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异体免疫诱导的血管排斥反应与移植性动脉硬化的鼠类模型

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DOI：

10.3791/52800

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2015年5月17日

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

本文内容

摘要

我们描述了一种小鼠主动脉移植术的实验方案。该方案的目的是提供一种可用于研究动脉中与同种免疫反应相关的病理过程及治疗策略的模型，以及由此引发的动脉改变，这些改变是导致器官移植失败的重要因素。

摘要

导致移植性动脉硬化（TA）的血管排斥反应是慢性心脏移植失败的主要表现。在TA中，受体的免疫系统会损伤动脉壁，并导致内皮细胞和平滑肌细胞功能障碍。这会引发一种病理性修复反应，其特征是内膜增厚和管腔闭塞。深入了解免疫系统引起血管排斥和TA的机制，有助于开发管理移植物失功的新方法。本文描述了一种可用于研究血管排斥和TA致病机制的小鼠主动脉移植模型。该模型涉及将供体动物的主动脉段移植至同种异体受体中。动脉段的排斥反应涉及同种免疫反应，并导致类似血管排斥的动脉结构改变。我们所描述的基本技术方法可用于不同小鼠品系以及靶向干预，以回答与血管排斥和TA相关的特定科学问题。

引言

30 多年来，随着免疫抑制药物的进步，由急性排斥反应引起的移植物排斥已显著减少，但慢性排斥仍是主要挑战。心脏移植慢性排斥的主要表现为移植性动脉硬化（transplant arteriosclerosis, TA）1,2。该疾病以移植物动脉的内膜增生和血管运动功能障碍为特征，是受体免疫系统对移植物内皮细胞和平滑肌细胞进行免疫攻击的结果。由于受体免疫系统识别异体肽-主要组织相容性复合物（MHC）复合物，导致移植物血管系统受到特异性攻击，这一点在TA的发生中尤为突出：TA仅出现在移植物动脉中，而宿主自身的血管则不受影响3。与此一致的是，实验研究表明，当受体与供体基因完全相同，或受体缺乏T细胞和B细胞时，TA不会发生4。免疫介导的血管损伤和功能障碍导致TA中出现内膜增厚、纤维化，以及脂质和细胞外基质（ECM）蛋白的异常积聚5。内膜增厚通常在整个动脉树中呈同心圆状分布4-6。移植物丧失和死亡通常是由于异体移植物动脉管腔闭塞引起的进行性缺血所致4。

1991年，Mennander et al. 7 首次在大鼠中建立了主动脉移植模型以模拟移植动脉病（TA）。此后，多个研究团队对该手术方法进行了改良，使其适用于小鼠。在此模型中，同种异体主动脉移植物所形成的病变特征与临床移植中观察到的TA相似，包括以平滑肌样细胞和受体白细胞积聚为特征的内膜增厚7。在过去的二十年中，该模型已被用于深入揭示血管损伤、排斥反应及移植动脉病的机制。该模型可用于研究动脉病变过程中免疫与血管反应的相关问题。抗原错配的选择会影响对这些问题进行恰当研究的能力。

在完全MHC屏障之间进行移植可全面评估已知参与器官移植排斥反应的免疫应答。这包括CD4和CD8 T细胞对移植物来源细胞呈递的异源肽-MHC复合物的直接识别与攻击，CD4（以及可能的CD8）T细胞通过受体抗原呈递细胞呈递的移植物来源同种异体抗原进行的间接识别与攻击，以及抗体介导的对血管细胞表面同种异体抗原的识别8。然而，在完全MHC不匹配的实验中，血管对损伤的反应可能与临床观察到的情况不同。Johnson et al.9 研究表明，在跨越完全MHC不匹配屏障移植的主动脉间置移植物中，大部分新生内膜细胞来源于受体而非供体。这与人类移植中的观察结果不同，后者中大部分内膜平滑肌细胞来源于供体9,10。为弥补这一局限性，研究人员已开发出其他实验模型，通过次要组织相容性抗原不匹配的移植物来诱导更接近临床移植中所见的血管反应11。尽管这些替代模型有助于得出关于驱动移植动脉病（TA）发展的血管反应的重要结论，但由次要组织相容性抗原不匹配引发的移植物血管排斥所涉及的免疫过程并不能完全再现临床环境中的真实情况。例如，移植物反应性抗体对次要组织相容性抗原的识别能力较弱12。鉴于上述因素，在选择主动脉间置模型中所使用的抗原不匹配类型时，必须充分考虑所研究的病理学问题。本文中，我们描述了一种小鼠主动脉间置移植的详细操作方案。我们以完全MHC不匹配的小鼠之间的间置移植为例进行说明，但该方案同样适用于其他抗原不匹配小鼠品系间的移植操作。

