在脑切片检测轴突本地化mRNAs的高空间分辨率原位杂交

摘要

RNA 原位杂交 （ISH） 能够使细胞和组织中的 RNA 可视化。在这里，我们展示了如何将 RNAscope ISH 与免疫组织化学或组织学染料相结合，成功地检测小鼠和人脑切片中定位于轴突的 mRNA。

摘要

的mRNA经常局限于脊椎动物轴突和当地翻译所需的轴突寻路或在开发和维护，修理或神经变性postdevelopmental周期分支。高通量分析最近透露，轴突有一个更加动态和复杂的转录于此前预期。这些分析，但大多已在培养的神经元轴突的地方可以从躯体树突状车厢被孤立进行。这几乎是不可能实现这种隔离在体内整个组织。因此，为了验证的mRNA和它们的功能关联的募集在整体动物，转录组分析，最好应与技术，允许mRNA的原位可视化相结合。最近，已经开发出新颖的ISH技术，检测的RNA在单分子水平。当分析mRNA的亚细胞定位，这是特别重要由于本地化的RNA通常出现在较低的水平。在这里，我们描述的轴突本地化的mRNA使用一种新的超灵敏RNA原位杂交技术检测两个协议。使用荧光免疫组织化学和组织学染料，以验证ATF4 mRNA的招募到轴突在体内成熟小鼠和人的大脑我们结合RNAscope ISH与轴突染液。

引言

轴突mRNA的招聘和本地翻译的轴突能够在一个时间和空间的方式急响应¹到胞外刺激。轴突内蛋白合成被最好地理解在神经发育的上下文中，其中它在生长锥行为^2-8关键作用，轴突寻路^9-11和逆行信令^12,13。但到目前为止很少有关于轴突蛋白合成后发育神经元的功能意义时，轴突mRNA和核糖体水平都大大降低^14,15。成熟脊椎动物轴突长期以来被认为是不活动的平移^16。然而，最近的研究表明，本地翻译病理状态下重新激活在成熟轴突。例如，mRNA的一个子集被招募到再生轴突以下神经损伤和轴突内蛋白质合成所需的这些轴突¹⁷的正确再生。此外，集团公顷■证明特异mRNAs被招募到轴突后局部暴露于阿耳茨海默氏病的肽_Aβ1-42，和转录因子ATF4的本地翻译需要从轴突传播的_Aβ1-42的神经变性影响神经元胞体^18。最后，高通量分析已经表明成熟轴突具有更复杂和动态的转录比预期^18-21，特别是在病理状况。根据这些研究，一个高度敏感和特异的方法来检测在成年神经系统轴突本地化的mRNA是必要的。

许多关于基因招募和成熟轴突当地的翻译工作已经对培养的神经元被执行。这是特别真实对于转录分析自专门培养方法存在允许从躯体树突隔室^18-20轴突的隔离。虽然这些研究都给予宝贵的插件飞行进入成熟轴突当地翻译的作用，问题是否培养的神经元忠实代表情况在体内或mRNA的招聘是轴突以培养条件的一种适应性反应仍然是开放的。很少有研究提供了表达的招聘证据成熟轴突在体内 。例如，所述转录物编码的嗅蛋白在成年感觉神经元²²轴突已经检测。含有的β肌动蛋白的mRNA的3'非编码区的转基因被输送到在周围和中枢神经系统的神经元的轴突在小鼠和发育阶段²³之后被局部翻译。拉明B2 mRNA定位到视网膜轴突Xenopues蟾蝌蚪和枯竭影响轴突发育后²¹轴突维修。干扰与细胞色素C氧化IV mRNA的编码的轴突运输改变鼠标的行为^24。最后，ATF4的mRNA在成年找到的小鼠和人类大脑中的_Aβ1-42的范围内xons诱导神经退行性变^18。

