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方法文章

孟加拉红光栓塞的共聚焦光学成像 体内单血管卒中模型

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DOI：

10.3791/52794

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2015年6月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Structural Biology, The University of Texas Health Science Center San Antonio, 2School of Medicine, The University of Texas Health Science Center San Antonio, 3Cell & Tissue Imaging Center, St. Jude Children’s Research Hospital

本文内容

摘要

本文介绍了一种半侵入性光学显微技术，用于在活体小鼠的体感皮层中诱导玫瑰红光栓塞凝块。in vivo。文中详细描述了从光栓塞事件的诱导到成像操作及数据采集的整个成像过程的技术细节。

摘要

由于成像染料和光学技术的最新进展，体内成像技术的应用日益广泛，使得在完整动物体内观察细胞事件成为可能。此外，能够在体内诱导生理疾病状态（如脑卒中）进一步提升了该技术的实用性。本文所述技术可用于评估脑卒中后中枢神经系统（CNS）内细胞反应的生理变化，并可针对其他正在研究的病理状况进行相应调整。该技术通过在体内利用激光激发光敏染料玫瑰红（Rose Bengal），在单根血管中诱导局灶性缺血事件。

该视频方案演示了在小鼠体感皮层上方制备薄颅骨颅窗，用于诱导玫瑰红（Rose Bengal）光血栓事件，同时将对下方硬脑膜和脑组织的损伤降至最低。手术准备最初在解剖显微镜下进行，使用定制的手术/成像平台，随后将样本转移至配备倒置物镜适配器的共聚焦显微镜进行成像。本方案还展示了利用该技术获取的代表性图像以及中风诱导过程的时间序列图像。该技术的优势在于可在后续多天内对同一区域进行重复成像，从而实现纵向研究 体内 中风后病理过程的研究。

引言

本文所述技术可用于在完整小鼠体内诱导玫瑰 Bengal 光栓塞后，立即观察体内细胞的反应。玫瑰 Bengal（4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘荧光素）是一种光敏性染料，常用于在动物模型（小鼠和大鼠）中诱导缺血性脑卒中。通过尾静脉注射玫瑰 Bengal 后，利用 564 nm 激光透过变薄的颅骨进行照射，可诱导血栓形成，从而引发生理性的脑卒中1。该方法最初由 Rosenblum 和 El-Sabban 于 1977 年描述，随后在 20 世纪 80 年代中期由 Watson 进行了改进1,2。简而言之，玫瑰 Bengal 在绿色激发光（本实验中使用 561 nm 激光）照射下，产生大量活性氧，进而激活组织因子，启动凝血级联反应。凝血级联反应的激活最终形成缺血性病灶，其病理特征与临床脑卒中具有相关性3。

由于多种不同细胞类型（包括神经元、胶质细胞、内皮细胞以及免疫系统）之间的相互作用，脑卒中的病理生理过程十分复杂。选择最佳技术来研究特定的细胞过程需要综合考虑多个因素。实验技术大致可分为三类：in vitro（体外）、in vivo（体内）和in silico（计算机模拟），每种方法都有其优缺点。in vitro研究的主要缺点是将细胞从其天然环境中分离出来，因此可能无法重现完整活体动物中观察到的效应。in vivo技术能够更真实地模拟疾病状态，具有更高的转化意义。in silico通常指对疾病或细胞过程进行计算机建模，尽管该方法正越来越多地被用于研究潜在的药物相互作用等，但所获得的任何信息仍需在活细胞或组织中进行验证。

在实验室环境中，理想的卒中模型应表现出与人类群体中所见相似的病理特征。尽管人类卒中存在一些共同的生理特征，但根据所经历损伤类型的不同，也存在许多差异。人类卒中可表现为小血管或大血管闭塞、出血性病灶，以及导致不同梗死体积和不同病理机制的动脉-动脉或心源性栓塞。使用动物卒中模型的优势在于能够产生可重复的梗死，以模拟人类卒中的特征。最常见的动物卒中模型包括通过以下方法实现的动脉闭塞：大脑中动脉闭塞（栓塞法或血管内线栓法），用于模拟远端MCAO，以及光化学血栓形成模型。各种模型的优缺点已有其他文献综述（见4和5）。全脑缺血模型（MCAO）虽然操作相对简便，但与人类卒中相比，其相关性较低。此外，这些方法在诱导可重复的脑梗死病灶方面具有高度变异性。只要实验者能够良好地控制实验条件，光化学血栓形成模型则具有高度可重复性，这使其明显优于MCAO模型。然而，由于该模型会对微血管系统造成损伤，据报道其缺血半暗带极小，而该区域通常被认为细胞仍可挽救6,7。此外，在照射成像区域后，也可能诱发血管源性水肿和细胞毒性水肿的形成。尽管存在这些局限性，该技术仍为深入了解卒中后多种生理过程提供了新的视角8,9,10,11。

