RNA 原位 杂交（ISH）能够实现对细胞和组织中RNA的可视化。本文展示了如何将RNAscope ISH与免疫组织化学或组织学染色相结合，成功检测小鼠和人脑切片中定位于轴突的mRNA。
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本文内容
摘要
摘要
mRNA 常定位于脊椎动物的轴突中，其局部翻译在发育过程中对轴突导向或分支至关重要，并在发育后期对轴突的维持、修复或神经退行性变具有重要作用。近期的高通量分析显示，轴突的转录组比先前预期的更为动态且复杂。然而，这些分析主要是在培养的神经元中进行的，在此类模型中轴突可与胞体-树突区室实现分离。而在完整组织中，几乎无法实现此类分离。 体内因此，为了验证mRNAs的招募及其在完整动物体内的功能相关性，理想情况下应将转录组分析与能够实现mRNAs可视化的技术相结合 原位近年来，已开发出可在单分子水平上检测RNA的新型原位杂交（ISH）技术。该技术在分析mRNA的亚细胞定位时尤为重要，因为定位于特定区域的RNA通常表达水平较低。本文中，我们描述了两种利用新型超敏RNA原位杂交技术检测轴突定位mRNA的实验方案。我们结合了RNAscope原位杂交技术与荧光免疫组织化学或组织学染料对轴突进行复染，以验证mRNA在轴突中的招募情况 Atf4 mRNA 向轴突的运输 体内 在成年小鼠和人类大脑中。
引言
轴突内 mRNA 的招募和局部翻译使轴突能够以时空特异性的方式快速响应胞外刺激1。目前对轴突内蛋白质合成的理解主要集中在神经发育过程中，其在生长锥行为2-8、轴突导向9-11以及逆行信号传导12,13中发挥关键作用。然而，关于在发育完成后神经元中轴突蛋白质合成的功能意义，目前所知甚少，因为在这些成熟神经元中，轴突内的 mRNA 和核糖体水平已显著降低14,15。长期以来，人们认为成熟的脊椎动物轴突不具备翻译活性16。然而，最近的研究表明，在病理条件下，成熟轴突中的局部翻译会被重新激活。例如，在神经损伤后，一部分 mRNA 会被招募至再生中的轴突，且轴突内的蛋白质合成对于这些轴突的正确再生至关重要17。此外，我们课题组已证明，在局部暴露于阿尔茨海默病相关肽 Aβ1-42 后，特定的 mRNA 会被招募至轴突，且转录因子 ATF4 的局部翻译对于将 Aβ1-42 的神经退行性效应从轴突传递至神经元胞体是必需的18。最后，高通量分析揭示，成熟轴突的转录组比预期更为复杂且具有动态变化特征18-21，尤其是在病理条件下。鉴于这些研究进展，迫切需要一种高灵敏度和高特异性的方法，用于检测成年神经系统中定位于轴突的 mRNA。
成熟轴突中 mRNA 招募与局部翻译的大部分研究工作均在培养的神经元上进行。对于转录组分析而言尤其如此，因为已....
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方案
所有动物实验程序均经哥伦比亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循实验室动物护理与使用的相关指南。注意：原位杂交（ISH）实验所用的全部缓冲液均应使用无RNase水或DEPC处理水配制。ISH完成后此建议并非严格必需，但仍建议缓冲液使用经高压灭菌的双蒸水配制，和/或通过过滤灭菌。
1. 检测 Atf4 使用荧光技术在成年小鼠大脑胆碱能轴突中定位的 mRNA 原位 荧光原位杂交（FISH）联合免疫组织化学
- 用于多聚甲醛固定冷冻脑切片的样本制备
- 以下示例中，制备固定后的冷冻小鼠脑组织切片。
- 简而言之，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉处死9月龄小鼠，随后进行心脏灌注。-1 体重）和赛拉嗪（10 mg/kg）-1 体重）后，经心脏灌注4%多聚甲醛（PBS配制，pH 7.4）。
- 取出脑组织，在4°C下用4%多聚甲醛后固定24小时 oC.
- 固定后，用 PBS 洗涤样本三次，并在含 30% 蔗糖的 PBS（pH 7.4）中 4 °C 下 cryoprotect 24 小时 oC.
