高通量检测人中性粒细胞胞外DNA释放及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的定量分析 体外

摘要

本文介绍了高通量检测方法，这些方法联合使用可有效定量人中性粒细胞中NET的释放。

摘要

中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞。中性粒细胞会最先到达感染部位。中性粒细胞进化出多种抗微生物机制，包括吞噬作用、脱颗粒以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成。NETs由DNA骨架构成，其上结合有组蛋白以及多种颗粒标志物，包括髓过氧化物酶（MPO）和人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）。NET的释放是一个主动过程，涉及中性粒细胞特征性的形态学变化，最终导致其DNA被排出至胞外空间。NETs在抵御微生物感染中至关重要，但NETs的不受控释放已被认为与多种疾病相关。为了进一步了解NET形成的临床意义及其机制，迫切需要可靠的工具来实现NET的定量检测。

此处介绍了三种可用于评估人中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的方法。 体外第一种方法是利用膜不通透性DNA结合染料，通过高通量检测人中性粒细胞释放胞外DNA的实验。此外，还描述了另外两种方法，可通过定量检测NET特异性的MPO-DNA和HNE-DNA复合物来测定NET的形成。这些基于微孔板的方法相结合，为高效研究人中性粒细胞NET形成的机制与调控提供了有力工具。

引言

中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成是中性粒细胞抵抗病原体的一种新机制。¹ NET的核心成分为细胞核DNA。¹ 这种DNA网络与中性粒细胞颗粒蛋白和组蛋白相结合。¹ NET形成的主要方式需要中性粒细胞死亡，其特征包括染色质去浓缩、颗粒膜和核膜消失、中性粒细胞弹性蛋白酶向细胞核转位、组蛋白瓜氨酸化，最终导致基于DNA的NET释放到细胞外。² NET能够捕获并杀灭多种微生物，是先天免疫防御武器库中的重要组成部分。然而，不受控制的NET形成已被证实与多种自身炎症性疾病相关。^3,4 尽管其重要性日益明确，目前对NET释放的机制及其调控仍知之甚少。

通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）而死亡的中性粒细胞，与凋亡或坏死的中性粒细胞不同。^3,5 释放NETs的中性粒细胞表现出若干NET形成的特征性特点。NETs中的DNA与颗粒成分相关联。¹ 髓过氧化物酶（MPO）和人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）在静息细胞中均位于初级颗粒内，但在NET形成过程中会转位至细胞核并与DNA结合。¹ MPO-DNA和HNE-DNA复合物为NETs所特有，在凋亡或坏死的中性粒细胞中不存在。^1,3,5 染色质去浓缩是NETosis的另一典型特征。² NET的释放还需要肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）介导的组蛋白瓜氨酸化。⁶ 瓜氨酸化的组蛋白是已发生NET释放的中性粒细胞的标志性特征。⁶

本文介绍了三种方法，它们结合使用可为大规模高通量定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）提供优异的工具。第一种检测方法已在该领域广泛应用，经过不同改进后，可在微孔板体系中定量细胞外DNA的释放。第二和第三种检测方法则通过测定NET特异性的髓过氧化物酶-DNA（MPO-DNA）和人中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA（HNE-DNA）复合物，对NETs的存在提供确证。

方案

佐治亚大学机构审查委员会批准了本项涉及从健康志愿者采集外周血的人体研究（UGA# 2012-10769-06）^5,7,8。志愿者在采血前签署了必要的知情同意书。本文所开展的研究符合《赫尔辛基宣言》关于涉及人体受试者的医学研究的伦理准则。

1. 从人外周血中分离中性粒细胞（图1）

注意：有多种方法可以从外周血中分离中性粒细胞。以下方案提供了一种可行的方法。该方案可获得大量未活化的人中性粒细胞，这些细胞在外界刺激下能够释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。使用静脉穿刺从健康志愿者获取的 40 ml 全血。^7,9

1. 将20 ml血液分装到两个50 ml锥形管中。加入10 ml 6%右旋糖酐，轻轻混匀。
2. 静置20分钟后，将富含白细胞的上层液体转移至干净的50 ml锥形管中，注意不要吸到沉淀的红细胞，并用无菌PBS补至满管。
3. 以400 × g离心10分钟，将沉淀重悬于4 ml无菌PBS中。
4. 在两个15 ml锥形管中制备85%–80%–75%–70%–65%的五步Percoll梯度，每管上层分别加2 ml白细胞悬液。
5. 关闭刹车，以800 × g离心30分钟。
6. 收集位于75%/80%和70%/75%界面处的所有细胞（中性粒细胞）。
7. 用PBS洗涤细胞两次（350 × g，10分钟，室温），并用血细胞计数板进行细胞计数。