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方案

注意：所有动物实验程序均经得克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校机构动物照护与使用委员会批准，并符合ARRIVE指南要求。

1. 皮层制备的麻醉

  1. 将小鼠放入诱导室，使用2-3%异氟烷与氧气混合气体诱导麻醉。观察小鼠呼吸频率随麻醉诱导逐渐下降。轻捏小鼠足爪以判断其是否已达到可转移至鼻罩的程度。注意：麻醉深度是任何实验操作中的关键步骤 在体 准备和操作过程中应谨慎，避免诱发导致全脑缺血的程度。
  2. 小鼠充分麻醉后，将其转移至手术/成像平台，将小鼠的鼻部置入鼻罩，并持续给予1-1.2%异氟烷以维持麻醉状态。确保小鼠仰卧于温度可控的加热垫上，以在整个后续操作过程中维持其体温（37°C ± 0.5°C）。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
  3. 使用系统配备的尾夹或足夹式脉搏血氧仪监测小鼠的生理状态。检查呼吸频率是否维持在50-65次/分钟。确认心率保持在300至450次/分钟之间，血氧饱和度维持在97%-98%，以确保动物的长期存活。
  4. 当小鼠被充分麻醉后，使用电动剪刀剃除颅骨区域的毛发，清除残留毛发后先用聚维酮碘擦拭，再用乙醇棉片消毒。重复此操作最多三次，以确保手术环境无菌。

2. 手术步骤

  1. 将小鼠头皮彻底清洁并剃净后，在其头皮上做一个5 mm的切口，以暴露颅缝并定位前囟点（bregma）。
  2. 使用无菌棉签清除覆盖在颅骨表面的任何残留筋膜。
  3. 使用组织粘合剂将定制的不锈钢环（图1）粘附于顶叶皮层上方的颅骨表面，定位依据为前囟点的立体定位坐标：前后向 -1 至 -3 mm，侧向 2-4 mm。注意：通常在将环放置到骨面后约2分钟内胶水即可固化 。
  4. 将该环固定至立体定位仪夹持装置（图2），以稳定小鼠头部，防止成像过程中发生移动。
  5. 在手术级解剖显微镜下，使用转速可控的微型钻具（Meisinger 3.9 mm钻头）缓慢钻削颅骨，形成1-2 mm的区域，钻削过程中需确保该区域保持水平。可通过之字形路径实现此目的。为避免产热积聚，应将钻头速度设为低速，并频繁暂停操作以冷却。
  6. 当颅骨表面呈现光泽状时，改用手术刀片继续对颅骨进行减薄处理，仍采用相同的之字形路径，以保持减薄区域表面平整，便于逐层均匀去除颅骨。使用刀尖施加轻微压力，进行短小的线性刮削，逐次去除薄层骨组织。持续操作，直至在解剖显微镜下清晰可见皮层表面的血管结构。
  7. 若操作者在减薄过程中穿透或损坏颅骨，应立即实施安乐死，因可能已对下方皮层造成损伤。
    注意：小鼠颅骨厚度约为300 µm，由两层致密骨板（外层和内层）以及夹在两者之间的松质骨层构成。在5 mm直径的钻孔区域内，外层致密骨和大部分松质骨被去除，最终保留约50 µm厚的致密骨层（见图2B）。通过观察血管结构可确认最终保留的减薄颅骨厚度约为50 µm。因此，当减薄至此厚度时，颅骨仍然完整存在。