- 将脑组织包埋于OCT冷冻包埋剂中，在冷冻切片机上以20 µm厚度连续切片，并贴附于经多聚赖氨酸处理的显微载玻片上。脑切片....
- 以下示例中，制备固定后的冷冻小鼠脑组织切片。
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结果
上述步骤的简要总结见图1。
利用热诱导去封闭法在胆碱能轴突中对Atf4 mRNA 颗粒进行最佳检测
在评估mRNA的轴突定位时，关键是要能够识别轴突，并能够可视化丰度较低的RNA。本文所述的RNA原位杂交（ISH）技术可实现单分子分辨率的RNA检测。使用该技术的标准方案建议结合两种去封闭方法以有效检测目标RNA：蛋白酶诱导去封闭和热诱导去封闭28。然而，当将原位杂交与免疫组织化学联合用于识别轴突时，蛋白酶诱导去封闭可能无法实现最佳的抗原检测效果29。
在本文描述的第一个实验方案中，避免了蛋白酶消化步骤，因为所使用的抗体无法识别通常存在于由隔-海马通路发出的齿状回轴突中的胆碱乙酰转移酶（ChAT）。图 2A 和 B)，尽管可检测到阳性mRNA颗粒。另一方面，使用10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6）进行热诱导抗原修复.......
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讨论
在本报告中，我们描述了一种高分辨率原位杂交（ISH）技术在检测轴突局部定位的 Atf4 mRNA 中的应用。这些研究以及先前已发表的研究表明，该技术可与基于抗体的蛋白质检测方法兼容，适用于组织甚至整个胚胎33。重要的是，该技术最近已被用于检测海马神经元树突内的 Arc mRNA34。此外，它还可与组织学染料联合用于组织染色。最后，该技术适用于多种靶RNA的同步检测28,30,33。这些结果充分体现了高分辨率RNA原位杂交技术的多功能性，且对原始实验方案进行的微小修改并不会降低该方法的灵敏度。
最初描述使用Z-结构探针在组织中以单分子分辨率检测目的mRNA的实验方案建议通过蛋白酶消化和样本煮沸两个步骤进行mRNA去遮蔽30,35。本文表明，蛋白酶诱导的去遮蔽会负面影响基于抗体的ChAT检测，特别是在来自隔-海马通路的胆碱能轴突中（图2A和B）。因此，我们决定在轴突共染涉及抗体使用时省略该步骤，仅.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作由阿尔茨海默病协会（Alzheimer’s Association，项目编号：NIRG-10-171721，授予 U.H.）、国家心理健康研究所（National Institute of Mental Health，项目编号：MH096702，授予 U.H.）、国家神经疾病与卒中研究所（National Institute of Neurological Disorders and Stroke，项目编号：NS081333，授予 C.M.T.）以及由美国国立衰老研究所资助的哥伦比亚大学阿尔茨海默病研究中心（项目编号：AG008702，授予 J.B. 和 Y.Y.J.）提供的初步研究资助共同支持，该研究中心同时也支持纽约脑库的运行。我们感谢Hengst实验室成员提出的评论与讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定制探针，靶向小鼠 Atf4 mRNA 第20-1,381位残基（NM_009716） | Advanced Cell Diagnostics | - | 探针 |
| 定制探针，靶向人 ATF4 mRNA 第15-1,256位残基（NM_001675.2） | Advanced Cell Diagnostics | - | 探针 |
| 阴性对照探针-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | 探针 |
| 阳性对照探针-小鼠 Polr2A（可选） | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | 探针 |
| 阳性对照探针-人 PPIB（可选） | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | 探针 |
| RNAscope 荧光多重试剂盒（用于荧光检测） | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ 杂交试剂盒 |
| RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 棕色（用于显色检测） | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ 杂交试剂盒 |
| 山羊多克隆抗-ChAT 抗体 | Millipore | AB144P | |
| Luxol 快速蓝-藏红快紫染色试剂盒 | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify 透明剂（二甲苯替代品） | American MasterTech | CACLEGAL | |
| 含 DAPI 的 ProLong Gold 封片介质 | Life Technologies | P36935 | |
| DPX 封片介质 | Sigma | 6522 |
参考文献
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. ....
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