2. 使用微孔板荧光仪测量细胞外DNA释放动力学

注意：该方法可利用96孔微孔板形式，通过检测膜不通透性DNA结合染料的荧光变化，来指示DNA的释放情况（图2）。

1. 将中性粒细胞悬浮于检测培养基（HBSS + 1% (v/v) 自体血清 + 5 mM 葡萄糖）中，调整细胞浓度至 2 × 10⁶ 个细胞/ml。
2. 加入终浓度为 5 µmol/L 的膜不通透性DNA结合染料，轻轻混匀。
3. 将人中性粒细胞悬液（50 µl/孔）分装至96孔黑色透明底微孔板中，确保检测培养基完全覆盖孔底。若未覆盖完全，可轻敲板壁以调整。
4. 将含有中性粒细胞的微孔板在37 °C预温10分钟。
5. 在此期间，用37 °C预热的检测培养基配制刺激物溶液，浓度为最终使用浓度的两倍。以人中性粒细胞加入100 nM佛波酯-豆蔻酸-乙酸酯（PMA）刺激4小时作为NET释放的阳性对照，以诱导最大程度的NET释放^5,8。PMA刺激4小时可确保NET释放达到最大，同时自发性NET形成保持在较低水平^5,8。
6. 设置微孔板荧光仪的检测参数（4小时，37 °C，激发波长530 nm，发射波长590 nm）。
7. 通过向每孔50 µl中性粒细胞悬液中加入50 µl刺激物溶液来启动刺激反应。在其中一个孔中加入0.5 µg/ml皂苷，用于测定最大DNA释放信号。
8. 将微孔板放入读板仪中，在37 °C下每2分钟检测一次荧光变化，持续4小时，检测过程中不进行振荡。
9. 数据分析时，计算随时间变化的荧光信号的归一化增长值。
   1. 从所有孔（包括含皂苷的孔）的终点荧光值中减去基线荧光值（图2A, B）。皂苷孔荧光信号的升高应为最高值，定义为"最大DNA释放"（图2A）。
   2. 通过将未知样品的荧光增加值除以最大DNA释放值，计算未知样品中DNA释放的百分比。
   3. 对重复孔的结果取平均值，并以"%最大DNA释放"的形式呈现（图2C）。

3. 通过 MPO-DNA 和 HNE-DNA ELISA 检测定量 NET 形成

注意：这些检测方法由本实验室改进（MPO-DNA）或建立（HNE-DNA），通过测定MPO-DNA和HNE-DNA复合物的水平来定量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。⁵

1. 将96孔高结合力ELISA板用捕获抗体（每孔50 μl）包被：抗MPO（1:2,000稀释）或抗HNE（1:2,000稀释），4℃孵育过夜。
2. 用PBS洗板3次（每孔200 μl），然后加入含5% BSA和0.1%人血清白蛋白的封闭液，室温（RT）封闭2小时（每孔200 μl）。再用PBS洗板3次。
3. 在96孔微孔板中，以每孔100 µl检测培养基接种中性粒细胞，细胞密度为每孔100,000个，并诱导NET形成。细胞孵育条件：37 °C，4小时。
4. 向中性粒细胞上清液中加入2 U/ml DNase，进行有限的DNase消化，充分混匀。室温放置。
5. 15分钟后加入11 µl 25 mM EGTA（终浓度2.5 mM）终止DNase反应，充分混匀。将上清液收集至洁净的微量离心管中，于室温以300 × g离心5分钟以去除细胞碎片。将上清液转移至新的洁净微量离心管中，冰上保存备用。
6. 使用一份预先制备的"NET标准品"。
   注意：NET标准品是由至少5个不同且独立的人类供体来源的PMA刺激中性粒细胞上清液经DNase消化后混合而成。
   1. 为长期使用同一标准品，应从每个单独供体收集并分装大量中性粒细胞上清液。例如，收集2 ml经DNase消化的PMA刺激中性粒细胞上清液，可分装为200份（每份10 µl），足够用于200块ELISA板。NET标准品的表征数据见图5。
   2. 用100 nM PMA刺激人中性粒细胞4小时，并按照步骤3.4–3.5对上清液进行DNase消化处理。
   3. 收集、混合、分装（每份10 µl）中性粒细胞上清液，并于-20 °C冷冻保存。
   4. 制备"NET标准品"时，取自至少五个不同供体的各一份冻存上清液解冻，混合后置于冰上。
   5. 解冻后的样品使用后即弃，下次实验使用新鲜分装样品。
   6. 用含EGTA的PBS将NET标准品进行1:2系列稀释。
7. 将经DNase1消化的样品（标准品及未知上清液）用含EGTA的PBS稀释20倍，分装至已包被捕获抗体的ELISA板中。
8. ELISA板于4 °C孵育过夜，随后用PBS洗板3次。
9. 加入检测抗体溶液（每孔100 µl）：辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体（小鼠来源，1:500稀释），避光孵育1小时。
10. 用PBS洗板4次后，加入TMB过氧化物酶底物（每孔100 µl），反应30分钟。出现蓝色表明存在过氧化物酶活性（即NET存在）。
11. 每孔加入100 μl 1 M HCl终止反应，蓝色溶液变为黄色（图5A）。
12. 使用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度值。
13. 数据分析时，计算MPO-DNA或HNE-DNA复合物的含量，并与NET标准品进行比较。
    1. 从所有样品中减去检测培养基的背景光密度值。
    2. 以稀释后的标准品吸光度值为横坐标（X轴），其相对NET含量为纵坐标（Y轴）绘制标准曲线（图5A）。
    3. 利用该标准曲线的非饱和范围建立趋势线（建议使用分析软件中的最佳指数拟合）（图5A）。该趋势线方程用于将OD值转换为NET的定量含量。
    4. 将未知样品测得的OD值代入步骤3.13.3所得的趋势线方程，计算出未知样品中NET含量占NET标准品的百分比（图5A）。
    5. 计算重复样本（三复孔）的平均值，最终数据以"MPO-DNA或HNE-DNA复合物含量（占标准品的百分比）"表示（图5C）。

