液和传代的自动化，以标准化整个培养流程。同时，还需要一个能够利用现有技术快速放大的平台。为实现这些目标，我们设计了一种在96孔板中培养干细胞的方法，并结合自动液体处理系统（图1）。本研究所开发的、由液体处理机器人执行的换液与传代方案，无需离心步骤，也无需技术人员持续监控。这些方案基于两条无饲养层的iPSC细胞系进行开发：一条来源于成纤维细胞，另一条来源于脂肪细胞33。

计算机控制的液体处理系统（图 1A）包含一个前后移动的平板。该平板具有九个编号凹槽，每个凹槽尺寸约为 5 × 3.3 英寸，配有压力固定夹，可容纳标准细胞培养板、液体储液槽及其他定制硬件。移液头可在左右方向（与平板移动方向垂直）以及上下方向移动。结合平板的运动，移液头可通过从可重复填充的吸头架上拾取移液吸头，程序化地在平板任意位置移除或添加培养基。必要时，96 个孔可保持相互独立，以避免交叉污染。在当前配置下，移液头的每个吸头可转移 0 至 200 µl 的培养基，但具体体积范围取决于吸头尺寸。

在标准培养板中传代干细胞时，酶法或化学法解离通常需要在 37 °C 下孵育。初步测试证实，对于本研究使用的两种 96 孔 iPSC 细胞系，无论是使用蛋白水解和胶原水解解离试剂，还是基于 EDTA 的解离试剂，在 37 °C 下的解离效果均优于室温（RT），表现为解离所需时间更短，且形成的克隆大小更均一（数据未显示）。为了实现传代过程的自动化，并避免频繁将培养板移入或移出培养箱，我们设计了可倾斜的、温度可控的斜坡装置，能够容纳并稳定固定标准培养板（图 1A）。当斜坡装置加热至 37 °C 时，使用蛋白水解和胶原水解解离试剂或基于 EDTA 的试剂从 96 孔板解离 iPSC 的效果，与将培养板置于 37 °C 培养箱中相当（数据未显示）。该斜坡装置还可使移液吸头到达孔的最低点，从而吸取整个孔的内容物（残留体积小于 5 µL），而从平面培养板中吸取时残留体积约为 10–15 µL，导致细胞损失。此外，斜坡设计还允许通过在斜孔顶部推出培养基并在底部收集的方式对孔进行冲洗（吹打混匀）。

采用96孔板格式对干细胞进行机器人自动化培养；换液与传代。

使用机器人液体处理系统培养iPSCs包括两个阶段：传代和换液。当细胞集落准备传代时，将按预定比例分割并接种至新培养板，随后定期换液，直至再次达到传代条件（图1B）。冻存细胞或非96孔格式的培养物可先转换为96孔板格式，随后立即进入传代/换液循环。用于维持细胞集落以外的细胞（占培养板的大部分）可被收集用于其他用途，代表该系统的生产组分。

在培养一段时间后，当部分或全部培养基被移除并弃入废液储槽时，即可完成96孔板中培养的iPSCs的换液操作。随后将新鲜培养基分装至同一块培养板中。机器人可使用新的吸头和试剂槽，为每个孔单独进行完全可定制的换液操作，包括将条件培养基与新鲜培养基混合。

干细胞传代通常需要采用解离方法，并常包含离心步骤。本文所述方案旨在标准化解离过程并消除离心步骤。该传代流程始于机器人将解离试剂加入置于37 °C倾斜斜坡上的96孔板中。经过预设时间后，通过清洗操作收集解离后的细胞，用户可控制清洗的位置、重复次数、体积及吹打速率。酶解时间、吹打速率和吹打重复次数均可调节，以改变解离后细胞集落的大小和均一性（图2），但每个参数均可根据特定细胞系的需求进行调整。这种控制方式消除了因技术人员移液时吹打速率、位置和次数不同而引入的实验变异。解离后的细胞收集并汇入含有新鲜培养基的储液槽后，将被分配至新的培养板中。为避免因底物降解或酶作用导致细胞死亡而引发的离心和接种问题，解离试剂被稀释至可接受解离效果的最低浓度，从而实现可靠的接种。该技术在mTeSR1培养基34中使用具有蛋白水解和胶原水解活性的解离试剂时有效，该培养基蛋白质含量相对较高；同时在蛋白质含量较低的Essential-8培养基35中也同样有效，两种培养基均适用于本系统（E8数据未显示）。