高通量转录分析已被证明是有用的，以确定在分离的轴突在体外的mRNA型材但对体内研究的限制，因为在整个组织轴突从未发现在隔离但间杂有神经元细胞体，神经胶质细胞和其它细胞类型。因此，这样的分析必须与确认的mRNA的亚细胞定位的成像技术相结合。 原位杂交（RNA ISH）的RNA可在细胞和组织中的特定RNA序列的检测和可视化。然而，原始的RNA原位杂交测定法是只适合识别的高丰度的RNA ^25，这是很少对轴突本地化的mRNA的情况。在过去的十年里越来越多的努力已投入开发新技术，使mRNA的检测在单分子水平 ^{25,26。例如，Singer和同事开发ISH探针来检测的mRNA在单细胞，包括在5个非重叠的荧光标记的50聚体（详情参见27）。上述技术和此处描述的之间的主要区别是，以后使用20双Z型结构（未线性）探针一般是针对〜1kb的兴趣确保特异性和低背景水平的RNA的区域。探针杂交，然后与最终荧光标记或缀合的酶，使显色反应，前置放大器和功率放大器序列。这些扩增步骤改善信噪比相比其他ISH技术28。在这里，我们将介绍使用RNAscope结合无论是与免疫细胞化学荧光或组织学染料使轴突复染两种协议。这两个协议都适合可视化ATF4 mRNA在成年莫轴突本地化使用和人类大脑。}

方案

所有动物的程序批准了哥伦比亚大学的IACUC和护理和使用实验动物适用的准则随访。注意:准备用于在无RNase或DEPC处理水的ISH程序的所有缓冲区。这个建议并不是严格必要的ISH已经完成之后，但它被认为缓冲器仍然制备蒸压双蒸水和/或通过过滤消毒。