结果

本文中的图示描述了中性粒细胞分离的方法、实验步骤，并展示了代表性结果及数据分析说明。图1显示了人中性粒细胞制备的连续步骤。本方案仅代表中性粒细胞分离的一种可能方法，可获得大量静息状态的中性粒细胞，这些细胞在受到刺激后能够释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。图2展示了基于荧光的DNA释放检测法的工作原理。使用荧光酶标仪，在96孔微孔板中动态监测人中性粒细胞DNA释放的动力学过程。图3解释了数据分析的每一步骤。首先，计算经皂苷（saponin）处理的中性粒细胞中的最大DNA信号值（图3A）。荧光强度的增加始终以最高荧光值与背景荧光水平之间的差值来计算（图3A），并对每个孔分别进行计算。示例展示了未受刺激或经PMA或P. aeruginosa（PAO1）激活的人中性粒细胞的代表性数据（图3B）。P. aeruginosa可诱导人多形核中性粒...

讨论

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）代表了中性粒细胞杀灭病原体的一种引人注目的新机制。¹ 尽管自发现以来的过去十年中，关于NETs的研究文献持续增长，但与其在生物学中的作用、形成机制及调控相关的若干重要问题仍不明确。必须开发适当的方法来检测这种非常独特的抗菌机制。本文描述了可用于高通量定量NETs的方法。第一种检测方法基于一种膜不通透性DNA结合染料的荧光动力学变化。该方法可提供大量关于中性粒细胞DNA释放斜率和速度的信息。这些信息对于研究NET形成前期的信号事件至关重要。而在孵育结束时进行的终点法检测DNA释放则会丢失所有此类动力学信息。基于细胞外DNA染料的检测方法并非NETs特异性的，它仅能测量DNA的释放。为了确认NETs的存在，目前广泛接受的方法是对形成NETs的中性粒细胞进行免疫荧光染色，并显示DNA与颗粒标记物（如MPO、HNE）或组蛋白的共定位。然而，免疫荧光数据的定量分析极为繁琐且具有主观性。

本文介绍了一种改良的ELISA检测方法，用于检测MPO-DNA复合物。同时描述了一种类似的ELISA检测方法，用于测定代表特定NET标志物的HNE-DNA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗人中性粒细胞弹性蛋白酶兔抗体  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x 包被
抗髓过氧化物酶抗体（兔源）	Millipore	07-496	1:2,000x 包被
DNase-1	Roche	10-104-159-001	消化使用浓度为 1 µg/ml
20 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
细胞死亡检测试剂盒 ELISA 抗DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon 微孔板分光光度计	Biotek
Gen5 一体化微孔板分析软件	Biotek		分析工具（ELISA）
Sytox 橙染料	Life Technology	S11368	终浓度 0.2%（体积比）
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	使用终浓度为 10 mM。
1 M 葡萄糖	Sigma		使用终浓度为 5 mM。
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash 版本 2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	终浓度使用 100 nM
ELISA 板	Greiner bio-one	655061
15 ml 锥形管	Thermoscientific	339650
50 ml 锥形管	Thermoscientific	339652
Percoll（pH 8.5–9.5）	Sigma	P 1644	氯化钠，Sigma，S7653-250G
葡聚糖	Spectrum	D1004
RPMI 1640 培养基	Corning Cellgro	17-105-CV
96 孔黑色板体透明底检测板	Costar	3603