控制干细胞传代后接种密度对于常规且成功的干细胞培养至关重要。接种密度过低或过高均可能导致异位分化、多能性的丧失，并引起不规律的传代间隔。传统的干细胞培养通常依赖于比例分割法，即使用一个6孔板中的一个孔来接种一整块新的6孔板（1:6传代比例）。通过液体处理机器人，该传代比例可根据用户需求进行调整。例如, 1:6, 1:9, 1:12, 等等。）且对传代间隔的影响最大。机器人可根据用户需求收获少于一整列、恰好一整列（8孔）或超过一整列的细胞，具体数量需通过实验经验确定。脂肪细胞和成纤维细胞来源的iPSCs保持每三天常规换液一次，并在第四天以1:12比例进行传代。在此情况下，收获一整列细胞用于接种一块新的96孔板，从而实现每个周期1:12的传代比例（图3A剩余的11个孔可用于后续应用。为收获这11个生产孔中的细胞，重复传代操作流程，但将细胞收集至储液槽中。或者，也可将细胞保留在培养板上直接使用。

为了在无需计数的情况下实现传代间稳定的接种密度，并维持常规的传代时间表，我们的实验方案要求在细胞集落达到理想传代密度时，始终传代相同数量的预设列。为帮助使用者准确识别适宜的传代密度，我们提供了一系列图像，展示不同密度范围，并标出理想的传代密度（图3B）。操作人员可通过观察培养皿中的细胞状态，并与该密度图像标尺进行比对，以判断传代时机。理想的传代密度是基于脂肪组织和成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（iPSC）培养经验确定的，即大多数集落之间的间距约为相邻集落直径的25%。集落应分布均匀至关重要。此程度的集落间距对应于最大适宜密度，因为再经历一个喂养周期后，集落将相互接触，从而引发异位分化。

本文建立了一项必要的实验方案，用于解决如何以96孔板格式启动细胞培养，以及在出现密度问题后如何重置培养物。当启动新培养时，最佳的接种密度以及传代前所需的换液次数尚不明确。为确保接种后获得可用的细胞密度，机器人将现有或复苏后的细胞在96孔板中进行系列稀释（图4A）。此类梯度稀释的结果示例如图4B-E所示。经过数次换液周期后，部分列的细胞密度接近理想的传代水平，此时技术人员可利用机器人接种一块均匀稀释的培养板，以启动常规培养。该密度梯度方案也可用于恢复不规则培养板的正常传代周期和克隆均一性。若传代延迟或遗漏，克隆密度和尺寸会过高；而若传代过早，则克隆密度过低，且单个克隆可能过度生长，无法在孔内均匀分布。密度梯度方案可解决上述问题，使用户能够通过选择接种密度理想的孔位重新开始培养。

两个iPSC细胞系在机器人培养3个月后仍保持多能性。

干细胞多能性的维持可能受到培养条件的不利影响36,37。为了评估脂肪细胞和成纤维细胞来源的诱导多能干细胞系（分别为 a-iPSC 和 f-iPSC）在机器人操控的96孔板中长期培养后是否仍能维持多能性，将这两个细胞系按照上述方法在液体处理机器人上培养3个月，随后检测其多能性标志物的表达。在此期间，两个细胞系均使用蛋白水解和胶原水解解离试剂传代超过20次，且未进行离心。固定后的 a-iPSC 和 f-iPSC 细胞系96孔板经 Oct4 和 Nanog 染色后，显示这些标志物在细胞核内聚集，而 Ssea-4 则表达于细胞表面（图5A-L）。该结果与以往关于多能性 iPSCs 的报道一致38–41。使用 DAPI 复染未发现任何不表达上述三种多能性标志物的额外细胞。染色体异常在干细胞培养过程中较为常见42,43，但可能并不影响如图5A-L所示的多能性标志物分布。核型分析显示，经机器人传代的两个 iPSC 细胞系均具有46条正常染色体，表明该机器人培养方法并未引入超出正常范围的染色体不稳定性（图5M-N）。

