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纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

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DOI：

10.3791/52771

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2015年4月29日

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

本文内容

摘要

我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+ T细胞扩增的方法。

摘要

传统的疫苗佐剂（如铝盐）诱导的 CD8+ T 细胞反应较弱。为应对疫苗研发中的这一主要挑战，研究人员已设计出多种纳米颗粒系统，通过模拟病原体的特性，以改善抗原向引流淋巴结的递送，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，从而开发出更有利于诱导抗原特异性 CD8+ T 细胞反应的新型疫苗制剂。本文中，我们描述了一种被称为“病原体模拟”纳米颗粒系统的合成方法，即层间交联多层囊泡（ICMVs），该系统可作为有效的疫苗载体，用于共递送亚单位抗原和免疫刺激剂，并有效激发强烈的细胞毒性 CD8+ T 淋巴细胞（CTL）反应。我们介绍了利用动态光散射和泽塔电位分析仪对疫苗纳米颗粒的流体动力学尺寸和表面电荷进行表征的方法，并提供了一种基于共聚焦显微镜的实验流程，用于分析纳米颗粒介导的抗原向引流淋巴结的递送情况。此外，我们展示了一种新的活体生物发光成像技术，该技术通过将表达荧光素酶的抗原特异性 CD8+ T 细胞过继转移至受体小鼠，随后进行纳米颗粒疫苗接种，从而实现对 CTL 扩增和迁移模式的无创、实时监测。我们还描述了四聚体染色及外周血单个核细胞的流式细胞术分析方法，用于对接受纳米颗粒疫苗接种的小鼠体内内源性 T 细胞反应进行长期定量评估。

引言

传统的疫苗研发主要采用试错法的经验性方法。然而，随着近年来大量生物材料的发展以及免疫激活分子决定因素的发现，现在已有可能基于病原体提供的生物物理和生化信号，理性设计疫苗制剂1,2。特别是，多种颗粒型药物递送平台已被研究作为疫苗载体，因其可同时负载亚单位抗原和免疫刺激剂，保护疫苗组分免于降解，并增强其向淋巴结（LNs）内抗原呈递细胞（APCs）的共递送，从而最大化免疫刺激与激活效果3-5。在本报告中，我们描述了一种“模拟病原体”的纳米颗粒系统——层间交联多层囊泡（ICMVs）的合成方法。该系统此前已被证明是一种高效的疫苗平台，可在全身和黏膜组织区室中诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和体液免疫应答6-9。特别是，与使用传统佐剂（例如，铝盐和Montanide）相比，ICMV疫苗接种显著提高了针对疟疾抗原的血清IgG水平7，并在小鼠模型中对肿瘤细胞和病毒感染挑战诱导出强效的CTL应答9。在此，以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒系统，我们介绍了疫苗纳米制剂的表征方法，包括粒径与zeta电位测定，以及利用冷冻组织切片的共聚焦成像技术追踪颗粒向引流淋巴结（dLNs）的转运过程7。此外，我们展示了一种基于整体动物成像的方法，用于分析在过继转移表达荧光素酶的抗原特异性CD8+ T细胞后，小鼠体内CTL应答的扩增情况9,10。最后，我们描述了通过四聚体染色外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，用于纵向定量评估纳米颗粒疫苗接种小鼠体内源性T细胞应答6,9。

ICMVs 是一种基于脂质的纳米颗粒制剂，通过将简单脂质体可控融合成多层结构而合成，随后通过二硫醇交联剂对脂质层内马来酰亚胺功能化的磷脂头部基团进行化学交联，从而实现化学稳定。6合成ICMV后，可取少量纳米颗粒用于测定粒径和zeta电位（即， 使用动态光散射（DLS）系统和zeta电位分析仪测定颗粒的表面电荷。DLS通过测量颗粒悬浮液中光散射的变化，可确定颗粒的扩散系数及其流体动力学尺寸。11实现批次间合成颗粒大小的一致性至关重要，因为颗粒大小是影响疫苗颗粒向引流淋巴结（dLNs）淋巴转运及其被抗原呈递细胞（APCs）后续摄取的关键因素之一。12,13此外，通过测量施加电流时颗粒的移动速度，可获得zeta电位，从而确定颗粒的电泳迁移率及颗粒表面电荷。11确保颗粒的Zeta电位值一致非常重要，因为颗粒表面电荷决定了胶体稳定性，这直接影响颗粒在储存期间及储存后的分散性。 体内 给药14,15为了追踪颗粒在引流淋巴结（dLNs）中的定位，可使用所需的荧光染料对ICMVs进行标记，包括脂溶性染料和共价标记的抗原。免疫后，可在不同时间点处死小鼠，切除dLNs，进行冷冻切片，并通过共聚焦显微镜分析。该技术可实现对纳米颗粒疫苗载体及抗原向dLNs淋巴引流过程的可视化观察。此外，组织切片还可使用荧光标记的抗体染色，以获取更多相关信息，例如与抗原相关的细胞类型以及生发中心的形成情况，正如我们先前研究所示。7.

