利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

摘要

本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。

摘要

表征胸腺定植前体细胞对于理解T细胞发育的胸腺前阶段至关重要，这对于为淋巴细胞减少症患者设计T细胞替代策略具有重要意义。我们通过两种互补方法研究了小鼠胚胎第13天和第18天胸腺中的胸腺定植前体细胞 体外 和 体内 技术，均基于“悬滴”法。该方法可通过CD45同种异型标记物区分E13和/或E18胸腺前体细胞，从而定植经辐照的胎鼠胸腺叶，并追踪其子代细胞。通过混合细胞群定植可分析前体细胞生物学特性中的细胞自主性差异，而仅使用单一细胞群定植则可消除可能存在的竞争性选择压力。定植后的胸腺叶还可移植至免疫缺陷的雄性受体小鼠体内，以进一步分析其成熟的T细胞子代。 在体，例如外周免疫系统的种群动态以及不同组织和器官的定植情况。胎鼠胸腺器官培养显示，E13时期的前体细胞能够迅速发育为所有成熟的CD3⁺ 细胞并产出了经典的γδ T细胞亚群，即树突状上皮T细胞。相比之下，E18期前体细胞的分化延迟，无法生成树突状上皮T细胞。对胸腺移植的CD3^-/- 小鼠实验进一步表明，E18期胸腺定植前体细胞随时间推移产生的成熟T细胞数量多于E13期对应细胞，而这一特征在短期胎儿胸腺器官培养中无法观察到。

引言

T淋巴细胞携带αβ或γδ T细胞受体（TcR），在特化的器官——胸腺中分化发育。发育完全的胸腺分为两个 distinct 区域：皮质区，在此胸腺前体细胞发育，并且TcR β链和α链基因发生功能性重排的胸腺细胞得以从程序性死亡中被拯救（该过程称为阳性选择）；以及髓质区，在此对自身配体反应过强的被选择性胸腺细胞被清除（阴性选择）^1,2。胸腺起源于第三咽囊的内胚层，随后被间充质细胞包绕³。自胚胎第12天（E12）起，造血前体细胞开始定植于胸腺，此后持续的前体细胞招募对于正常T细胞发育至关重要⁴。胸腺定植细胞经历一系列连续的发育阶段，这一过程由Notch信号通路的激活所启动并维持，当胸腺上皮细胞（TECs）表面表达的类似delta样配体4（delta like 4）与胸腺细胞相互作用时，触发Notch信号通路，从而精确调控发育程序⁵。

胸腺细胞发育始于所谓的 CD4^-CD8^- 双阴性（DN）阶段。根据 CD25 和 CD44 的表达情况，DN 胸腺细胞可进一步细分为 DN1（CD25^-CD44⁺）、DN2（CD25⁺CD44⁺）、DN3（CD25⁺CD44^-）和 DN4（CD25^-CD44^-）。CD24（HSA）和 CD117（c-Kit）可将 DN1 亚群进一步划分为 5 个亚群，其中 DN1a 和 DN1b 对应早期胸腺前体细胞（ETP）。胸腺细胞在 DN 阶段发生 TcR δ、β 和 α 链的重排，并经历前 TcR 选择（发生在 DN3 至 DN4 阶段）。随后，它们过渡至 CD4⁺CD8⁺ 双阳性（DP）阶段，在此阶段 TcR α 链发生重排，继而进行阳性与阴性选择。在此过程中，大多数胸腺细胞被清除，仅有少数（3–5%）最终发育为成熟的 CD4⁺ 或 CD8⁺ T 细胞。

淋巴细胞分化途径依次经历造血干细胞（HSC）阶段，生成多能祖细胞（MPP）和淋巴系偏向的多能祖细胞（LMPP），后者已丧失生成红细胞和巨核细胞的潜能⁶。LMPP在表型上定义为缺乏成熟血细胞标记物（谱系阴性，Lin^-），表达c-Kit（CD117）、Sca-1和Flt3/Flk2（CD135），且不表达可检测水平的白细胞介素（IL）-7受体α链（IL-7rα或CD127）。LMPP进一步分化为共同淋巴祖细胞（CLP）⁷，此时已失去生成髓系细胞的能力。CLP保留生成淋巴细胞（B细胞和T细胞）、自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞（DC）以及先天性淋巴细胞（ILC）的潜能，与LMPP的区别在于表达CD127且不表达高水平的Sca-1。