检测已确立的干细胞基因表达标志物1,41,44,45 在机器人培养的iPSC系中，总RNA的提取与染色及核型分析同步进行。两种96孔板培养的iPSC系均表现出相似的多能性标志物表达水平 NANOG, POU5F1 和 REX1 而各细胞系分化的心肌细胞则未见此现象，另一个人类皮肤成纤维细胞（HDFs）系亦未见此现象（图6）。这两个细胞系分化而来的 cardiomyocytes 均为 MYL7 阳性，而人真皮成纤维细胞（HDFs）和干细胞则不表达 MYL7 两种iPSC细胞系均采用近期报道的小分子Wnt信号通路调控技术诱导分化为心肌细胞46染色后，两个细胞系的心肌细胞均呈cTnT阳性，并可见清晰的肌节结构形成（图7）。在96孔板中向心肌细胞的分化在超过80%的孔中均成功实现（数据未显示）。综上，这些数据表明，经过3个月和超过20次机器人培养传代后，细胞染色体正常，具有与多能性一致的转录程序，并且仍具备向心肌细胞分化的潜能。

带有移液头、96孔板的自动化液体处理系统；细胞培养工作流程示意图。
图1. 机器人干细胞培养设备及典型iPSC培养流程概览。（A）机器人液体处理系统，显示用于96孔干细胞培养的典型台面布局。新的无菌移液吸头（Tips）、可拆卸的废吸头容器（Waste）、多孔可高压灭菌储液槽用于盛放所需液体试剂（Liquids）、96孔板放置在温度可控的倾斜斜坡上（96-well plates），八通道机器人移液头可左右及上下移动（Pipet head）。板盖存放架（PLHR）。台面位置编号见下表。（B）机器人iPSC培养包含两个阶段：换液和传代。细胞生产周期始于集落板准备传代时。用户选择所需的传代比例，机器人将接种一组新的96孔板，随后定期换液，直至再次准备传代。当孔板准备传代时，大部分孔板内容物不会用于接种后续的集落板，因而可用于其他用途，代表系统的生产阶段。冷冻或现有的细胞系可在任意时间引入，并维持在换液/传代循环中。请点击此处查看该图的高清版本。

酶消化分析；时间、速率和重复次数的影响；显微镜图像，酶解过程。
图2. 可通过机器人液体处理参数控制iPSC集落解离的特性。每张代表性图像显示了经指定处理后仍悬浮于96孔板中的成纤维细胞来源iPSC的解离状态。（上排，A-C）酶解时间，无吹打。在96孔板中培养的成纤维细胞来源iPSC接受逐渐延长的蛋白酶和胶原酶解离试剂处理时间，且未进行机器人吹打操作。（中排，D-F）吹打速率，酶解3分钟。细胞接受3分钟蛋白酶和胶原酶解离试剂处理后，加入175 µl培养基，并以指定速率在每孔中上下吹打一次。µl/sec = 微升每秒。（下排，G-I）吹打次数，酶解3分钟，160 µl/sec。细胞经蛋白酶和胶原酶解离试剂处理3分钟后，加入175 µl培养基，随后以160 µl/sec的速率进行指定次数的吹打。请点击此处查看此图的高清版本。