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方案

本研究中的所有实验方案均经过西蒙菲莎大学动物护理伦理委员会的审查和批准。使用 Balb/cYJ (H2d) 作为供体小鼠，C57Bl/6 (H2b) 作为受体小鼠，以检测同种异体反应。实验所用小鼠的年龄为 8 至 12 周，雌雄均可。同基因型对照组则将 C57Bl/6 供体的主动脉节段移植至 C57Bl/6 受体小鼠体内。

1. 供体与受体的准备

注意：供体和受体均在手术前进行麻醉和准备，以尽量减少移植物的缺血时间。本方案使用注射用麻醉剂，以避免吸入麻醉所需设备对动物造成阻碍。然而，如有需要，吸入麻醉也是一种合适的替代方法。从首次注射麻醉剂开始，整个手术过程约需90分钟完成。移植物的缺血时间少于30分钟。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg；10 mg/ml）和赛拉嗪（10 mg/kg；1 mg/ml）对小鼠进行麻醉。小鼠将在10至15分钟内进入镇静状态。通过夹捏动物足垫的脂肪部分来评估麻醉深度。根据需要追加原始剂量的1/3麻醉混合物，直至动物不再出现缩足反射。每次给予麻醉混合物后需密切监测呼吸频率。手术期间，每隔15分钟用镊子夹捏腹前壁以评估麻醉水平。小鼠应保持深度麻醉状态60至90分钟。
  2. 使用眼用软膏润滑小鼠眼睛，以防止麻醉期间角膜干燥。
  3. 从胸部中段至耻骨区域的腹部腹侧尽可能贴近皮肤剃除毛发。操作时需特别小心，避免划伤皮肤。请勿使用脱毛膏，因其可能被皮肤吸收并引起炎症反应。
  4. 将动物仰卧位放置在加热台或加热垫上方的毛巾上。
  5. 先用2%氯己定对手术区域进行初步清洗。准备较大的操作区域以最大限度暴露手术视野。从手术区域中心开始，以直线或环形方式向外擦拭。用过的纱布应丢弃。此步骤至少重复5次以上。随后在同一区域使用酒精消毒片擦拭。待酒精完全挥发后，用碘伏溶液处理已清洁的区域，并覆盖无菌纱布。

