超高场强 MRI 在多囊肾病小型啮齿类动物模型中的应用 体内 表型分析与药物监测

摘要

本文描述了利用超高场磁共振成像（MRI）作为一种非侵入性手段，获取多囊肾病啮齿类动物模型表型信息并监测干预效果的方法。与传统的组织学方法相比，MRI图像可在活体（in vivo）状态下获取，从而实现纵向随访。

摘要

在多囊肾病（PKD）的研究中，多项体内临床前研究采用同源的啮齿类动物模型来识别和研究导致该疾病的遗传与分子机制，并且非常适用于快速药物筛选和有前景疗法的测试。这些研究中的一个限制因素通常是缺乏高效的非侵入性方法，以连续分析肾脏的解剖和功能变化。磁共振成像（MRI）是目前随访常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者的金标准影像技术，能够提供优异的软组织对比度和解剖细节，并可进行总肾脏体积（TKV）的测量。在PKD啮齿类动物模型中，MRI的一个主要优势在于能够实现体内成像，从而支持纵向研究，使用同一只动物进行多次观察，进而减少所需的动物总数。在本论文中，我们将重点介绍利用超高场（UHF）MRI对PKD啮齿类动物模型进行非侵入性的体内成像。本研究的主要目标是介绍MRI作为一种工具，用于PKD啮齿类动物模型中的体内表型特征刻画及药物疗效监测。

引言

多囊肾病（PKD）是一组由单基因突变引起的疾病，其特征是肾脏囊肿的形成。其中，常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）和常染色体隐性遗传性多囊肾病（ARPKD）是最常见的类型^1,2。ADPKD 是遗传性肾囊性疾病的最常见形式，由 PKD1 或 PKD2 基因突变引起，表现为迟发性、双侧多发性肾囊肿，并伴有不同程度的肾外囊肿以及心血管和肌肉骨骼异常。ARPKD 最常影响新生儿和幼儿，由 PKHD1 基因突变引起，其特征为肾脏增大且回声增强，并伴有先天性肝纤维化³。

重要的是，常染色体显性多囊肾病（ADPKD）在基因（genic）和突变（allelic）水平上均具有异质性，导致显著的表型变异。PKD1 和 PKD2 基因中的突变 PKD1 基因与严重的临床表现（多发囊肿、早期诊断、高血压和血尿）以及快速进展至终末期肾病（比其他患者早20年）相关 PKD2 突变⁴严重的多囊肝病（PLD）和血管异常可能与两个基因的突变相关 PKD1 和 PKD2⁵. ADPKD 的大多数肾脏并发症主要源于囊肿扩张以及相关的炎症和纤维化。囊肿的形成始于 在子宫内 并持续贯穿患者的一生。尽管肾脏体积可能达到正常肾脏体积的20倍以上，但通常仍能保持其肾形外观。大多数患者表现为双侧肾囊肿分布，但在某些罕见情况下，囊肿可能呈单侧或不对称分布。

对于随访常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者或实施治疗方案的肾科医生而言，一个主要挑战是该疾病的自然病程。在疾病发展的大多数阶段，肾功能仍保持正常，而当肾功能开始下降时，肾脏的大部分组织已被囊肿取代。在疾病晚期才开始治疗时，疗效往往不佳，因为患者可能已经进入慢性肾病不可逆的阶段。相反，在疾病早期启动治疗时，仅依靠肾小球滤过率难以判断治疗反应。因此，肾脏体积作为疾病进展标志物的概念逐渐受到关注。

多囊肾病放射影像研究联盟（CRISP）研究显示，在常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者中，肾脏和囊肿体积的增加与肾功能恶化直接相关，突显了总肾脏体积（TKV）作为疾病进展替代标志物的潜力^6,7。因此，TKV 目前已被用于多项 ADPKD 临床试验的主要或次要终点指标^2,8,9。