1.检测ATF4基因定位于胆碱能轴突使用荧光成年小鼠大脑中的原位杂交（FISH），其次是免疫组化

1. 对于多聚甲醛固定冷冻大脑切片样品制备
   1. 在下面的例子，从准备冷冻固定老鼠大脑切片。
      1. 简单地说，牺牲9个月大的小鼠麻醉氯胺酮（100毫克公斤^-1体重）和甲苯噻嗪（10毫克公斤^-1身体weigHT），随后加入4％多聚甲醛的PBS穿心输注（pH 7.4）中。
      2. 24小时在^4℃取出大脑和定位后在4％多聚甲醛
      3. 固定后，24小时在^4℃洗涤样品在PBS洗三次并cryoprotect在30％蔗糖的PBS（pH 7.4）中
      4. 在OCT中嵌入大脑冷冻化合物，串联部分中，在20微米在恒冷切片机和安装在聚-D-赖氨酸处理的显微镜载玻片。保持大脑切片在^-20℃直到使用。
   2. 除去从冰柜和风干多聚甲醛固定的脑切片在室温30分钟。
   3. 用1×PBS洗涤三次。
   4. 在通风橱中，重新修复脑切片20分钟，用4％多聚甲醛在室温。
      注:警告:4％多聚甲醛是有毒的，必须被处理和丢弃的适当以下安全协议。
   5. 用1×PBS洗涤三次。
   6. 脱水的大脑切片。
      1. 制备50％，75％和100％乙醇溶液。
      2. 沉浸在50％乙醇载玻片5分钟，室温。
      3. 沉浸在75％的乙醇载玻片5分钟，室温。
      4. 沉浸在100％乙醇玻片5分钟，室温。
      5. 沉浸在新鲜的100％乙醇载玻片5分钟，室温。注:或者，幻灯片可以存储在100％的乙醇，在^-20℃下长达1个月。
2. FISH检测其次是利用免疫组织化学热诱导抗原/ RNA揭露
   1. 在开始之前准备好所有必需的材料:
      1. 热火杂交炉至^40℃，将装有蒸馏水的盘在烤箱创造湿润的环境。
      2. 取一个滑动箱并放置浸泡在蒸馏水内加湿滑动箱纸巾。放置在杂交炉滑动箱。
      3. 从冰箱中取出探针（消极和靶探针），在杂交烘箱加热它们10分钟。让探针冷却道北，RT。
      4. 平衡的扩增试剂的AMP 1-4（包括在荧光复合试剂盒）于RT。
      5. 制备抗原修复液:10mM柠檬酸钠（pH值为6），0.05％吐温20。注意:溶液可以储存在室温无限期和用于将来的染色。
      6. 制备1×洗涤缓冲液稀释在无RNase或DEPC处理水的50倍原液（包含在荧光复合试剂盒）。
         注:1×洗涤缓冲液可以储存在室温下1个月，用于将来的染色。 50X洗涤液可能沉淀。如果是这样，在制备1×溶液之前^40℃下进行10分钟热的50x洗涤缓冲液。
   2. 除去从100％的乙醇和风干载玻片5分钟，室温。
   3. 制备含有50毫升抗原修复液的科普林缸。沉浸在抗原修复液的幻灯片和煮沸他们在微波炉中加热10分钟。
      注:或者水平的地方在滑动100毫米直径的圆玻璃盘含有100ml检索溶液。
      1. 填满的1L烧杯用蒸馏水，并将其放置在微波炉。
         注:执行时，揭露水会"缓冲"的热量。
      2. 放置在微波炉内抗原修复溶液的幻灯片。煮沸滑动以高功率5分钟。样品已停止沸腾后，立即再次加热幻灯片在高功率额外的5分钟。
      3. 冷静下来的幻灯片在RT。
         注:关键步骤:沸腾持续时间和过程应该由用户来确定，这取决于微波特性。越快沸腾开始越高溶液蒸发的可能性。在这种情况下，建议样品煮沸的时间较短的两倍以上，完成10分钟共揭露时间。相反，如果在中等或低功率进行加热，揭露可进行10分钟进行一次。但是，如果样品不开锅continuously代表总共约10分钟，这可能会导致无论是靶RNA和蛋白质部分去掩蔽被检测到。
   4. 洗滑动三次用1×PBS。
   5. 添加2 - 3滴dapB的探头设置了用于评估背景染色的脑片（约100微升）。注:探头的dapB设定的目标细菌的基因，不应该承认任何哺乳动物RNA。
   6. 添加2 - 3滴靶向探针设置为用于检测目的RNA的那些脑片。注意:一探针组靶向残基20 - 1381鼠标ATF4的mRNA是用在本实施例的。
   7. 盖玻片用封口膜，以避免探头挥发，将它们放置在杂交炉内部的加湿盒滑动，并培育它们在^40℃2小时。
      注:可选:额外的大脑切片可以用杂交探针一套针对鼠标和Polr2A作为阳性对照。
   8. 洗SLI德两次在室温2分钟1×洗涤缓冲液。
   9. 添加2 - 3滴扩增试剂AMP 1-FL到每个脑切片，盖玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉30分钟。
   10. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   11. 添加2 - 3滴扩增试剂AMP 2-FL到每个脑切片，盖玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉15分钟。
   12. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   13. 添加2 - 3滴扩增试剂AMP 3-FL到每个脑切片，盖玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉30分钟。
   14. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   15. 添加2 - 3滴扩增试剂AMP 4-FL到每个脑切片，盖玻片用封口膜，将它们放置在滑动箱和孵育在^40℃下在杂交炉15分钟。
   16. 洗涤用1×洗涤缓冲液进行2分钟，在RT和两次用1×PBS滑动两次。
   17. 添加100 - 200微升（或足够量，以完全覆盖片）的封闭液含有3毫克/毫升BSA，100mM的甘氨酸和0.25％的Triton X-100的PBS（pH7.4）中的幻灯片，覆盖它们用封口膜和孵育在室温30分钟。
   18. 添加100 - 200微升抗胆碱抗体稀释于封闭液（1/100）的幻灯片，用封口膜覆盖它们，并培育2天^，4℃。确保脑片不干燥。 24小时培养后，如果需要，再申请抗胆碱抗体溶液大脑切片。
   19. 洗涤滑动在1×PBS清洗3次，每次5分钟，在RT。
   20. 添加100 - 200微升适当的Alexa标记的二抗的（ 例如 ，的Alexa-594驴抗山羊为这个特定的例子），以幻灯片，盖用封口膜和incub吃1小时，在室温。
   21. 洗涤滑动在1×PBS清洗3次，每次5分钟，在RT。
   22. 洗涤滑动一次用蒸馏水。
   23. 滑山含DAPI安装介质。
   24. 可视化在荧光显微镜下的脑切片。

