利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

摘要

本文概述了利用TetON系统在成年斑马鱼尾鳍再生过程中实现组织特异性基因表达的工作流程。

摘要

斑马鱼已成为研究脊椎动物发育、生理学、疾病及组织再生的重要模式生物。要深入理解其中涉及的分子与细胞机制，需要借助能够实现可诱导、组织特异性基因表达或信号通路操控的实验工具。因此，我们及其他研究者近期已将TetON系统应用于斑马鱼。TetON系统可实现时间和空间上可控的基因表达，我们最近利用该工具探究了Wnt/β-catenin信号通路在斑马鱼尾鳍再生过程中组织特异性的功能。本文描述了在成年斑马鱼再生尾鳍中使用TetON系统实现可诱导、组织特异性基因表达的工作流程，包括构建稳定的转基因TetActivator和TetResponder品系、转基因诱导，以及验证鳍再生组织中基因表达组织特异性的技术方法。因此，本实验方案为建立并应用斑马鱼中的功能性TetON系统提供了蓝图，尤其适用于鳍再生研究。

引言

斑马鱼是一种广泛使用的脊椎动物模式生物，用于研究发育、生理、疾病和再生等多个方面的生物学问题。随着斑马鱼在胚胎后生物学过程研究中的应用日益广泛，可诱导的、组织特异性的基因表达或信号通路操控实验工具变得愈发重要。特别是成年斑马鱼器官和附属肢体再生的研究，长期受限于缺乏能够在再生过程中解析信号通路时空需求的有效工具。

目前，已有三种不同的系统被用于在成年斑马鱼再生器官中实现条件性、组织特异性的基因表达：Cre-lox 系统、通过转座子介导的体细胞转基因实现热休克诱导型转基因的嵌合表达，以及 TetON 系统^1-3。TetON 是指四环素控制的转录激活系统的一种变体，其表达在抗生素四环素或其衍生物（例如多西环素）存在时被激活。e.g. 多西环素）。迄今为止在成年鱼类中使用的 Cre-lox 系统依赖于他莫昔芬控制的 Cre 重组酶（CreERT2），其表达通过组织特异性调控元件在空间上受到限制。由 Cre 驱动的 STOP 突变盒的移除，可促进由在所有细胞类型中均应具有活性的启动子驱动的目的基因表达¹。通过转座子介导生成嵌合表达的体细胞转基因，提供了一种在单个细胞谱系中实现可诱导转基因表达的系统。将携带受热休克启动子转录调控的目的基因的 Tol2 转座子注射到斑马鱼胚胎中，通常会导致嵌合个体仅在再生器官的特定细胞谱系中携带该转基因²。尽管这两种系统均可实现条件性组织特异性基因表达，但 Cre-lox....

方案

1. 转基因 Tet 激活因子鱼系的建立

1. 构建 TetActivator 载体
   1. 使用标准技术将感兴趣的调控序列克隆至载体 #1247 中 TetActivator 盒的上游。或者，使用重组技术构建 BAC，将 TetActivator 盒（载体 #1180）插入目标基因的第一个外显子中，并将 Tol2 反向重复序列引入 BAC 骨架中（详细的重组工程方案见^7,8）。
   2. 使用市售试剂盒制备无毒素的质粒 DNA 或 BAC DNA。
2. 构建转基因 TetActivator 鱼系
   1. 按照标准操作进行 TetActivator 载体的显微注射⁹。
      1. 将 25–50 pg 质粒 DNA 或最多 250 pg BAC DNA 与编码 tol2 转座酶的加帽正义 RNA 一同注射至单细胞期胚胎中，以实现转座子介导的转基因；或与 I-SceI 蛋白共注射以实现 I-SceI 介导的转基因。
         注：有关转基因方法选择的考虑见讨论部分。
         注：建议优先注射至细胞质而非卵黄中，因为当 DNA 未被递送至细胞质时，转基因效率可能会降低。
   2. 将注射后的 G0 代胚胎培育至成年。可选地，通过 AmCyan 荧光筛选 G0 代胚胎，并优先培养显示预期表达模式....