2. 端-端吻合术操作步骤

  1. 供体手术
    1. 整个手术过程中保持无菌操作。使用前，用0.5%加速过氧化氢溶液清洁所有台面和手术台表面。所有手术器械、纱布、手术单和手术衣均需包裹后进行高压灭菌。通过在每个包装内放置蒸汽灭菌指示条验证器械的无菌状态。每次手术使用无菌外科手套，并在手术间更换丢弃。对于多次手术，每次使用后需用热玻璃珠灭菌器对手术器械进行灭菌。
    2. 将供体小鼠仰卧位放置于操作显微镜下（放大倍数8–30倍），置于一块洁净的薄型Plexiglas板上，板外包裹无菌手术单。
    3. 确认已达到第1.1节所述的充分外科麻醉深度后，开始手术。
    4. 使用无菌剪刀，从耻骨至剑突做一条单一的下腹部正中纵向切口。
    5. 使用小型拉钩撑开腹壁，暴露腹腔。
    6. 使用无菌棉签轻轻将肠管向上并向动物左侧推移，用生理盐水浸湿的纱布覆盖。将生殖器官向下推移，暴露肾下腹主动脉和下腔静脉（IVC）。定期用生理盐水湿润暴露的组织。
    7. 使用5号医用镊子，从左肾动脉水平至分叉处，将腹主动脉与下腔静脉分离。使用10-0聚酰胺单丝缝线结扎靠近主动脉的小分支。
    8. 一旦供体腹主动脉与下腔静脉分离完成，用生理盐水充分润湿血管，用湿纱布覆盖暴露的腹腔，并将供体放置于无菌区域备用。每15分钟检查一次供体状态（呼吸和心血管功能，以及麻醉深度）。开始对受体进行操作，按以下步骤（2.2.1至2.2.7）分离受体主动脉。
    9. 当受体主动脉已与下腔静脉分离并妥善放置后，将供体重新置于显微镜下。使用两个4 mm微血管夹，在目标节段的近端和远端（相距约5 mm）交叉夹闭供体主动脉。
    10. 使用Vannas-Tubingen显微剪，横断一段小段腹主动脉移植物（长度3至4 mm）。
    11. 使用连接注射器的25 G 5/8针头，用肝素化（100 U/ml）生理盐水冲洗切除的主动脉。确保针头尖端不与血管壁接触。
    12. 将主动脉置于含肝素化（100 U/ml）生理盐水的冰上保存备用。在动物仍处于深度麻醉状态下，松开微血管夹，通过放血法处死供体。
    13. 在切除后30分钟内植入供体血管。尽管可通过切取更长的主动脉段将一个供体血管用于多个受体，但缺血时间应保持在30分钟以内。
  2. 受体手术
    1. 整个手术过程中保持无菌操作，与供体手术相同。
    2. 将受体小鼠仰卧位放置于操作显微镜下（放大倍数8–30倍），置于一块薄型Plexiglas板上，板外包裹无菌手术单。
    3. 确认麻醉充分后，当动物无退缩反射时开始手术。
    4. 使用无菌剪刀，从耻骨至剑突做一条单一的下腹部正中纵向切口。
    5. 使用小型拉钩撑开腹壁，暴露腹腔。
    6. 使用无菌棉签轻轻将肠管向上并向动物左侧推移，用生理盐水浸湿的纱布覆盖。将生殖器官向下推移，暴露肾下腹主动脉和下腔静脉（IVC）。定期用生理盐水湿润暴露的组织。
    7. 从左肾动脉水平至分叉处，将主动脉与下腔静脉分离。必要时，使用10-0聚酰胺单丝缝线结扎靠近主动脉的小分支。
    8. 使用两个4 mm微血管夹，在目标节段的近端和远端（相距约5 mm）交叉夹闭主动脉。
    9. 使用Vannas-Tubingen显微剪，在腹主动脉上做一个单一的横向主动脉切开，并切除一小段（不超过0.5 mm）主动脉，以容纳供体主动脉移植物。
    10. 用肝素化（100 U/ml）生理盐水冲洗切除的主动脉。供体主动脉移植物的长度应适中，以连接受体被切断的主动脉两端。
    11. 将供体主动脉移植物置于原位，并将移植物末端与受体主动脉末端吻合，确保移植物的解剖方向与受体一致。
    12. 用5号医用镊子轻轻夹住血管外膜，并稍作外翻。用镊子引导连接10-0聚酰胺单丝缝线的针头，穿透血管壁全层，以将供体主动脉移植物固定于受体切除的血管端。注意避免因误缝血管后壁而导致血管开口闭合。
    13. 进行连续缝合时，在移植物上下两端的9点钟位置放置固定缝线。从移植物上端3点钟位置开始，使用两条连续缝线吻合切除的两端，并将缝线固定于固定缝线上。
      1. 将移植物翻转，继续缝合至血管背侧，与起始的固定缝线汇合。固定时避免对血管施加过大压力。对下端吻合重复相同缝合操作。
        注：间断缝合的起始方式与连续缝合同样，区别在于在固定缝线之间使用三条独立的缝线完成吻合。吻合时间通常为20分钟。
    14. 吻合完成后，松开远端微血管夹，使血液逆向流动，检查吻合口是否有渗漏。如有渗漏，立即加缝一针封闭漏口。若无出血，则松开近端夹子。
    15. 检查移植血管，确认移植物内无血流阻塞，且受体血管的近端和远端通畅。供体和受体血管均出现有力的搏动，是血流通畅的主要标志。使用镊子轻轻夹住固定缝线的一端，轻柔外翻血管，检查血管后壁。
      注：吻合口两端的血管壁不应出现皱缩。松开夹子后血流不良是血栓形成的征象。
    16. 使用棉签将肠管复位至腹腔内。
    17. 使用Castroviejo持针器和Graefe镊子，用5-0聚丙烯缝线连续缝合腹壁。用相同缝线行皮下连续缝合关闭皮肤层。
    18. 移植完成后立即肌内注射Torbugesic（1 mg/kg）。
    19. 立即按顺序皮下注射Atipamezole（1 mg/kg）、ketoprofen（5 mg/kg）和温热的乳酸林格液。
    20. 术后立即将小鼠置于加热笼内，使用水毯过夜（12小时）。在麻醉恢复期间，将动物单独放置于洁净、干燥、无障碍的区域。笼内垫以洁净纸巾（经高压灭菌），并将水毯温度调节至约20至22 °C。在笼底自由提供干湿颗粒饲料。
      注：术后护理的重要组成部分是在麻醉和手术恢复期间对动物进行观察，并根据需要进行适当干预。监测强度应根据动物个体情况调整，在麻醉刚结束的即刻阶段可能需要比术后后期更密切的监测。
    21. 对接受麻醉的动物持续监测，直至其完全恢复。动物必须能够自主维持胸卧位，且表现平静、无疼痛，方可无人看护。
    22. 术后连续三天皮下注射Buprenorphine（0.1 mg/kg，每日两次）和ketoprofen（5 mg/kg，每日一次）。
    23. 在术后至少三天内持续监测心血管和呼吸功能、体温，以及术后疼痛或不适。可能需要额外护理措施，如给予镇痛药和其他药物，以及肠外补液以减少脱水和电解质丢失。
    24. 通过观察后肢运动功能评估移植手术的成功与否。移植完全成功的表现为后肢和尾部血流畅通，动物恢复后应立即出现，且在术后第二天完全恢复，无后肢瘫痪。