包括自发突变和基因工程在内的多种小鼠模型已为多囊肾病（PKD）的发病机制提供了重要见解^10,11。其中，Pkd1 或 Pkd2 模型（即 Pkd1 或 Pkd2 基因发生突变）已成为最常用的模型，因其能完美模拟人类疾病。此外，携带除 Pkd1 或 Pkd2 基因以外其他基因突变的啮齿类动物模型也被用作实验平台，以阐明与该疾病相关的信号通路。同时，其中一些模型已被用于评估潜在的治疗方法。然而，在许多针对 PKD 的啮齿类动物研究中，一个限制性因素通常是缺乏高效的非侵入性方法，以对肾脏的解剖和功能变化进行连续分析。

磁共振成像（MRI）是目前随访常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者的金标准影像学技术，可提供优良的软组织对比度和解剖细节，并允许进行总肾脏体积（TKV）测量。尽管MRI在大型动物和人类的解剖成像中已得到充分确立，但在小型啮齿类动物成像方面 体内 带来额外的技术挑战，其中获取高分辨率图像的能力可能限制其应用价值。随着超高场强（UHF）磁共振成像（7–16.4 T）的引入以及更强梯度系统的开发，目前可实现更高的信噪比和空间分辨率，其图像诊断质量已接近人类临床应用水平。因此，UHF MRI 在 体内 用于PKD的小型啮齿类动物模型成像已成为研究人员的强大工具。

方案

在开始任何涉及活体动物的操作之前，实验方案必须获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 扫描仪配置

1. 开始之前，请确保加热器处于关闭状态。
2. 选择微型成像梯度系统、38 mm 射频线圈和微型成像支架。
3. 在支架的中央孔中安装变温组件。

2. 动物准备

1. 对于 MRI 实验，使用气化异氟烷实现最佳麻醉效果。诱导麻醉时，将动物放入内衬吸水纸的诱导室中。调节异氟烷蒸发器的流量计至 2.0–2.5 L/min，异氟烷浓度设为氧气中的 3%。
2. 此阶段需移除任何金属标签或其他金属物体。动物处于麻醉状态时，应在眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
3. 当动物达到手术麻醉深度时（即， 失去趾部捏夹回缩反射后，将动物置于固定装置中，使其鼻部插入鼻罩。将探头中的麻醉气流速设置为2.0–2.5 ml/min，异氟烷浓度在氧气中设定为1.5–2.0%。手术过程中通过鼻罩输送麻醉气体。根据动物的年龄和体重定期调整异氟烷浓度，以维持呼吸频率约为40次/分钟。
4. 使用动物固定装置来固定动物，防止其在 MRI 实验过程中移动。根据要扫描的身体部位，选择不同类型的动物固定装置。
   注意：可根据特定实验需求和动物体型（从新生小鼠到160克大鼠）定制由实验室塑料（聚丙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯）制成的固定装置。
5. 将直肠温度计插入动物体内以监测其体温。实验过程中，使用暖空气气流将动物体温维持在35–37 °C。根据动物体温反馈调节空气温度（30–38 °C）和气流速度（1,200–2,000 L/hr）。
6. 将球囊式呼吸压力传感器连接至动物腹部，以监测呼吸频率。
7. 将动物固定在射频线圈的中心位置，并小心地将带有动物的射频线圈放入磁共振成像仪中。