3. 显微镜设置

  1. 使用带有物镜倒置装置的倒置显微镜系统（常规、共聚焦或双光子系统）。注意：也可使用标准的正置显微镜，但限制因素是载物台与物镜之间的空间，可能需要对载物台进行改装以实现该配置。
  2. 将手术/成像平台固定在位于显微镜底座一侧的定制载物台上。注意：该平台采用实验室升降台（laboratory jack）制成，以便在物镜下方实现手术/成像平台的垂直移动。升降台安装在一个固定于四根圆柱形立柱的平板上。（见图2）。
  3. 将装有20倍物镜的物镜倒置装置置于颅窗上方。使用外部光源，通过显微镜目镜观察以定位颅窗，并将物镜对准成像区域。注意：成像区域可通过血管结构的存在来识别。
  4. 对于水浸物镜，由于成像过程中可能存在液体渗入颅腔的风险，应使用人工脑脊液（aCSF）（130 mM NaCl；30 mM KCl；12 mM KH2PO4；200 mM NaHCO3；30 mM HEPES；100 mM 葡萄糖）作为介质（图3）。

4. 荧光素红染料的制备、给药及脑卒中诱导

  1. 用人工脑脊液（aCSF）配制新鲜的 20 mg/ml 荼菁红溶液；给药前过滤并灭菌。混合后的荼菁红不得重复使用或储存，每次实验均需配制新鲜溶液。
  2. 在尾静脉注射 0.1 ml 荼菁红的同时，使用 561 nm 激光扫描颅窗，以确保溶液注射充分。注意：注射后约 5 秒内即可在脑血管中观察到荼菁红染料，整个目标血管应被完全填充。
  3. 在荼菁红染料充分注射后，根据血管直径（40–80 µm）选择适合形成血栓的血管，以确保特定病灶体积的可重复性。通过观察血流方向区分动脉与静脉：动脉血流由粗血管流向细血管，静脉则由细血管流向粗血管。注射荼菁红后可通过直接观察轻松实现区分。
  4. 调整显微镜设置如下：
    1. 增加驻留时间。注意：具体数值取决于所使用的显微镜系统。
    2. 将激光功率调至 100%。
    3. 以最大扫描速度采集时间序列图像，帧速率为每秒 1 帧 。
  5. 持续扫描小鼠，直至血管内形成稳定的血凝块。注意：通常在连续扫描 5 分钟内 即可实现（见图 4）。
  6. 使用荼菁红诱导血栓形成后，将小鼠从成像区域移回解剖显微镜下。小心移除颅骨上的不锈钢环，检查颅窗是否存在出血。若发生出血，应终止实验。
  7. 使用 6.0 单股缝合线缝合颅骨处的切口。沿缝合线涂抹抗生素软膏以预防感染。皮下注射布托啡诺（Buprenex，0.05 mg/kg），每 12 小时一次，连续三天，用于镇痛管理。
  8. 小鼠从麻醉状态取出后，置于恢复舱中，直至完全清醒并能自由活动。
  9. 将小鼠转移至清洁笼具中，以备后续实验观察。

5. 后续数日的纵向成像

  1. 在光栓塞术后数天内，采用以下方法进行纵向成像。
    1. 按照方法部分第1节所述，对小鼠进行麻醉。
    2. 在充分麻醉后，通过移除残留缝线重新打开头皮，暴露先前钻孔成像区域上方的皮肤。
    3. 使用无菌棉签去除颅骨表面残留的筋膜组织。
    4. 使用组织粘合剂将定制的不锈钢环（图1）粘附于先前成像区域上方的颅骨表面。
    5. 将该环固定至立体定位仪（图2）上，以稳定小鼠头部并防止成像过程中发生移动。
    6. 定位先前颅骨减薄区域下方的血管结构。通过尾静脉注射FITC-葡聚糖，确认先前诱导形成的血栓是否仍然存在。
    7. 使用6.0单股缝线关闭颅骨上方的切口。沿缝合线涂抹抗生素软膏以预防感染。皮下注射布托啡诺（Buprenex，0.05 mg/kg），每12小时一次，连续三天，用于镇痛。
    8. 将小鼠从麻醉状态中取出后，置于恢复舱内，直至其完全清醒并能自由活动。

6. 脑卒中诱导的验证（死后）

  1. 研究结束时，使用 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法验证每搏输出量，如图5所示。完整方法见文献12。