3. 组织采集

注意：预设的终点时间范围为3至60天，具体取决于所需的分析类型和抗原错配的性质。通常情况下，在完全MHC错配的小鼠品系间进行移植后，第30天时内膜增厚已较为显著。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg；10 mg/ml）和赛拉嗪（10 mg/kg；1 mg/ml）对小鼠进行麻醉。通过夹捏动物足垫的脂肪部分评估麻醉深度，当动物不出现回缩反射时即可开始手术。
  2. 先用清水清洁手术区域，最后使用70%酒精进行消毒。
  3. 将动物仰卧位放置在铺有吸水垫的托盘上。
  4. 沿中线做一较大的纵向切口以打开腹腔。使用自持式牵开器暴露腹腔、下腔静脉（IVC）和腹主动脉。
  5. 使用5号医用镊子轻轻将移植的供体主动脉节段与邻近的下腔静脉分离。操作时需特别注意，避免剥离移植血管的外膜。
  6. 沿胸椎两侧剪开肋骨直至胸廓入口，以暴露胸腔。将前胸壁向上翻折以暴露心包，并用止血钳固定肋骨。
  7. 暴露心脏后，将一支25 G 5/8号针头（连接注射器）插入左心室，并用0.1 ml含肝素（100 U/ml）的生理盐水冲洗。
  8. 使用剪刀切除右心房，以便在灌注过程中血液、肝素化生理盐水和固定液能够流出体外。用5 ml 4%多聚甲醛溶液进行灌注，直至流出液变清亮。取出心脏以确保动物安乐死。
  9. 切除移植的血管节段，并将其浸入4%多聚甲醛中固定，时间不超过一小时。将移植血管置于OCT（最佳切割温度）包埋剂中并速冻。在恒冷箱中以8 μm厚度切片，切片使用苏木精与伊红（H&E）染色和/或Verhoeff- van Gieson（van Gieson）弹性纤维染色。

