孟加拉红光栓塞的共聚焦光学成像 体内单血管卒中模型

摘要

本文介绍了一种半侵入性光学显微技术，用于在活体小鼠的体感皮层中诱导玫瑰红光栓塞凝块。in vivo。文中详细描述了从光栓塞事件的诱导到成像操作及数据采集的整个成像过程的技术细节。

摘要

由于成像染料和光学技术的最新进展，体内成像技术的应用日益广泛，使得在完整动物体内观察细胞事件成为可能。此外，能够在体内诱导生理疾病状态（如脑卒中）进一步提升了该技术的实用性。本文所述技术可用于评估脑卒中后中枢神经系统（CNS）内细胞反应的生理变化，并可针对其他正在研究的病理状况进行相应调整。该技术通过在体内利用激光激发光敏染料玫瑰红（Rose Bengal），在单根血管中诱导局灶性缺血事件。

该视频方案演示了在小鼠体感皮层上方制备薄颅骨颅窗，用于诱导玫瑰红（Rose Bengal）光血栓事件，同时将对下方硬脑膜和脑组织的损伤降至最低。手术准备最初在解剖显微镜下进行，使用定制的手术/成像平台，随后将样本转移至配备倒置物镜适配器的共聚焦显微镜进行成像。本方案还展示了利用该技术获取的代表性图像以及中风诱导过程的时间序列图像。该技术的优势在于可在后续多天内对同一区域进行重复成像，从而实现纵向研究 体内 中风后病理过程的研究。

引言

本文所述技术可用于在完整小鼠体内诱导玫瑰 Bengal 光栓塞后，立即观察体内细胞的反应。玫瑰 Bengal（4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘荧光素）是一种光敏性染料，常用于在动物模型（小鼠和大鼠）中诱导缺血性脑卒中。通过尾静脉注射玫瑰 Bengal 后，利用 564 nm 激光透过变薄的颅骨进行照射，可诱导血栓形成，从而引发生理性的脑卒中¹。该方法最初由 Rosenblum 和 El-Sabban 于 1977 年描述，随后在 20 世纪 80 年代中期由 Watson 进行了改进^1,2。简而言之，玫瑰 Bengal 在绿色激发光（本实验中使用 561 nm 激光）照射下，产生大量活性氧，进而激活组织因子，启动凝血级联反应。凝血级联反应的激活最终形成缺血性病灶，其病理特征与临床脑卒中具有相关性³。

由于多种不同细胞类型（包括神经元、胶质细胞、内皮细胞以及免疫系统）之间的相互作用，脑卒中的病理生理过程十分复杂。选择最佳技术来研究特定的细胞过程需要综合考虑多个因素。实验技术大致可分为三类：in vitro（体外）、in vivo（体内）和in silico（计算机模拟），每种方法都有其优缺点。in vitro研究的主要缺点是将细胞从其天然环境中分离出来，因此可能无法重现完整活体动物中观察到的效应。i....

方案

注意：所有动物实验程序均经得克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校机构动物照护与使用委员会批准，并符合ARRIVE指南要求。

1. 皮层制备的麻醉

1. 将小鼠放入诱导室，使用2-3%异氟烷与氧气混合气体诱导麻醉。观察小鼠呼吸频率随麻醉诱导逐渐下降。轻捏小鼠足爪以判断其是否已达到可转移至鼻罩的程度。注意：麻醉深度是任何实验操作中的关键步骤 在体 准备和操作过程中应谨慎，避免诱发导致全脑缺血的程度。
2. 小鼠充分麻醉后，将其转移至手术/成像平台，将小鼠的鼻部置入鼻罩，并持续给予1-1.2%异氟烷以维持麻醉状态。确保小鼠仰卧于温度可控的加热垫上，以在整个后续操作过程中维持其体温（37°C ± 0.5°C）。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
3. 使用系统配备的尾夹或足夹式脉搏血氧仪监测小鼠的生理状态。检查呼吸频率是否维持在50-65次/分钟。确认心率保持在300至450次/分钟之间，血氧饱和度维持在97%-98%，以确保动物的长期存活。
4. 当小鼠被充分麻醉后，使用电动剪刀剃除颅骨区域的毛发，清除残留毛发后先用聚维酮碘擦拭，再用乙醇棉片消毒。重复此操作最多三次，以确保手术环境无菌。

2. 手术步骤

1. 将小鼠头皮彻底清洁并剃净后，在其头皮上做一个5 mm的切口，以暴露颅缝并定位前囟点（....