不同时间间隔下细胞培养传代过程中密度评估示意图。
图3. 典型的脂肪细胞和成纤维细胞iPSC克隆维持方案，以及一系列克隆密度图像，用于确定传代时机以维持规律的换液/传代周期。（A）从一株准备传代的脂肪细胞或成纤维细胞来源的96孔iPSC克隆开始，将其中一列细胞在机器人上进行传代操作，无需离心，稀释后接种至12个新列，并在之后按特定时间间隔进行换液，直至培养板再次达到传代条件。对于细胞生产，未用于维持克隆的列可进行传代并收集以供后续使用。可根据需要传代任意数量的列以控制扩增速率。（B）为确定最佳传代时机，向用户提供了每24小时拍摄的一系列密度图像。上方红色框内（初次接种后72小时内）克隆密度尚不足，应继续换液培养；当密度达到绿色框所示状态（约96小时）时，克隆处于理想的传代密度；至120小时时，克隆已过于密集，不宜传代，应避免此种情况。后者可通过接种密度梯度加以解决，但强烈不建议常规在该密度下培养。白色标尺=200 µM。请点击此处查看该图的高清版本。

使用液体处理机器人进行细胞密度分析；不同接种水平下的显微镜图像。
图 4. 96孔机器人培养系统允许用户从冻存或活跃的细胞系启动培养，并建立接种密度梯度。 （A）用户从冻存细胞库中或收获活跃培养物后制备细胞悬液，并将其放置于机器人上。机器人系统随后执行连续稀释程序，将初始细胞悬液沿96孔板分布，密度梯度按列分布。（B–E）来自（A）中12列中的4列在密度梯度接种程序48小时后的细胞密度示例。白色标尺代表225 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

脂肪细胞与成纤维细胞来源iPSC的免疫荧光染色；DAPI、Oct4、Nanog、Ssea4标记物；核型分析。
图5. 脂肪细胞与成纤维细胞来源的iPSC细胞系在96孔板机器人培养中经过22代（脂肪细胞）或23代（成纤维细胞）传代（约3个月）后仍维持多能性。（A–L）脂肪细胞与成纤维细胞来源的iPSC细胞系按照文中所述方法在96孔板中通过机器人进行换液和传代，共传代22或23次，无需离心，随后固定并进行多能性标志物Oct4、Nanog或Ssea4的免疫染色，DAPI复染细胞核。白色标尺=100 µm。（M–N）与（A）中所述平行培养的细胞进行核型分析，结果显示染色体数目正常，为46条。请点击此处查看该图的高清版本。

RT-PCR 凝胶电泳结果；检测到 NANOG、POU5F1、REX1、MYL7、GAPDH 的表达条带
图 6. 在96孔机器人培养系统中连续培养超过20代的脂肪组织（96-A）和成纤维细胞（96-F）来源的诱导多能干细胞维持了多能性基因的表达，并可分化为心肌细胞。 从机器人培养的两种iPSC细胞系以及由这两种细胞系分化而来的心肌细胞（CM-A = 脂肪组织来源iPSC分化的心肌细胞，CM-F = 成纤维细胞来源iPSC分化的心肌细胞，分化诱导后14天收集）中提取总mRNA，并用于RT-PCR检测多能性标志物 NANOG, POU5F1, REX1、心肌细胞标志物 MYL7 和上样对照 GAPDH。同时收集人皮肤成纤维细胞（HDF）作为非iPSC、非心肌细胞的对照。 请点击此处查看该图的高清版本。

心肌细胞分化、成纤维细胞/脂肪来源iPSC显微图像；DAPI、cTnT、F-actin染色。
图7. 成纤维细胞和脂肪组织来源的iPSC在长期96孔板机器人培养后仍保持向心肌细胞分化的潜能。（A-H）成纤维细胞和脂肪来源的iPSC在96孔板机器人培养系统中连续培养超过20代后，仍可诱导分化为心肌细胞。分化诱导14天后，将96孔板中贴壁的心肌细胞解离，并以低密度重铺至玻璃载片上，进行肌钙蛋白T（红色）、F-actin（绿色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光染色。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞培养扩增流程图；传代工作流程；多孔板扩增方法。
图8. 96孔板干细胞培养的放大过程。 干细胞生产的放大取决于用于接种下一批培养板的板数量。操作者可在每次传代时接种相同数量的培养板，以维持一个固定的生产规模；也可通过接种更多培养板来扩大生产规模。例如，在第0周期中，一个96孔板被传代至十二个新板（第1周期），实现12倍扩增。若将这十二个板中的任意一个继续传代至一组新的十二个板（第1至第2周期），则可维持该扩增速率；也可通过传代多个板（第2至第3周期）进一步扩大生产。在传代过程中，未用于维持细胞群的培养板均可用于后续应用。因此，常规传代12个板时，经过两次传代最多可获得144个板：其中12个用于维持细胞群，其余132个可用于其他用途。请点击此处查看该图的高清版本。