4. 移植物的形态学分析

注意：移植动脉病（TA）的特征是内膜增厚13。在此模型中，内膜增厚及其导致的管腔缩小程度反映了免疫介导血管损伤的严重程度。同基因移植对照用于确定在无同种异体免疫反应情况下血管的基础特征。这些对照还可用于评估手术操作本身所致的动脉损伤。同基因移植血管中不应出现内膜增厚。

  1. 为了评估内膜增厚和管腔闭塞，使用图像分析软件测量经弹性纤维 van Gieson 染色的动脉节段中内皮细胞层、内弹性膜（IEL）和外弹性膜（EEL）范围内的面积。以下参数可用于确定反映移植动脉病（TA）的动脉结构变化。
    1. 测量绝对内膜面积：内弹性膜内的面积减去内皮细胞层内的面积。该指标提供内膜扩张的绝对测量值，而内膜扩张是TA的典型特征。
    2. 测量绝对中膜面积：外弹性膜内的面积减去内弹性膜内的面积。该指标提供中膜退化或增生的绝对测量值，此类变化可能偶尔由血管壁该区域的免疫介导性改变引起。
    3. 测量血管总面积：即外弹性膜内的面积。该指标反映血管重构情况，这种重构可能由免疫性损伤导致动脉扩张或收缩所致。
    4. 测量内膜/中膜比值：（内弹性膜内的面积 – 内皮细胞层内的面积）/（外弹性膜内的面积 – 内弹性膜内的面积）。该指标提供内膜扩张的相对度量，并对血管大小差异进行标准化校正。
    5. 测量管腔狭窄百分比：[（内弹性膜内的面积 – 内皮细胞层内的面积）/ 内弹性膜内的面积] × 100。该指标用于评估管腔闭塞的程度，其由内膜扩张以及血管壁的向内或向外重构共同导致。

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结果

在该模型中，将 Balb/cYJ 小鼠的腹主动脉移植到 C57Bl/6 受体小鼠的肾下主动脉。这使得能够全面评估针对异体移植物动脉的同种免疫反应。该模型中的免疫介导性血管损伤会启动血管修复反应，最终导致内膜增厚、管腔狭窄以及免疫细胞浸润（图 1 和 图 2）。这些指标可作为评估同种免疫反应强度、血管排斥反应以及移植动脉病（TA）严重程度的检测终点。手术成功可通过异体移植物动脉节段出现显著的内膜增厚，以及同系移植物对照组中缺乏内膜增厚来判断。该模型可联合临床相关的免疫抑制方案使用，以更贴近临床移植情境。此外，该模型也可与转基因动物联合应用，以研究特定蛋白或信号通路在同种免疫反应中的作用，我们此前已开展过此类研究14。

同种异体移植主动脉节段发生内膜增厚

通过量化移植后第30天移植物主动脉节段的内膜增厚和管腔狭窄程度，评估免疫介导的同种异体移植物血管损伤程度。同种异体移植物动脉节段出现显著的内膜增厚和管腔闭塞，而在同基因型对...