一旦粒子合成得到优化并确认其向dLNs的转运后，验证其诱导免疫应答的能力至关重要。 体内 CTL 扩增。为了分析纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性 CD8+ T 细胞的诱导情况，我们采用了一种模型抗原——卵清蛋白（OVA），以 OVA257-264 肽（SIINFEKL）免疫优势CD8+ T细胞表位，可用于初始疫苗开发中抗原特异性T细胞反应的详细免疫学分析16,17特别是为了研究抗原特异性CD8+ T细胞扩增与迁移的动力学，我们通过将表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠（Luc）与OT-I转基因小鼠杂交，构建了一种双转基因小鼠模型。OT-I小鼠拥有T细胞受体（TCR）特异性识别SIINFEKL抗原肽（与H-2Kb分子结合）的CD8+ T细胞。b）。从这些OT-I/Luc小鼠中可分离出表达荧光素酶的OT-I CD8+ T细胞，并制备用于过继转移至未致敏的C57BL/6小鼠。接种后，若使用含OVA的纳米颗粒成功免疫，将导致转移的T细胞扩增，可通过活体动物成像系统监测生物发光信号来追踪该过程。9,10该非侵入性全身成像技术此前已与其他病毒或肿瘤抗原联合使用18-20，以纵向揭示T细胞在淋巴组织中扩增及其向外周组织扩散的过程。

除了分析过继转移的抗原特异性CD8+ T细胞外，还可通过肽-主要组织相容性复合体（MHC）四聚体检测21来评估疫苗接种后的内源性T细胞应答。该检测利用由四个携带荧光标记的MHC-I类分子组成的肽-MHC四聚体复合物，每个分子均负载有肽表位，可特异性结合T细胞受体（TCR），从而以抗原特异性方式标记CD8+ T细胞。肽-MHC四聚体检测可用于终末解剖研究，以鉴定淋巴组织及外周组织中的抗原特异性CD8+ T细胞；也可用于纵向研究，通过系列采血获得的外周血单个核细胞（PBMCs）进行检测。在使用肽-MHC四聚体对淋巴细胞进行染色后，通过流式细胞术分析，可进一步详细表征细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的表型，或定量其在CD8+ T细胞中所占比例。

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方案

本方案中描述的所有实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，并依照既定的政策与指南进行。

1. 共载蛋白抗原和佐剂分子的ICMV合成与表征

  1. 以1:1的摩尔比混合1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺]（MPB）溶于氯仿中，保持每批总脂质含量为1.26 µmol（即， 500 µg DOPC 和 630 µg MPB 置于一个 20 ml 玻璃小瓶（直径 = 28 mm，高度 = 61 mm）中。
  2. 添加脂溶性药物，例如单磷酰脂质A（MPLA）或脂溶性染料（例如， DiD）加入脂质溶液中，使其达到所需浓度。用高纯氮气吹扫以彻底去除有机溶剂，并将样品置于真空环境中过夜。
  3. 通过加入含有水溶性药物的200 µl 10 mM bis-tris丙烷（BTP，pH 7.0）缓冲液水合脂质膜例如， 蛋白质抗原）。在室温下每10分钟涡旋振荡10秒，持续1小时。
  4. 将玻璃小瓶中的内容物转移至1.5 ml微量离心管中，将样品置于冰水浴中，使用125 W/20 kHz探头式超声破碎仪，在40%强度下持续超声处理5分钟。
  5. 向每批样品中加入 4 µl 的 150 mM 二硫苏糖醇（DTT）（工作浓度为 2.4 mM），涡旋混匀，然后使用台式微量离心机短暂离心。
  6. 加入 40 µl 的 200 mM CaCl2 用移液器混匀（工作浓度为 33 mM）。将样品在 37 °C 下孵育 1 小时，以使含 MPB 的脂质层与 DTT 发生交联。
  7. 在 20,000 × g 条件下离心样品 15 分钟，弃上清，用 200 µl 去离子水重悬2O.
  8. 重复步骤 1.7，并在第二次加入 ddiH₂O 后再次离心2O 洗以去除 CaCl₂2，未反应的DTT以及上清液中未包封的货物材料。
  9. 配制 10 mg/ml 的 2 kDa 聚乙二醇-硫醇（PEG-SH）水溶液，使用双蒸水（ddiH₂O）作为溶剂。2O. 将每个ICMV样品重悬于100 µl PEG-SH溶液中，37 °C孵育30 min。
  10. 进行两次 ddiH2O 洗涤（步骤 1.7），并将最终的 ICMV 沉淀重悬于 PBS 中，4 °C 保存。使用前需混匀 ICMV 悬液，因为颗粒在长期储存后可能沉降至管底。
  11. 为表征颗粒，从每批ICMV中取出少量等分试样（约10%），分别加入总体积为1 ml的ddiH₂O中稀释2O. 将单个样品置于Zetasizer样品池中，使用动态光散射（DLS）及zeta电位测量系统，按照制造商提供的操作说明测定样品的粒径、多分散系数和zeta电位。