2.检测ATF4 mRNA的本地化的轴突在使用显色原位杂交（CISH），其次是Luxol快速蓝和甲酚紫复染人脑样本

1. 对福尔马林固定的石蜡包埋的人脑样品的样品制备
   1. 烘烤片在干燥炉中在^60℃1小时。
   2. Deparaffinize脑切片在通风橱中。
      注:注意:试剂是有毒的，必须进行处理并丢弃以下相应的安全准则
      1. 沉浸在二甲苯替代清除剂载玻片两次，每次10分钟。
      2. 沉浸在100％乙醇载玻片两次，持续1分钟。
      3. 一个IR-干切片5分钟在室温。注:另外可能的样品在室温Ø干燥/ N，但必须在24小时内使用。
2. 二氨基联苯胺（DAB）为主色ISH检测之后luxol快速蓝色和甲酚紫染色用热诱导和蛋白酶引起的RNA揭露
   1. 在开始之前准备所需材料:
      1. 热火杂交炉至^40℃，并放置装有蒸馏水创造湿润的环境，一个托盘。
      2. 取一个滑动箱并放置浸泡在蒸馏水内加湿滑动箱纸巾。放置在杂交炉滑动箱。
      3. 制备1×预处理2稀释在无RNase或DEPC处理水10倍的原液（包含在CISH试剂盒）。如果预处理的热板上进行，加入100毫升的预处理溶液，以100毫米直径的玻璃培养皿，以增加盘与热板之间的接触表面（如果预​​处理在微波中进行，可以使用一个科普林缸代替如在1.2.3规定）。散热解决方案，以^100℃，并保持样品淹没煮沸前不超过30分钟。
      4. 热消极和积极的探头在^40℃10分钟，冷却在室温。
      5. 平衡的扩增试剂的AMP 1-6（包括在CISH试剂盒）于RT。
      6. 制备1×洗涤缓冲液稀释在蒸馏水中的50x贮备液（包含在CISH试剂盒）。注:1×洗涤缓冲液可以储存在室温下1个月，用于将来的染色。
   2. 加〜4滴预处理1的（〜120微升）到每个脑切片，盖上封口膜和在室温下孵育10分钟。
   3. 在新鲜蒸馏水洗涤3至5次。
   4. 进行热诱导的揭露:
      1. 转移幻灯片热预处理2（包含在CISH试剂盒）解决方案，并煮沸15分钟。注意:沸腾可以在热板上，确保执行连续煮沸或以下）的规定1.2.3关键步骤微波炉。
   5. 立即玻片转移到蒸馏水冲洗3至5次。
   6. 洗涤滑动在新鲜的100％乙醇3至5倍。
   7. 风干切片5分钟，在RT。注:另外切片可干燥O / N。
   8. 执行蛋白酶诱导揭露:
      1. 加4滴预处理3（包含在CISH试剂盒）中，用封口膜封住，并在杂交炉保温30分钟，在^40℃。
   9. 洗涤滑动在新鲜蒸馏水3至5倍。
   10. 加4滴dapB的探头设置了用于评估背景染色的脑片。
   11. 加入4滴所述靶向探针设置为用于检测目的RNA的那些脑片。
       注:探针组靶向残基15 - 1256人类ATF4 mRNA的是用在本实施例中。可选:额外的大脑切片可以HYBridized用探针组针对人类PPIB 和用作阳性对照。
   12. 放置在滑动框并孵育2小时。在杂交炉^40℃。
   13. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   14. 加4滴AMP 1试剂每个脑切片，盖玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉30分钟。
   15. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   16. 加4滴AMP 2试剂每个脑切片，盖上玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉15分钟。
   17. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   18. 加4滴AMP 3试剂每个脑切片，盖上玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉30分钟。
   19. 滑洗两次为1XH缓冲液在室温2分钟。
   20. 加4滴AMP 4试剂每个脑切片，盖上玻片用封口膜，将它们放置在幻灯片框和孵化，在^40℃下在杂交炉15分钟。
   21. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   22. 加入4滴AMP 5试剂至各脑切片的，覆盖载玻片用封口膜和孵育在室温30分钟。
   23. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   24. 加4滴AMP 6试剂每个脑切片，盖上玻片用封口膜和孵育15分钟，在室温。
   25. 洗涤用在室温2分钟1×洗涤缓冲液滑动两次。
   26. 混合欠压1的等体积和欠压2试剂（包括在CISH试剂盒）中，添加〜120微升溶液到每个脑切片，盖用封口膜和孵育10分钟，在室温。
   27. 洗涤滑动两次在RT 1×洗涤缓冲液2分钟，在蒸馏水中冲洗一次。
       注:关键步骤:以下步骤是关键获得最优轴突染液无掩蔽的RNA颗粒的存在。
   28. 之前执行染液检查明显微镜下感兴趣的mRNA的存在。限定的脑样品中监测泪点的整个染液过程中存在参考区域。
   29. 在60 ^摄氏度预热luxol蓝快的解决方案
   30. 在luxol蓝色快滑到位，并培育30分钟^，60℃。
   31. 冲洗几次在蒸馏水中。
   32. 浸滑动多次在0.05％碳酸锂溶液开始分化。
   33. 浸在新鲜的75％乙醇滑动两次。
   34. 在蒸馏水中清洗。
   35. 检查一个明显微镜下大脑切片。需要注意的是灰质和白质起，应该区分和RNA颗粒为深蓝色/黑色的泪点仍清晰可见。验证轴突开始出现的淡蓝色纤维。
   36. 重复步骤2.2.28到2.2.32。 Perfor米与孵育快速luxol蓝溶液在10 - 20分钟的步骤，仔细监测染液和RNA颗粒的存在。注意:通常，最佳染液在60取得- 90分钟（总温育时间），但时间可以如果它被怀疑的RNA颗粒可能被luxol快蓝染色（参见图2的例子）被掩蔽被缩短。
   37. 孵育在甲酚紫溶液载玻片在室温10分钟。
   38. 在蒸馏水中清洗幻灯片。
   39. 浸滑动在70％的乙醇5至10倍。
   40. 通过100％乙醇的3快速变化脱水大脑切片。
   41. 在通风橱中，清脑切片在二甲苯替代清除剂2分钟，第三时间为5分钟，在RT下温育两次。
   42. 摩脑片二甲苯为主的永久性封固剂。
   43. 一个明显微镜下分析样品。