尽管胸腺定植前体细胞（TSP）的性质已受到广泛讨论⁸最近的研究明确表明，TSP在发育过程中会改变其表型、分化潜能和功能⁹我们进行了 体外 和 体内 通过FACS细胞分选技术分离E13（第一波）或E18（第二波）时期的胸腺定植前体细胞（TSP），并采用多种检测方法对其进行表征。将携带不同同种异型标记的等量E13和E18前体细胞接种至经辐照的胸腺叶中，进行胎儿胸腺器官培养（FTOC），可在相似的发育环境中追踪其子代细胞，揭示两类前体细胞之间存在的细胞内在特性差异。分别由E13或E18 TSP定植的胸腺叶可实现无竞争条件下的发育，从而避免两类前体细胞之间的选择性压力。 在体 移植定植的胸腺叶进一步表明，E13和E18 TSP的成熟后代也具有不同的生物学特性 体内第一波TSPs能快速产生T细胞，但生成的αβ和γδ T细胞数量较少。在后者中，我们检测到Vγ5Vδ1树突状表皮T细胞（DETC），这类细胞具有不变的TcR，可迁移至表皮并在伤口愈合中发挥功能，且仅在胚胎发育期间产生。¹⁰相比之下，第二波TSP产生大量TcR所需时间更长⁺ T细胞无法生成DETC。

方案

伦理声明：所有实验均根据法国农业部批准的巴斯德研究所伦理章程以及欧盟指南进行。所有外科手术均由接受过小型啮齿动物手术培训并获得法国农业部认证的操作人员执行。
注意：参见附录中的表1，其中展示了五步计划程序。

1. 胚胎的选择

1. 使用36只C57BL/6 CD45.2雌性小鼠、12只CD45.1雌性小鼠、12只C57BL/6 CD45.1雄性小鼠和12只C57BL/6 CD45.2雄性小鼠。将雌鼠与任一基因型雄鼠交配，可获得CD45.1/2或CD45.1胚胎，用于获取TSP；或获得CD45.2胚胎，用于获取受体胸腺叶。所有雄鼠需单独饲养。
2. 为获得用于E18期TSP分离的胚胎，于移植实验前21天下午6点将2只雌鼠与1只CD45.1雄鼠合笼。次日中午前检查阴道栓情况，并将发现阴道栓的雌鼠单独分离饲养。
3. 为获得用于被TSP定植的E14期胚胎，在移植实验前17天重复上述步骤（1.2），使用CD45.2雄鼠进行交配。
4. 为获得用于分离E13期TSP的胚胎，在移植实验前16天重复上述步骤（1.2），使用C57BL/6 CD45.1雄鼠进行交配。

2. 在水平层流罩下解剖胚胎

注意：嫁接实验前两天。

1. 通过颈椎脱位或在密闭饱和容器中持续通入 CO₂ 气体至少 5 分钟，处死怀孕雌鼠。通过确认心肺运动永久停止来确保动物死亡。用 70% 乙醇润湿腹部。
2. 沿腹部正中线做皮肤纵向切口，将皮肤向两侧拉开。用镊子和剪刀切开腹膜，避免接触消化道。取出双角子宫，并用剪刀将其与阴道分离。
3. 将子宫置于一个含有 40–50 ml DPBS 的 90 × 15 mm 培养皿中，并在每个胚胎的蜕膜之间横向剪开。
4. 使用精细尖头剪刀和精细镊子去除子宫的肌层膜，通过在胎盘和卵黄囊之间剪开取出胚胎，并移除包裹胚胎的羊膜。
5. 将胚胎转移至一个含有 HBSS + 1% 胎牛血清（FCS）的 90 × 15 mm 培养皿中。对于 E15 以后的胚胎，在进一步解剖前需用剪刀去除头部。

3. 胸腺的分离

1. 在双目放大镜下，将胚胎仰卧位（腹面朝上）放置于湿润的纱布垫上。
2. 用一把镊子沿胸骨软骨纵向插入，夹住并打开胸廓。使用弯头镊子将胸壁向一侧拉开，以暴露气管两侧的胸腺叶。
3. 用精细镊子轻轻夹住每个胸腺叶的下方，小心提起，将其置于含有1 ml HBSS + 1% FCS的培养皿中。利用两支1 ml注射器配26 G ⅜"针头分离胸腺叶，并去除周围结缔组织，注意不要损伤包膜。
4. 用3 ml HBSS + 1% FCS洗涤胸腺叶，以去除血细胞。
   注意：在E15之前，胸腺叶位于气管两侧，之后在中线融合形成双叶状器官。