3. 磁共振成像实验

1. 在开始实验前调节并匹配射频线圈，以最小化射频功率的使用并最大化信噪比。开始调谐/匹配的步骤如下：
   1. 点击工具图标，打开光谱仪控制工具。
   2. 在光谱仪控制工具中，点击采集 → 甩尾（Wobble）。将弹出一个采集/重建（Acq/Reco）窗口，显示甩尾曲线。
   3. 逐步微调调谐和匹配电容器（使用调谐和匹配杆），直到反射的射频功率最小化。目标是观察到一条曲线，其最小值位于横轴为零处的纵轴上。
   4. 当线圈校准成功完成后，在采集/重建（Acq/Reco）窗口中点击停止按钮。
2. 在三个正交平面上采集定位像，以生成轴向、冠状和矢状图像。使用快速成像序列（如门控快速低角度激发序列，IG-FLASH）采集定位像¹²。利用定位像设定实际成像的合适几何参数。
3. 根据具体的研究目的，选择合适的成像序列和参数，并使用交通灯系统启动扫描。系统将自动完成射频通道校准、磁体匀场、水共振频率的载波频率设定以及接收增益调整。
   1. 对于解剖学研究和T2加权图像，采用二维多层或三维模式进行采集。为了在给定空间分辨率下缩短实验时间，应尽可能减小视野（FOV），但需足够大以避免卷褶伪影（2.56–3.2 cm）。
4. 通过合理选择重复时间（TR）和/或切片数量，使所选序列的周期略短于动物呼吸周期。这可确保数据在动物呼吸的安静期被采集。
   1. 例如，对于腹部成像，将动物呼吸频率维持在约30次/分钟，即每次呼吸约2,000毫秒。使用Turbo快速采集增强弛豫（RARE）序列，采集11–19层冠状切片，参数设置为TR/TE 1500/9毫秒，RARE因子为8，矩阵为256 × 256，视野为2.56 × 2.56 cm，层厚为0.75 mm。
      注意：通过将TR调整为1,500毫秒，并保持动物呼吸频率约为30次/分钟（每次呼吸2,000毫秒），可确保数据在动物呼吸的安静期被采集。
5. 完成所有图像采集后，将扫描过的动物置于加热垫上，并持续监测直至其恢复自主活动。动物苏醒后，将其送回笼中，并至少继续监测1小时，然后再送回动物饲养设施。

结果

在本论文中，我们旨在展示超高场磁共振成像（UHF MRI）作为一种工具的实用性 体内 用于PKD及其他肾脏疾病啮齿类动物模型的表型特征分析或药物监测。所有实验均为经IACUC批准的实验方案的一部分。

使用超高频磁共振成像（UHF MRI）对多囊肾病（PKD）的小型啮齿动物模型进行体内表型分析：

所有成像研究均在异氟烷麻醉下的活体动物上进行，使用配备微型和微型成像附件的布鲁克AVANCEIII-700（16.4 T）垂直腔双通道多核波谱仪，用于 体内 和 体外 核磁共振波谱学与显微成像

腹部：

PKD的主要结构改变是囊肿的形成与生长，这是导致大多数肾脏并发症的原因。ADPKD最常见的肾外表现是肝囊肿，可在高达90%的受累成人中发现。¹³利用超高场强磁共振成像（UHF MRI），可获取小体型多囊肾病（PKD）啮齿类动物高分辨率的腹部解剖图像...

讨论

本手稿展示了利用超高场强磁共振成像（UHF MRI）作为研究工具的可行性 体内 用于PKD啮齿类动物模型的表型特征分析或药物监测。

我们描述了在16.4 T磁场下使用配备微成像和小成像附件的宽孔径Avance III高分辨率核磁共振（NMR）波谱仪所进行的实验。该波谱仪由Paravision 5.1成像软件控制的TopSpin2.0PV采集与处理软件驱动。由于在纵向研究中实验啮齿类动物的尺寸存在差异，我们采用了配备38 mm射频线圈和小成像支架的小成像附件。动物体温控制使用标准高分辨率variable temperature unit（VTU BVT 3000 digital），由TopSpin 2.0软件调控。来自探头底部的气流经过加热器后，再流经热电偶，该热电偶位于麻醉状态的啮齿类动物正下方。热电偶持续调节加热器的功率输出，以维持气流温度在设定值。

使用超高场强磁共振成像（UHF MRI）对多囊肾病（PK...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	配备微型和显微成像附件的宽孔径双通道多核波谱仪，用于in vivo 小型啮齿类动物成像
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	波谱仪数据处理软件
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	成像软件
VTU BVT 3000 数字式	Bruker	W1101095	温度控制器