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结果

本方法旨在通过尾静脉注射玫瑰 Bengal（Rose Bengal, RB）后，使用561 nm激光照射颅骨变薄区域，在动物模型（小鼠和大鼠）中诱导缺血性脑卒中。 图4 中的图像展示了照射区域在0、1、1.5和2分钟时单个血管内血栓形成的进展情况。在血栓形成之前，由于玫瑰 Bengal 自由流动，整个血管呈白色。当血管开始受到照射后，血管部分区域明显变暗，表明血栓形成已被诱导（1分钟和1.5分钟帧）。在完全闭塞后，血管内血栓前端（黑色区域）出现明显的玫瑰 Bengal 染料积聚（白色区域）。2分钟帧显示动脉已完全闭塞。

为了确认缺血性脑卒中的存在，可采用TTC染色法。TTC是一种常用染色剂，可通过健康组织中形成红色的甲臜TTC产物来检测脑梗死。无甲臜生成的区域（白色组织）提示为梗死区域。图5中标注框所示区域展示了两个不同动物在直径约80mm的血管内形成血栓后第1天和第5天所获得的典型病灶大小。图像分析使用平板扫描仪和ImageJ软件进行。可在ImageJ中划定感兴趣区域，以测量每只动物脑组织的脑卒中病灶体积。

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讨论

将实验性脑卒中病理生理学研究从动物模型转化为人类应用一直面临诸多失败。然而，利用动物模型（如光化学血栓模型），有助于更深入地理解脑卒中的病理生理机制，并探索新的治疗策略，以在脑卒中后提供神经保护。光化学血栓模型所产生的小皮层梗死和微梗死在临床上与亚临床性或“隐匿性脑卒中”具有相关性13-15，后者发病率较高，每年影响约美国人口的4%（约1100万人）16。隐匿性脑卒中不表现出较大面积脑卒中所常见的典型症状，例如偏瘫、感觉丧失或言语困难，这些症状常见于大脑中动脉（MCA）闭塞或短暂性脑缺血发作（TIA）17。此外，隐匿性脑卒中也不同于腔隙性脑卒中，后者由深部脑结构或脑干内单一支配动脉闭塞引起，临床上表现为运动、感觉或混合性神经功能缺损18。患有亚临床或“隐匿性脑卒中”的患者通常无明显外在症状，往往并不知晓自己曾发生过脑卒中。隐匿性脑卒中会导致认知功能的亚临床性下降，表现为记忆力减退、决策能力受损以及行为改变。随着时间推移，多次隐匿性脑卒中可导致临床上显著的记忆障碍，称为血管性痴呆或多发性梗塞性痴呆。然而，通过神经影像学检查可检测到隐匿性脑卒中引起的脑损...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作的资助来源：AG007218 和 NIH F32 AG031606。

图像由美国德克萨斯大学健康科学中心（UTHSCSA）核心光学成像中心生成，该中心获得以下资助：UTHSCSA、美国国立卫生研究院癌症研究所 P30 CA54174（UTHSCSA 临床转化研究中心）以及美国国立卫生研究院老龄化研究所 P01AG19316。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
玫瑰红Sigma330000
异氟烷麻醉剂MWI Veterinary Supply088-076
Vetbond1469SB1469SB
aCSF 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM 葡萄糖和 26 mM NaHCO3 (pH 7.4)。
[header]
设备
解剖剪刀Bioindustrial Products500-410
手术剪刀 14 cmBioindustrial Products12-055
杜蒙特高科技镊子 #5 型，直头Bioindustrial ProductsTWZ-301.22
LabJack 132X80Optosigma Co123-6670
Labjack 8X 8 平台Optosigma Co145-1110
立体定位仪耳杆固定器Stoelting/Cyborg51654
Dispomed Labvent 啮齿类动物麻醉机DRE, Inc.15001
Tech IV 异氟烷蒸发器DRE, Inc.34001
F 型空气罐DRE, Inc80120
Bain 回路呼吸管DRE, Inc86111B
Bain 管啮齿类动物适配器DRE, Inc891000
O2 氧气瓶减压阀DRE, IncCE001E
啮齿类动物诱导室DRE, Inc15004C
Ethicon 6-0 丝线；18 英寸，带 P-3 针Suture Express1639G
物镜倒像光学适配器LSM technologies
Foredom 双电压钻机 110/120Foredom134.53
Meisinger 3.9 mm 钻头Meisinger(Ref#310 104 001 001 009)

参考文献

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