手动操作与机器人操作时间对比，线图比较6孔板和96孔板处理小时数。
图9. 基于96孔板的细胞培养在细胞生产效率上远超手动培养。 如图8所示，一个培养板可传代接种至十二个新板，随后可进一步传代至144个培养板。该扩增速率可在两次传代机会中实现。技术人员手动喂养一个6孔板约需3.5分钟，而使用显微镜检查并将其放置于机器人系统上的一个96孔板仅需约30秒。若技术人员需处理144个培养板，则使用机器人喂养时约需1.2小时进行板的操作，而手动培养则需要整整8小时专门用于喂养操作。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

在本研究中，我们建立了一种用于iPSC制备的机器人化培养方法，可在96孔板体系中实现换液和传代的微型化与自动化，同时支持高效的扩增。采用液体处理机器人定期对iPSC克隆进行换液，并通过酶解法以固定时间间隔进行传代。机器人还被编程用于制备包被有细胞外基质凝胶的培养板，并建立接种密度梯度。当成纤维细胞来源和脂肪组织来源的iPSC在此系统中培养超过20代（约3个月）时，仍能维持其多能性及稳定的核型。两个细胞系均能够分化为心肌细胞。综上所述，本文所描述的一系列方案使得缺乏干细胞培养经验或缺乏专业培养设备的使用者，能够以较低的劳动强度和成本实现干细胞的培养，并获得高效的细胞产量或多细胞系并行处理能力。

本文详述的机器人操作方案为诱导多能干细胞（iPSC）的生产与处理提供了经济高效的扩增方法。其优势之一在于，采用已建立的基于培养板的扩增体系，可维持细胞的多能性，这一点已在本研究及先前的研究中得到证实44,47–49。尽管其他可扩展的干细胞培养体系也能获得多能性细胞20,23,29，但该基于培养板的方法几乎无需改变原有培养体系，例如无需适应悬浮培养、无需使用消泡剂或长期使用Rho激酶抑制剂20。因此，由于培养条件相似，该方法能够快速且可预测地适应新细胞系的培养。随着iPSC在疾病建模中的应用日益增加4,6,19,50，新的iPSC细胞系被持续建立。本文所述技术特别适用于中高通量、大规模地培养新细胞系，因为转入该体系的技术门槛较低。在维持细胞集落所需的劳动力和设备方面，同样具有此优势。最后，由于该培养体系及操作方式与iPSC细胞系建立和验证时所用环境相似，其培养表现（如定向分化能力）更可能具有可预测性。

图8 展示了一种在96孔板中扩大干细胞生产的策略。一个孔板（第0周期）通过机器人接种12个新孔板，实现12倍扩增（第0周期到第1周期）。经过数天的培养后，这12个孔板中的其中一个被传代以接种另一组12个新孔板（第1周期到第2周期）。其余11个孔板则可用于其他用途，代表该系统的生产部分。按照此速率，每次传代一个孔板，每个周期（即每3-4天）可提供11个孔板。当多个孔板同时进行传代时，该方法可进一步扩大规模，如从第2周期到第3周期的过渡所示。在第3周期中，始终使用两个孔板来维持细胞系并接种24个新孔板。每次传代周期后，剩余的22个孔板即可用于后续实验。在维持培养的任何阶段，用户均可接种更多孔板以提高产量。例如，可在两个生长周期中对每一列均进行传代。第一次传代将一个孔板扩增至12个孔板，而每个这12个孔板又可用于接种144个孔板。在此情况下，用户从一个孔板开始，经过两次传代（约1.5至2周的培养），最终获得144个孔板。例如，成纤维细胞和脂肪来源的iPSC系在准备传代时，每个96孔板可产出约2500万至7500万个细胞。因此，144个孔板可代表约4-7 × 109 个细胞。