2. 使用共聚焦显微镜检测荧光标记的ICMV的引流淋巴结

  1. 制备负载荧光标记抗原和脂溶性荧光染料的ICMVs
    1. 根据制造商说明书制备荧光标记蛋白，例如用Alexa Fluor 555-琥珀酰亚胺酯标记的卵清蛋白。
    2. 为制备在脂质外壳中带有荧光标记的ICMVs，在制备脂质膜（步骤1.2）时加入脂溶性荧光染料（例如，1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青，DiD），其摩尔比例为总脂质的0.05%。在脂质膜水化（步骤1.3）时，使用含有荧光标记抗原的缓冲液，并按照步骤1.4–1.11完成ICMVs的合成。
  2. 在尾部基底皮下注射纳米颗粒
    1. 根据IACUC批准的动物实验方案，使用配备诱导室和可控气流蒸发器的3%异氟烷和1.5 L/min氧气流对小鼠进行麻醉。一旦小鼠失去意识，需在麻醉消退前迅速完成以下操作，以确保注射部位的良好可及性并尽量减少动物不适。或者，可使用合适贴合的鼻罩维持麻醉。若小鼠麻醉时间超过5分钟，术后应使用眼用润滑剂以减少角膜刺激。
    2. 用70%乙醇喷洒尾部基底以消毒并润湿毛发 分开湿润的毛发，暴露一小片可见皮肤，以便观察皮下针头位置。
    3. 制备含有预定剂量抗原和佐剂的颗粒注射悬液，每100 µl疫苗剂量溶于PBS中（例如，以往研究中使用每100 µl注射剂量含10 µg OVA和0.3 µg MPLA6,9）。
    4. 将颗粒悬液吸入带有27–29 G针头的注射器中，将针头斜面朝上插入尾部基底（距毛际约5 mm），注射50 µl颗粒悬液22。
    5. 等待数秒使压力平衡，防止过多回流，然后拔出针头。在尾部基底另一侧重复注射，以靶向双侧引流腹股沟淋巴结。
  3. 淋巴结冷冻切片的制备及共聚焦显微镜观察
    1. 根据IACUC批准的动物实验方案，采用CO2窒息法处死小鼠，随后诱导气胸。按照Bedoya23展示的方案取出腹股沟淋巴结，并将组织置于1 ml 4 °C PBS中洗涤去除血液。
    2. 用吸水纸吸去组织表面PBS，将组织置于预先装满OCT包埋剂至顶部的组织冷冻模具（10 x 10 x 5 mm3）中24。将组织块在液氮中速冻30秒。或者，可将组织块置于干冰上冷冻30分钟。将冷冻组织储存于-80 °C冰箱中。
    3. 在设定为-20 °C的恒冷切片机中切割5–10 µm厚的组织切片24。
    4. 如有需要，进行免疫荧光标记，并如先前所述方法24通过共聚焦显微镜观察组织切片。

3. 通过全动物成像监测纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性、表达荧光素酶的 CD8+ T 细胞的扩增