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讨论

我们描述了一种用于小鼠主动脉移植的研究方案，该模型适用于研究免疫介导的血管排斥反应及移植动脉病（TA）。此模型可用于探究TA的发病机制以及开发新的治疗策略。过去的研究已利用该模型证实适应性免疫、细胞毒性T细胞反应、细胞因子介导的CD4+ T细胞效应反应以及抗体介导的移植物损伤在TA中具有关键作用14,17-21。由于小鼠体型明显较小，动脉移植手术具有较高难度；然而，通过反复练习和严谨操作，仍可成功完成手术。手术成功的关键在于血管的通畅性，这要求避免使用镊子不当操作导致移植物损伤、血管管腔受压、缝合到血管后壁以及在同一部位重复缝合。血管渗漏也是一个常见问题，需谨慎操作以确保缝线数量和位置在血管壁周围均匀分布。此外，必须将移植物缺血时间尽量缩短至30分钟以内。若上述要点均能妥善处理，手术成功率可超过95%。

主动脉是小鼠体内最大的动脉，因此该手术是研究此模型动物中血管排斥反应最简单的显微外科方法。此外，主动脉节段被移植到具有生理相关性的位置，经历正常的血流，且内膜增厚发展迅速。另一种用于评估血管排斥反应和移植动脉病（TA）的主要模型是异位心脏移植，其优势在于可在冠...

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致谢

本工作获得了加拿大卫生研究院和不列颠哥伦比亚省心脏与中风基金会的资助 & 育空（JCC）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6J (H-2b)Jackson Laboratories, Bar Harbour ME品系编号 000664
Balb/cBYJJackson Laboratories, Bar Harbour ME品系编号 001026
盐酸氯胺酮注射液 USP 100 mg/mlKetaleanDIN 00612316
赛拉嗪注射液 20 mg/mlRompumDIN 02169592
酮洛芬注射液 100 mg/mlAnafenDIN 01938126
酒石酸布托啡诺 注射液 10 mg/mlTorbugesicDIN 008450000
丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mlReckitt BenckiserB.N. 5241
盐酸阿替美唑无菌注射液AntisedanDIN 02237744
肝素钠注射液，USP，1,000 单位/mlMcKesson DistributionDIN 02264315
天然泪眼用软膏AlconDIN 02082519
体视显微镜LeicaM80
0.9% 氯化钠，无菌Baxter Corporation
乳酸林格’s 溶液，无菌Baxter Corporation
0.9% 氯化钠注射液，无菌，10 mlBaxter Corporation
酒精消毒片Loris
聚维酮碘Betadine
葡萄糖酸氯己定 4% w/vGermi-Stat
黑色聚酰胺单丝线AROSurgical InstrumentsT4A10Q07
缝合线，10-0 规格，70 微米Corporation
蓝色单丝缝合线 5-0，P3 针Ethicon8698G
1 ml 注射器BD货号 309659
10 ml 注射器BD货号 309604
1cc TB 胰岛素注射器，配 28 G 1/2 针头BD货号 309309
25 G 7/8 皮下注射针头BD货号 305124
27 G 1/2 皮下注射针头BD货号 305109
蜂鸟牵开器 - 1.5 cm 张开度，4 cm 长Fine Science Tools17000-04
S&T CAF-4 无锁夹钳施加钳Fine Science Tools00072-14
防滑钳，S&TFine Science Tools00632-11
医用 5 号钳Fine Science Tools11253-20
Lexer 婴儿剪刀Fine Science Tools14078-10
带齿微型 Adson 钳Fine Science Tools11018-12
Vannas-Tubingen 显微剪Fine Science Tools15003-08
微型夹钳，b-1 型；3.5mm x 1mm；7mm 长Fine Science Tools00396-01
Graefe 钳，10cm，1x2 齿Fine Science Tools11054-10
带锁钨碳钳口 Castroviejo 钳Fine Science Tools12565-14
玻璃珠高温灭菌器Inotech 250IS-250 - Steri-250
无纺纱布Progene
棉签Puritan
胡须修剪器Wahl
加热垫Sunbeam

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