4. 细胞悬液

1. 在含有1% FCS的HBSS中，使用安装在1 ml注射器上的两根26 G针头，在双目放大镜下分离肺叶。将细胞悬液通过尼龙网筛过滤。

5. 荧光抗体染色与细胞分选

注意：所有抗体均已预先滴定以获得最佳的细胞群定义效果（滴定值可能因抗体批次不同而有所变化）。

1. 将胸腺细胞（E13 或 E18）与 100 μl 生物素标记抗体混合液在 4 °C 下孵育 15–30 分钟，以标记谱系阳性细胞（抗 CD19、抗 Gr1、抗 Ter119、抗 NK1.1、抗 CD11c、抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD25）。
2. 为去除未结合的抗体，将细胞管在 280 × g 条件下以 4 ml HBSS + 1% FCS 离心 7 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于新鲜的 HBSS + 1% FCS 中。重复一次离心步骤。
3. 将 E18 生物素标记的细胞与链霉亲和素磁珠在 4 °C 下孵育 15 分钟，并用 HBSS + 1% FCS 洗涤细胞两次。将细胞重悬于 2 ml HBSS + 1% FCS 中。大多数 E13 胸腺细胞为谱系阴性，因此在细胞分选前无需进行 MACS 富集。
4. 按照制造商说明，将细胞通过 LS 柱。当全部细胞悬液进入柱子后，加入 2 ml HBSS + 1% FCS。收集柱子流出的 4 ml 液体，并在 280 × g 条件下离心 7 分钟以收集细胞。
5. 将经耗竭处理的 E18 细胞或总 E13 胸腺细胞沉淀重悬于 50 μl TSP 抗体混合液（抗 CD117 APC、抗 CD135 PE、抗 CD127 PECy7、抗 CD24 FITC、抗 CD44 APCCy7 和链霉亲和素 Pacific Blue）中，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
6. 用 4 ml HBSS + 1% FCS 洗涤细胞，然后将细胞重悬于含碘化丙啶的 1 ml HBSS + 1% FCS 中。
7. 使用配备 4 个激光器的流式细胞分选仪（FACS），将 TSPs Lin^-CD44⁺CD117⁺CD24^lowCD127⁺CD135⁺ 细胞分选至含有 200 μl 完全培养基 + 20% FCS 的 1.5 ml 离心管中。首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）信号对细胞按大小和颗粒度设门。排除死细胞（碘化丙啶染色阳性），去除双联体，并以指数刻度记录荧光信号。每个 E13 胸腺可获得约 100 个 TSPs，每个 E18 胸腺可获得约 600 个 TSPs。

6. 前体细胞定植 E14 胸腺叶：悬滴法

1. 在培养前3小时，对来自CD45.2胚胎的E14胸腺叶进行照射（30戈瑞 = 30 Gy）。
   注意：E14或E15胸腺叶已成功用作T细胞前体细胞的受体。使用妊娠后期的胸腺叶作为受体会因器官体积较大而导致过早坏死，而更早期的胸腺叶则发育不良，可能与上皮细胞未完全发育有关。
2. 将分选得到的TSP细胞离心，并重悬于培养基中（含10%胎牛血清、青霉素（50单位/毫升）、链霉素（50 µg/毫升）和2β-巯基乙醇（50 µM）的OPTI-MEM完全培养基），使35 μl体系中含有500个TSP细胞。
3. 在60孔Terasaki板中，每隔一个孔加入一滴35 μl的细胞悬液。
   注意：若将35 μl液滴置于相邻孔中，可能发生融合。
4. 将一个经照射的胸腺叶放置于每滴液滴表面。盖上Terasaki板，然后将板倒置，使细胞在重力作用下迁移至液滴的顶端极。
5. 轻轻敲击倒置板的上侧，促使胸腺叶滑向液滴顶端边缘。将倒置的Terasaki板置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育48小时。完成定植后，可将E14胸腺组织用于FTOC⁷培养，或移植至受体成年小鼠的肾包膜下⁸。

7. 胎儿胸腺器官培养

1. 在35 mm培养皿中加入3 ml完全培养基。将一张Isopore膜滤器漂浮于培养基上。用镊子将重建的胸腺叶放置在膜的边缘（每张膜上不超过8个胸腺叶）。
2. 将含有胸腺叶的培养皿放入一个90 mm培养皿中，同时放入一个无盖的35 mm培养皿，其中含有2 ml水，以维持最佳湿度。在37 °C、5% CO₂条件下孵育12天。