使用机器人操作搬运144块96孔板的劳动负担是多少？本研究的目标之一是实现可扩展的干细胞生产，相较于传统的（即，6孔板）干细胞培养方式，降低人力投入。机器人通过消除在换液和传代过程中对每块板的手动操作需求，实现了这一目标。虽然96孔板的生产规模与传统6孔板一样呈线性增长，但技术人员在机器人培养中处理这些板所需的时间显著减少。机器人培养的生产效率正是源于这一差异（图9）。研究发现，技术人员取出一块6孔板、在显微镜下检查、吸除旧培养基并添加新培养基，大约需要3.5分钟。相比之下，技术人员仅需约30秒 即可从培养箱中取出一块96孔板，在显微镜下检查细胞密度和污染情况，然后将其放置到机器人系统上。通过采用类似上述的扩展化换液程序，可同时加载并处理六块96孔板，整个过程耗时约21分钟，即每块板3.5分钟 。单块板的换液总耗时在机器人操作与手动操作之间相近，但若手动为6块板换液，技术人员需全程参与21分钟 ，而使用机器人时，技术人员仅需花费3分钟 来处理这六块板（每块板约30秒 的检查时间）。如图9所示，使用机器人处理144块板时，技术人员的总操作时间约为1.2小时，而手动操作则需要8小时，且机器人在处理板和液体转移过程中不会出现操作失误。

本文所述的96孔板iPSC培养方法为复杂的筛选任务提供了一个可操作的平台。由于每个孔中的细胞均来自相同的初始细胞池，具有相同的遗传背景并以相同的密度接种，因此可以将不同的实验变量分布在培养板上，并通过机器人系统结合 commercially available reservoirs（商用储液槽）对不同条件进行分隔和维持。该方法适用于干细胞生长培养基开发34,35,47、基质或培养条件测试以及利用干细胞开展的毒性研究51等实验。由于每种干细胞系在最佳克隆大小和传代需求方面均具有独特性，研究者可通过调整收获的列数、传代过程中的机械振荡强度以及换液频率，利用该系统调控接种密度、换液频率和传代操作。通过迭代优化这些变量，使用者可快速确定适合新细胞系培养的一组条件，或开发新的培养技术。该机器人系统还能够同时维持96个平行且独立的干细胞克隆。在由体细胞诱导生成iPSC或在基因操作后进行克隆筛选时，通常需要对大量平行克隆进行筛选以获得潜在的iPSC细胞系。一旦单细胞被接种至96孔板中，该系统即可对96孔板进行换液和传代操作，同时保持各个克隆彼此分离。这在筛选潜在克隆时实现了极高的通量，并消除了人工操作中同时培养96个平行细胞系的困难。此外，该方法还支持对每个克隆进行扩量培养，使材料可充分用于平行分析。最后，我们设想将这些培养技术与机器人化培养板转运系统整合，实现培养板在培养箱之间的自动运送，从而完成完全自动化的细胞培养。通过更复杂的机器人系统，可在保持本文所述基础操作流程可转移至其他基于培养板系统的同时，实现更大规模的扩展。