结果

的上述过程的简要概述显示在图1中。

利用热诱导揭露ATF4 mRNA的最佳检测颗粒的胆碱能神经轴突

当评估mRNA的轴突本地化，它能够识别轴突，并能够可视化低丰度的RNA是至关重要的。这里所描述的RNA原位杂交技术使RNA的检测，在单分子的分辨率。采用这种技术的标准协议建议两个揭露程序的组合，以有效地检测靶RNA:蛋白酶诱导和热诱导揭露^28。然而，当ISH是结合免疫识别轴突，蛋白酶诱导揭露可能不会导致最佳的抗原检测^29。

在这里所描述的第一协议，被避免蛋白酶消化，由于使用的抗体没有认识到Ç啉乙酰转移酶（ChAT的）通常在从septohippocampal途径（ 图2A和B）所产生的齿状回的轴突，虽然分别检测阳性的mRNA颗粒。热诱导的检索用10mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6），另一方面，确保了抗胆碱抗体识别的表位的...

讨论

在这份报告中，我们描述了轴突本地化ATF4 mRNA的检测采用了高分辨率的ISH技术。这些和以前发表的研究报告表明，该技术是与基于抗体的蛋白质检测的组织中或甚至整个胚胎³³兼容。重要的是，它最近已被使用于海马神经元³⁴的树突内检测电弧的mRNA。它也可以与组织学染料对组织染色组合。最后，这是适合于同时检测多个靶RNA ^28,30,33。这些结果例证的高分辨率的RNA原位杂交技术的通用性，并稍作修改的原始协议不降低该方法的敏感性。

描述用Z型结构的探针的一个单分子的分辨率来检测感兴趣的mRNA在组织中原始协议建议两个步骤用于mRNA揭露涉及蛋白酶消化和样品沸腾^30,35。在这里，我们将展示如何蛋白酶诱导揭露负面影响成功的基于抗体的检测聊天从隔-海马通路（ 图2A和B）所产生的胆碱能神经轴突。因此，我们决定排除这一步，仅执行热诱导揭露，如果轴突复染涉及使用抗体。如图（ 图2C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
靶向小鼠残基 20-1,381 的定制探针 Atf4 mRNA （NM_009716）	Advanced Cell Diagnostics	-	探针
靶向人 ATF4 mRNA （NM_001675.2） 的残基 15-1,256 的定制探针Advanced	Cell Diagnostics	-	探针
阴性对照探针-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	探针
阳性对照探针-小鼠 Polr2A（可选）	高级细胞诊断	312471	探针
阳性对照探针-人 PPIB（可选）	高级细胞诊断	313901	探针
RNAscope 荧光多重试剂盒（用于荧光检测）	高级细胞诊断	320850	原位杂交试剂盒
RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 棕色（用于显色检测）	高级细胞诊断		310035 原位 杂交试剂盒
山羊多克隆抗 ChAT 抗体	Millipore	AB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet 染色试剂盒	美国 MasterTech	KTLFB
Clearify 透明剂（二甲苯替代品）	美国 MasterTech	CACLEGAL
ProLong Gold 镶样  介质，含 DAPI	Life Technologies	P36935
DPX 镶样介质	Sigma	6522