  1. OVA的分离257-264来自OT-I/Luc转基因小鼠的特异性表达荧光素酶的CD8+ T细胞
    1. 以 CO₂ 处死一只 OT-I/Luc 转基因小鼠2 根据IACUC批准的动物实验方案，通过窒息法处死动物并诱导气胸。以无菌方式打开腹腔，小心分离脾脏与胰腺之间的组织，摘取脾脏。23，置于5 ml 4 °C的PBS + 2% FBS中，转移至组织培养操作台。
    2. 将脾脏置于覆盖在50 ml锥形离心管上的70 µm尼龙筛网上（每次最多可处理3个脾脏）。使用3 ml注射器的推杆将细胞研磨通过筛网。
    3. 用 PBS + 2% FBS 清洗活塞和滤网，弃去洗涤液。将50 ml离心管中的总体积调整为每只脾脏10 ml，取少量细胞悬液用血细胞计数板进行计数，然后以300 × g离心10分钟。
    4. 使用市售的磁性阴性选择试剂盒，按照生产商说明书分离CD8+ T细胞群体。
    5. 用 PBS 洗涤细胞后，计数分离得到的 CD8+ T 细胞数量。为评估分离的 CD8+ T 细胞纯度，将约 20,000–30,000 个细胞与 20 µl 小鼠 CD16/32 抗体（0.025 mg/ml）在 4 °C 下孵育 10 分钟，随后加入 20 µl αCD8-APC 抗体（0.005 mg/ml），继续在 4 °C 的 PBS + 1% w/v BSA 中孵育 30 分钟。所有孵育步骤均在 4 °C 的 PBS + 1% w/v BSA 中进行。随后进行流式细胞术分析25.
  2. 分离CD8+ T细胞的过继转移及疫苗接种后其扩增的可视化
    1. 将分离得到的OT-I/Luc CD8+ T细胞通过尾静脉注射至幼稚型C57BL/6小鼠，细胞数量为1-10 × 10⁶个。5 通过尾静脉注射将细胞注入200 µl PBS体积中22 （第 -1 天）。考虑到 C57BL/6 小鼠的毛发和黑色皮肤斑块可能干扰生物发光信号，脱毛的白化 C57BL/6 小鼠是此类研究的理想选择。
    2. 一天后（第0天），按照之前所述方法（第2.2节）给予疫苗。
    3. 按每公斤小鼠体重150 mg的剂量，通过腹腔注射300 µl PBS溶解的荧光素酶底物（luciferin）。注射10 min后，用异氟烷（同步骤2.2.1）麻醉小鼠，利用活体成像系统（IVIS；参见Wilson）采集生物发光信号，持续5–10 min，以检测OT-I/Luc CD8+ T细胞。26 如需详细说明，请参见相关指南。根据纵向研究需要重复上述步骤。

4. 用于抗原特异性CD8+ T细胞分析的PBMC肽-MHC四聚体染色

注意：以下实验方案可使用经OT-I/Luc CD8+ T细胞过继转移的C57BL/6小鼠，或未经过继转移的C57BL/6小鼠进行。

  1. 在接种疫苗后的预定时间点，通过下颌下出血法从小鼠采集约 100 µl 血液（4–6 滴）27 加入到含有K涂层的试管中2加入EDTA并颠倒混匀数次以防止凝固。
  2. 将100 µl血液转移至微量离心管中，加入1 ml裂解缓冲液，孵育2至3分钟，以去除红细胞（RBCs）。在1,500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。如果沉淀仍呈红色（表明红细胞未完全去除），则用短暂孵育重复裂解步骤< 1 分钟）裂解缓冲液。
  3. 用1 ml FACS缓冲液（PBS + 1% w/v BSA）洗涤剩余的PBMCs，在1,500 × g离心5 min。
  4. 吸去上清液，将样品重悬于20 µl小鼠CD16/32抗体（0.025 mg/ml）中，以阻断非特异性和FcR介导的抗体结合。室温孵育10分钟。
  5. 将细胞从微量离心管转移至4 ml圆底FACS管中。加入20 µl H-2Kb 根据制造商说明书，向每个样品加入OVA四聚体-SIINFEKL-PE溶液，冰上孵育30分钟。
  6. 制备抗体混合液（例如， αCD8-APC、αCD44-FITC 和 αCD62L-PECy7 抗体（浓度分别为 0.005、0.005 和 0.002 mg/ml）。向每个实验样品中加入 20 µl，冰上孵育 20 分钟。通过使用上述指定浓度的每种荧光标记四聚体或抗体对细胞进行标记，制备单荧光素对照。
  7. 用FACS缓冲液洗涤2次，将最终的细胞沉淀重悬于含有2 µg/ml DAPI的FACS缓冲液中。细胞现在可用于流式细胞术分析（相关细节和示例见Scheffold）25).