8. 无菌条件下肾包膜下移植

注意：肾实质由结缔组织形成的被膜包裹。被膜下区域富含血管和淋巴管，因而为移植物的发育提供了适宜的环境例如 胸腺叶、胰岛或新生心脏）。移植通常在左肾进行，因为左肾比右肾更易于操作。CD3^-/- 使用雄性小鼠作为受体，以避免因与Y染色体连锁的次要组织相容性抗原引起的移植物抗宿主反应，因为在E15之前难以进行性别鉴定。

1. 手术过程中对器械进行灭菌，并佩戴无菌手套。使用1 ml注射器，通过腹腔注射 Ketamine（10 mg/ml）与 Xylazine（1 mg/ml）溶于PBS的混合溶液对小鼠进行麻醉（每10 g体重注射50至100 μl）。通过检测趾间反射是否消失来确认麻醉效果。每只眼睛滴加一滴hydro-Optimune凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥。
   注意：该溶液应现配现用，并在注射前于室温下预热。麻醉作用可持续至少20分钟。整个手术过程中需持续监控麻醉深度。每20分钟可通过腹腔注射半剂量药物以延长麻醉时间。
2. 将小鼠置于水平层流罩下，侧卧于右侧。使用70%乙醇和10%碘伏皮肤消毒液对术区进行消毒。用镊子分开后肢关节上方约2 cm长度的毛发，剃除手术区域的毛发。
3. 使用手术刀在皮肤组织上做一道长约1.5 cm的切口，随后用剪刀剪开肌肉组织。对切口两侧施加轻微压力，使肾脏从腹腔中突出。
4. 用棉签蘸取生理盐水保持肾脏湿润。若暴露器官有困难，可用平头镊子轻轻牵拉附着于肾脏周围的脂肪组织。将棉签置于器官下方，以维持肾脏处于腹膜后腔外的位置。
5. 使用两把精细镊子在肾包膜上制造一个2–3 mm的小孔（注意避免触碰实质组织，以防出血）。在整个手术过程中，应持续保持暴露的肾包膜湿润。
6. 在保持肾包膜切口张开的状态下，小心地将移植物小叶插入肾包膜下，并沿包膜向极缘滑动移植物。每侧肾脏最多可植入6个小叶。
7. 将肾脏复位至腹膜后腔。使用单独外科结缝合肌膜，然后缝合皮肤。用10%聚维酮碘溶液湿润伤口。将小鼠置于37 °C加热垫上。
8. 持续观察移植小鼠，直至其完全从麻醉中恢复，监测指标包括心率、呼吸及胡须运动，黏膜颜色，直至出现自主活动表明完全恢复。
   注意：建议在手术后立即以及术后连续两天进行肌肉注射镇痛剂（布托啡诺，0.1 mg/kg），以预防术后疼痛。
9. 将手术后的小鼠隔离饲养直至完全恢复。每隔一天检查一次伤口缝线，以确认并预防感染。采用本方案未观察到伤口感染的发生。
   注意：每周对CD3^-/-移植小鼠的外周血细胞进行分析，可通过CD45同种异型标记及T细胞谱系特异性抗体检测来源于E13或E18期前体细胞的胸腺来源细胞群（图3）。

9. 通过流式细胞术分析 TSP 后代

1. 将FTOCs逐个分离，以获得单细胞悬液（参见第4步实验方案）。
2. 使用含有识别CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3 Pacific Blue、Vγ5 FITC、Vδ1 PE抗体的抗体混合物对来自各个叶的单细胞悬液进行染色，并按照第 5节所述条件孵育。
3. 将细胞重悬于HBSS + 1% FCS + 碘化丙啶中，然后在流式细胞仪中进行分析（结果见图2）。

结果

为了选择一种能够有效清除胸腺小叶内源性胸腺细胞、从而促进定植前体细胞最佳发育的方法，我们比较了经照射或5天脱氧鸟苷（d-Gua）处理后胸腺小叶在定植后T细胞重建的水平。结果显示，在培养第9天时两者无差异，但在第12天时，经照射处理的小叶中T细胞数量多于经d-Gua处理的小叶。因此，在胸腺定植后获得T细胞发育方面，照射处理优于d-Gua处理图1）。为了研究E13和E18期TSP的发育潜能，我们将等量的这两种前体细胞混合后植入经照射的E14胸腺叶中。结果显示，与E18 TSP相比，E13 TSP产生的胸腺细胞和双阳性（DP）细胞较少；但相反的是，E13 TSP能够生成DETC以及更高频率的CD3⁺ 成熟细胞（图2）。为了分析 体内 E13和E18 TSP潜能的评估中，将定植了每种类型前体细胞的胸腺叶移植至CD3小鼠的肾包膜下^-/- 受体。结果表明，与FTOC结果一致，E13 TSP产生T细胞的速度快于E18前体细胞，但循环T细胞的数量显著较低（图3).