结果

本方法旨在通过尾静脉注射玫瑰 Bengal（Rose Bengal, RB）后，使用561 nm激光照射颅骨变薄区域，在动物模型（小鼠和大鼠）中诱导缺血性脑卒中。 图4 中的图像展示了照射区域在0、1、1.5和2分钟时单个血管内血栓形成的进展情况。在血栓形成之前，由于玫瑰 Bengal 自由流动，整个血管呈白色。当血管开始受到照射后，血管部分区域明显变暗，表明血栓形成已被诱导（1分钟和1.5分钟帧）。在完全闭塞后，血管内血栓前端（黑色区域）出现明显的玫瑰 Bengal 染料积聚（白色区域）。2分钟帧显示动脉已完全闭塞。

为了确认缺血性脑卒中的存在，可采用TTC染色法。TTC是一种常用染色剂，可通过健康组织中形成红色的甲臜TTC产物来检测脑梗死。无甲臜生成的区域（白色组织）提示为梗死区域。图5中标注框所示区域展示了两个不同动物在直径约80mm的血管内形成血栓后第1天和第5天所获得的典型病灶大小。图像分析使用平板扫描仪和ImageJ软件进行。可在ImageJ中划定感兴趣区域，以测量每只动物脑组织的脑卒中病灶体积。

讨论

将实验性脑卒中病理生理学研究从动物模型转化为人类应用一直面临诸多失败。然而，利用动物模型（如光化学血栓模型），有助于更深入地理解脑卒中的病理生理机制，并探索新的治疗策略，以在脑卒中后提供神经保护。光化学血栓模型所产生的小皮层梗死和微梗死在临床上与亚临床性或“隐匿性脑卒中”具有相关性^13-15，后者发病率较高，每年影响约美国人口的4%（约1100万人）¹⁶。隐匿性脑卒中不表现出较大面积脑卒中所常见的典型症状，例如偏瘫、感觉丧失或言语困难，这些症状常见于大脑中动脉（MCA）闭塞或短暂性脑缺血发作（TIA）¹⁷。此外，隐匿性脑卒中也不同于腔隙性脑卒中，后者由深部脑结构或脑干内单一支配动脉闭塞引起，临床上表现为运动、感觉或混合性神经功能缺损¹⁸。患有亚临床或“隐匿性脑卒中”的患者通常无明显外在症状，往往并不知晓自己曾发生过脑卒中。隐匿性脑卒中会导致认知功能的亚临床性下降，表现为记忆力减退、决策能力受损以及行为改变。随着时间推移，多次隐匿性脑卒中可导致临床上显著的记忆障碍，称为血管性痴呆或多发性梗塞性痴呆。然而，通过神经影像学检查可检测到隐匿性脑卒中引起的脑损.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
玫瑰红	Sigma	330000
异氟烷麻醉剂	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM 葡萄糖和 26 mM NaHCO3 (pH 7.4)。
[header]
设备
解剖剪刀	Bioindustrial Products	500-410
手术剪刀 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
杜蒙特高科技镊子 #5 型，直头	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Labjack 8X 8 平台	Optosigma Co	145-1110
立体定位仪耳杆固定器	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent 啮齿类动物麻醉机	DRE, Inc.	15001
Tech IV 异氟烷蒸发器	DRE, Inc.	34001
F 型空气罐	DRE, Inc	80120
Bain 回路呼吸管	DRE, Inc	86111B
Bain 管啮齿类动物适配器	DRE, Inc	891000
O2 氧气瓶减压阀	DRE, Inc	CE001E
啮齿类动物诱导室	DRE, Inc	15004C
Ethicon 6-0 丝线；18 英寸，带 P-3 针	Suture Express	1639G
物镜倒像光学适配器	LSM technologies
Foredom 双电压钻机 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm 钻头	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)