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结果

ICMV 的合成步骤如图16所示。简而言之，在亲水性药物存在下，对含有任何亲脂性药物或荧光染料的脂质膜进行水化。加入二价阳离子（如 Ca2+），促使带负电荷的脂质体融合形成多层囊泡。加入二硫醇交联剂（如 DTT），使相邻脂质层上的马来酰亚胺功能化脂质“交联固定”，最后通过与巯基化 PEG 结构的反应淬灭残留的外部马来酰亚胺基团。每批样品可取少量直接用于质量控制检测，使用动态光散射（DLS）和zeta电位分析系统测定粒径、多分散系数和zeta电位。所得颗粒相对均一，包载卵清蛋白（OVA）的颗粒平均粒径为 130 ± 20 nm，多分散系数为 0.22 ± 0.02，zeta电位为 -54 ± 3 mV（图1B 和 1C）。以颗粒干重计，典型产率约为 50%6。

利用上述方案，可将荧光标记的蛋白抗原和荧光脂溶性染料共同装载到ICMVs中，从而实现抗原和纳米颗粒在体内的递送过程可视化。in vivo。为比较可溶性抗原与ICMVs中抗原递送...

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讨论

本文提供的实验方案描述了一种新型脂质基纳米颗粒系统（称为ICMVs）的合成与表征，并阐述了验证基于纳米颗粒的疫苗制剂诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应有效性的过程。ICMV的合成完全在水相条件下完成，相较于其他常用的聚合物纳米颗粒系统（例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物颗粒），这是一个显著优势，因为后者通常需要使用有机溶剂进行制备，往往导致蛋白质抗原抗原性的丧失29,30。此外，ICMVs具有高度稳定性，并能够包封疏水性和亲水性分子6，从而可实现抗原与佐剂共递送至抗原呈递细胞（APCs）内的同一细胞内区室31,32。本文以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒，概述了以下实验步骤：（1）纳米颗粒的合成与表征；（2）纳米颗粒向引流淋巴结（dLNs）迁移的验证；以及利用（3）非侵入性生物发光成像技术和（4）外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色法检测抗原特异性CD8+ T细胞反应的诱导情况。

确保纳米颗粒在不同批次间的合成具有一致性至关重要，尤其是粒径和表面电荷，因为这些因素会显著影响纳米颗粒在体内的淋...

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披露

Perkin Elmer 提供了本文发表期间产生的出版费用。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院资助项目1K22AI097291-01以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心资助奖项UL1TR000433支持。我们还感谢麻省理工学院的Darrell Irvine教授和弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Matthias Stephan教授在疫苗纳米颗粒及OT-I/Luc转基因小鼠的初期工作中所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 共载蛋白抗原与佐剂分子的ICMV合成与表征
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]（钠盐）（MPB）Avanti Polar Lipids, INC.870012
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti Polar Lipids, INC.850375
单磷酸脂质A（合成）（PHAD™）（MPLA）Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 ml 玻璃小瓶Wheaton0334125D
Symphny 真空干燥箱VWR414004-580
卵清蛋白（OVA）Worthington3054
双-Tris丙烷（BTP）FisherBP2943
Q125 超声波破碎仪（125 W/20 kHz）QsonicaQ125-110
二硫苏糖醇（DTT）FisherBP172
2 kDa 巯基化聚乙二醇（PEG-SH）Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer 比色皿MalvernDTS1070
2. 利用共聚焦显微镜检测荧光标记ICMV的淋巴结引流
1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青-4-氯苯磺酸盐（DID）Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-琥珀酰亚胺酯（AF555-NHS）Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT冷冻包埋介质 VWR25608-930
组织冷冻模具VWR25608-922
3. 通过整体动物成像监测纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性、表达荧光素酶的CD8+ T细胞扩增
C57BL/6小鼠Jackson000664
白化C57BL/6小鼠Jackson000058
OT-1 C57BL/6小鼠Jackson003831
70 μm 尼龙滤网BD352350
EasySep™ 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒StemCell19853
IVIS® 整体动物成像系统Perkin Elmer
4. 外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色用于抗原特异性CD8+ T细胞的流式细胞分析
K2EDTA管BD365974
ACK裂解缓冲液Life TechnologiesA10492-01 
抗CD16/32 Fc阻断剂Ebioscience14-0161-86
H-2Kb OVA四聚体MBLTS-5001-1C
抗CD8-APCBD553031
抗CD44-FITCBD553133
抗CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）SIGMAD8417-10MG
CyAn流式细胞仪Beckman Coulter
FlowJo软件FlowJo

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