讨论

分析T细胞分化的两种主要检测方法 离体最近报道的方法是将造血祖细胞与表达Notch1配体（delta like 1或4）的骨髓基质细胞OP9进行共培养。¹²该二维检测方法操作简便、效率高且灵敏，可实现单细胞水平的分析。然而，它既不能支持T细胞发育超越双阳性（DP）阶段，也无法生成γδ型表皮内T细胞（DETC）。¹³两者均需要与胸腺上皮直接相互作用。

FTOC 已长期用于分析 T 细胞发育³。该实验的主要优势在于能够生成所有成熟的 T 细胞区室，这一特性得益于胸腺细胞与胸腺上皮之间高效的三维相互作用。本文中我们测试了两种目前用于耗竭内源性胸腺细胞的方法，以实现外源前体细胞的有效定植。电离辐射和脱氧鸟苷处理均能有效耗竭发育中的胸腺细胞。然而，只有经辐射处理的胸腺叶能够在较长时间内维持 robust 的 T 细胞发育，提示 d-Gua 处理可能同时影响了上皮区室的某些组分。采用“悬滴法”使外源前体细胞定植于胚胎期胸腺叶。在竞争条件下，将两种细胞群体共同定植于经辐射处理的胸腺叶，可检测到不同细胞自主的生物学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
90 × 15 mm 和 35 × 15 mm 塑料组织培养培养皿。	TPP	T93100/T9340	取样
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm 注射器配针头	BD Plastipak	300015	细胞悬液
尼龙网筛布，已灭菌，50/50 毫米片状	SEFAR NITEX	03-100/32	细胞过滤
70% 乙醇	VWR	83801.36	无菌操作
聚维酮碘 10%（贝塔碘）	MEDA Pharma	314997.8	无菌操作
氯胺酮 100 mg/ml（储备液）	MERIAL		麻醉剂
PBS 中的赛拉嗪 100 mg/ml（储存液）	Sigma	X1251-1G	麻醉剂和肌肉松弛剂
布托啡诺 0.3 mg/ml 储备液	AXIENCE		阿片类镇痛药
眼科凝胶（0.2% 环孢素）	Schering-Plough 动物保健		眼部防护
DPBS (+ CaCl2，MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	分离胚胎
HBSS Hanks' 平衡盐溶液（+ CaCl）2，MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	以洗去血液并解剖胚胎
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	培养基
胎牛血清	EUROBIO	CVFSVF00-0U	培养基添加剂
青霉素和链霉素	GIBCO Life Technology	15640-055	培养用抗生素
2-巯基乙醇	GIBCO Life Technology	31350010	培养基添加剂
LEICA MZ6 体视显微镜	LEICA	MZ6 10445111	眼用W-Pl10x/23
冷光源灯	SCHOTT VWR	KL1500 紧凑型	两根鹅颈式光纤适配器
硅弹性体	World Precision Instruments	SYLG184	解剖垫
圆形带孔勺	Fine Science Tools	10370-18	解剖工具
精细虹膜剪	Fine Science Tools	14090-09	解剖工具
万纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	15018-10	解剖工具
镊子：Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	解剖工具
2 对精细的直头钟表匠镊子’ Dumont #5 镊子，11 厘米，精细尖端。	Fine Science Tools	11295-20	解剖工具
6-0 C-3 3/8c 带针聚酰胺缝线	ETHICON	F2403	用于缝合
持针器	MORIA/F.S.T.	12060-02	用于缝合
加热垫	VWR	100229-100	麻醉期间维持小鼠体温
膜式 Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	用于 FTOC
Terasaki 60 孔板	FISHER	1x270 10318801	悬滴法
无菌纱布敷料 7.5 x 7.5 cm	Hydrex	11522	涂抹消毒液
荧光或生物素标记的抗体	BD Biosciences、Biolegend 或 e-Bioscience	克隆编号 见下表	细胞染色
MACS 柱/链霉亲和素磁珠	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	细胞耗竭
小鼠	查尔斯河实验室（CD45.1）和让维耶实验室  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 或 CD45.2	细胞与胸腺叶的来源
小鼠	CDTA Orlé法国	CD3ε 基因敲除 CD45.2	嫁接实验