在本实验方案中，首先需要重点关注的步骤是防止和检测污染的步骤，例如步骤 1.5 和 4.2。如上所述，只要采用良好的无菌操作技术和基本常识，污染通常可以成功避免。无论干细胞培养采用何种形式，操作人员都必须在规定步骤中检查是否存在污染，这将显著降低污染风险。正确应用细胞外基质凝胶是本方案成功实施的第二个关键步骤。若未对 96 孔板进行适当包被，干细胞将无法生长。一个常见问题是孔内包被不完全。经验表明，气泡、静电吸附以及毛细作用会阻碍孔底的完全包被。预润湿步骤（1.6）的设立正是为了显著改善孔底的包被效果，因此不得省略。该预润湿步骤似乎能够降低塑料 96 孔板表面的疏水性，从而使后续加入的细胞外基质凝胶在孔底及孔壁均匀分布。此外，建议在完成包被后，轻轻将 96 孔板轻敲于洁净的手掌一次，以确保细胞外基质凝胶溶液均匀铺展。细胞解离参数的优化同样至关重要。长时间使用酶或 EDTA 类解离试剂会导致细胞完全解离为单细胞，而这在传代过程中可能并非预期目标。因此，操作人员应特别关注解离时间、吹打力度以及洗涤次数对细胞集落形态和细胞健康状态的影响，并据此进行相应调整。

理解本文所述技术的局限性对于成功操作至关重要。与任何其他细胞培养环境一样，使用96孔板具有相对较高的污染风险。如上所述，技术人员在换液和传代过程中需手动操作每块培养板，例如打开盖子、将板放置于机器人工作台以及在显微镜下检查培养板。因此，如步骤1.5后所述，必须避免触碰任何培养板盖的内侧，或使其暴露于可能被污染的表面，例如工作台上的斜面加热模块或垂直定位针。在方案开发过程中，发现了这一局限性，从而促使设计出一种用于存放培养板盖的支架，以维持无菌状态。同样，液体处理机器人工作台上的槽式储液槽、移液吸头及其他耗材也可能成为污染源，因为它们暴露于环境中并由技术人员操作。因此，应遵循良好的无菌操作规范，例如减少在暴露的培养材料或开放液体上方的移动。另一个局限性在于，当方案扩大规模时，难以对每个孔进行目视检查。 >100个96孔板的处理较为繁琐。可通过肉眼观察整个培养板是否存在污染迹象（如培养基浑浊）来识别可疑孔。对于未来的规模扩大，将引入自动显微镜以及细胞生长和潜在污染的指示系统。

综上所述，本文所述的基于96孔板的高通量平台为干细胞培养与生产提供了一种可重复且高保真的板式培养方法。该方法在保留传统贴壁培养优势的同时，降低了干细胞培养所需的经验水平、设备要求及投入的 labor 时间。

披露

作者 MKC、MJG、EEB、NJD 和 RO 在本研究开发期间是或曾是 InvivoSciences, INC 的员工，该公司构想并开发了本文所述的机器人操作方案。TW 是 InvivoSciences INC 的首席科学官。SH 是 Gilson INC 的员工。

致谢

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R44 GM087784和R01 HL109505的资助。作者感谢Gilson, INC公司的技术团队和OEM团队提供的长期技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板Corning359696孔；每孔体积：360 μl；细胞生长面积：0.32 cm2；单独包装
Seahorse储液槽SeahorseBio201308-1004孔透明聚丙烯储液槽，容量73 ml，每箱25个
Gilson吸头GilsonF16702310个架子，Gilson 96孔吸头，D200吸头
DMEM/F12Life Technologies12500062DMEM/F12粉末。 用1 L纯化、细胞培养级水重悬，并经无菌过滤。
生长因子减少型MatrigelCorning354230文中称为“"细胞外基质凝胶"”。Matrigel GFR，10 ml
mTeSR1StemCell Technologies5857mTeSR1人胚胎干细胞维持完全试剂盒
E8培养基StemCell Technologies5940TeSR-E8人胚胎干细胞/诱导多能干细胞维持试剂盒
Y27632AdooQ BioScienceA11001-50ROCK抑制剂Y-27632 2HCl
AccutaseInnovative Cell TechnologiesACCUTASE文中称为“"蛋白水解和胶原蛋白水解解离试剂"”。Accutase 500 ml无菌细胞溶液
PBSFisherSH30256FS不含Ca、Mg的PBS，500 ml，每包6瓶
Gilson PIPETMAXGilsonPIPETMAXhttp://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

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