结果

为了建立用于组织特异性诱导基因表达的功能性 TetON 系统，需要构建转基因的 TetActivator 和 TetResponder 品系（图 1A）。该过程通过将 TetActivator（图 1B–C）或 TetResponder（图 1E）载体显微注射到早期斑马鱼胚胎中，并实现其在生殖系中的整合来完成。功能性 TetActivator 载体可通过将短调控序列（增强子元件）克隆至 TetActivator 盒的上游（图 1B）实现，也可通过将 TetActivator 盒重组至含有目的基因调控元件的 BAC 中完成（图 1C）。TetActivator 载体的生殖系整合可通过将单条注射后的 G0 代鱼与野生型鱼杂交，并在 F1 代胚胎中观察到符合预期表达模式的 AmCyan 荧光来验证（图 1D）。TetResponder 转基因的生殖系整合及其功能可通过将单条 G0 代注射鱼与已建立的 TetA.......

讨论

成年斑马鱼具有惊人的能力，能够成功再生多种内部器官和附属结构。要深入理解其中涉及的分子与细胞机制，需要对基因功能和信号通路进行组织特异性分析。为此，TetON系统为在斑马鱼胚胎及成体中实现时空可控的基因表达提供了高效工具。本文所描述的TetON系统构建方法及实验技术已在本实验室最近的一项研究中成功应用³。在建立TetON系统时，还应考虑以下附加问题：

TetActivator 转基因设计的考虑因素

我们先前已证明，由反向四环素阻遏蛋白M2突变体与单纯疱疹病毒VP16转录激活结构域衍生物3F融合而成的单诱导型Tet激活因子[简称为irtTAM2(3F)或TetA-M2]能够实现高效诱导，但在无多西环素（DOX）存在时可能表现出虽低但可测量的渗漏表达，即背景性诱导活性⁵。因此，我们描述了采用糖皮质激素受体（TetA-GBD）或蜕皮激素受体结构域（TetA-EcR）融合构建的双诱导系统，可消除渗漏表达⁵。因此，若该系统用于表达毒性蛋白或活性极强的蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
繁殖盒	Aqua Schwarz	AquaBox 1
复合荧光显微镜	例如，Leica、Zeiss	因制造商而异	用于成像荧光组织切片
共聚焦显微镜	例如，Leica、Zeiss	因制造商而异	用于成像荧光组织切片
冷冻切片机	例如，Leica、Thermo-Scientific	因制造商而异	用于冷冻切片
4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（Dapi）	Sigma-Aldrich	D9542	在 PBS 中按 1/5,000 稀释 用于细胞核可视化
多西环素	Sigma-Aldrich	D9891	用 50% EtOH 配制成 50 mg/ml（97 mM）的储存液 用于 TetResponder 诱导
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	P6148	在 PBS 中配制成 4%（w/v）多聚甲醛，pH 7.5 用于固定
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）			1.7 mM KH2PO4，5.2 mM Na2HPO4，150 mM NaCl，pH 7.5
1× 磷酸盐缓冲液 + Tween 20（PBT）			含 0.1% Tween 20 的 1× PBS
Superfrost Ultra Plus 黏附载玻片	Thermo Scientific	1014356190	用于组织切片的收集
体视荧光显微镜	例如，Leica、Zeiss	因制造商而异	用于基于荧光的基因分型
PCR 仪	例如，Biorad、Applied Biosystems	因制造商而异	用于基于 PCR 的基因分型
组织冷冻介质（TFM）	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	用于组织样本包埋
三卡因（L-乙基-m-氨基苯甲酸甲磺酸盐/MS-222）	Sigma-Aldrich	E10521	用于麻醉 在 E3 胚胎培养基中使用浓度为 1 mg/ml