异体免疫诱导的血管排斥反应与移植性动脉硬化的鼠类模型

摘要

我们描述了一种小鼠主动脉移植术的实验方案。该方案的目的是提供一种可用于研究动脉中与同种免疫反应相关的病理过程及治疗策略的模型，以及由此引发的动脉改变，这些改变是导致器官移植失败的重要因素。

摘要

导致移植性动脉硬化（TA）的血管排斥反应是慢性心脏移植失败的主要表现。在TA中，受体的免疫系统会损伤动脉壁，并导致内皮细胞和平滑肌细胞功能障碍。这会引发一种病理性修复反应，其特征是内膜增厚和管腔闭塞。深入了解免疫系统引起血管排斥和TA的机制，有助于开发管理移植物失功的新方法。本文描述了一种可用于研究血管排斥和TA致病机制的小鼠主动脉移植模型。该模型涉及将供体动物的主动脉段移植至同种异体受体中。动脉段的排斥反应涉及同种免疫反应，并导致类似血管排斥的动脉结构改变。我们所描述的基本技术方法可用于不同小鼠品系以及靶向干预，以回答与血管排斥和TA相关的特定科学问题。

引言

30 多年来，随着免疫抑制药物的进步，由急性排斥反应引起的移植物排斥已显著减少，但慢性排斥仍是主要挑战。心脏移植慢性排斥的主要表现为移植性动脉硬化（transplant arteriosclerosis, TA）^1,2。该疾病以移植物动脉的内膜增生和血管运动功能障碍为特征，是受体免疫系统对移植物内皮细胞和平滑肌细胞进行免疫攻击的结果。由于受体免疫系统识别异体肽-主要组织相容性复合物（MHC）复合物，导致移植物血管系统受到特异性攻击，这一点在TA的发生中尤为突出：TA仅出现在移植物动脉中，而宿主自身的血管则不受影响³。与此一致的是，实验研究表明，当受体与供体基因完全相同，或受体缺乏T细胞和B细胞时，TA不会发生⁴。免疫介导的血管损伤和功能障碍导致TA中出现内膜增厚、纤维化，以及脂质和细胞外基质（ECM）蛋白的异常积聚⁵。内膜增厚通常在整个动脉树中呈同心圆状分布^4-6。移植物丧失和死亡通常是由于异体移植物动脉管腔闭塞引起的进行性缺血所致⁴。

1991年，Mennander et al. ⁷ 首次在大鼠中建立了主动脉移植模型以模拟移植动脉病（TA）。此后，多个研究团队对该手术方法进行了改良，使其适用于小鼠。在此模型中，同种异体主动脉移植物所形成的病变特征与临床移植中观察到的TA相似，包括以平滑肌样细胞和受体白细胞....

方案

本研究中的所有实验方案均经过西蒙菲莎大学动物护理伦理委员会的审查和批准。使用 Balb/cYJ (H2^d) 作为供体小鼠，C57Bl/6 (H2^b) 作为受体小鼠，以检测同种异体反应。实验所用小鼠的年龄为 8 至 12 周，雌雄均可。同基因型对照组则将 C57Bl/6 供体的主动脉节段移植至 C57Bl/6 受体小鼠体内。

1. 供体与受体的准备

注意：供体和受体均在手术前进行麻醉和准备，以尽量减少移植物的缺血时间。本方案使用注射用麻醉剂，以避免吸入麻醉所需设备对动物造成阻碍。然而，如有需要，吸入麻醉也是一种合适的替代方法。从首次注射麻醉剂开始，整个手术过程约需90分钟完成。移植物的缺血时间少于30分钟。

1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg；10 mg/ml）和赛拉嗪（10 mg/kg；1 mg/ml）对小鼠进行麻醉。小鼠将在10至15分钟内进入镇静状态。通过夹捏动物足垫的脂肪部分来评估麻醉深度。根据需要追加原始剂量的1/3麻醉混合物，直至动物不再出现缩足反射。每次给予麻醉混合物后需密切监测呼吸频率。手术期间，每隔15分钟用镊子夹捏腹前壁以评估麻醉水平。小鼠应保持深度麻醉状态60至90分钟。
2. 使用眼用软膏润滑小鼠眼睛，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 从胸部中段至耻骨区域的腹部腹侧尽可能贴近皮肤剃除毛发。操作时需特别小心，避免划伤皮肤。请勿使用脱毛膏，因其可能....

结果

在该模型中，将 Balb/cYJ 小鼠的腹主动脉移植到 C57Bl/6 受体小鼠的肾下主动脉。这使得能够全面评估针对异体移植物动脉的同种免疫反应。该模型中的免疫介导性血管损伤会启动血管修复反应，最终导致内膜增厚、管腔狭窄以及免疫细胞浸润（图 1 和 图 2）。这些指标可作为评估同种免疫反应强度、血管排斥反应以及移植动脉病（TA）严重程度的检测终点。手术成功可通过异体移植物动脉节段出现显著的内膜增厚，以及同系移植物对照组中缺乏内膜增厚来判断。该模型可联合临床相关的免疫抑制方案使用，以更贴近临床移植情境。此外，该模型也可与转基因动物联合应用，以研究特定蛋白或信号通路在同种免疫反应中的作用，我们此前已开展过此类研究¹⁴。

同种异体移植主动脉节段发生内膜增厚

通过量化移植后第30天移植物主动脉节段的内膜增厚和管腔狭窄程度，评估免疫介导的同种异体移植物血管损伤程度。同种异体移植物动脉节段出现显著的内膜增厚和管腔闭塞，而在同基因型对.......

讨论

我们描述了一种用于小鼠主动脉移植的研究方案，该模型适用于研究免疫介导的血管排斥反应及移植动脉病（TA）。此模型可用于探究TA的发病机制以及开发新的治疗策略。过去的研究已利用该模型证实适应性免疫、细胞毒性T细胞反应、细胞因子介导的CD4+ T细胞效应反应以及抗体介导的移植物损伤在TA中具有关键作用^14,17-21。由于小鼠体型明显较小，动脉移植手术具有较高难度；然而，通过反复练习和严谨操作，仍可成功完成手术。手术成功的关键在于血管的通畅性，这要求避免使用镊子不当操作导致移植物损伤、血管管腔受压、缝合到血管后壁以及在同一部位重复缝合。血管渗漏也是一个常见问题，需谨慎操作以确保缝线数量和位置在血管壁周围均匀分布。此外，必须将移植物缺血时间尽量缩短至30分钟以内。若上述要点均能妥善处理，手术成功率可超过95%。

主动脉是小鼠体内最大的动脉，因此该手术是研究此模型动物中血管排斥反应最简单的显微外科方法。此外，主动脉节段被移植到具有生理相关性的位置，经历正常的血流，且内膜增厚发展迅速。另一种用于评估血管排斥反应和移植动脉病（TA）的主要模型是异位心脏移植，其优势在于可在冠.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	品系编号 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	品系编号 001026
盐酸氯胺酮注射液 USP 100 mg/ml	Ketalean	DIN 00612316
赛拉嗪注射液 20 mg/ml	Rompum	DIN 02169592
酮洛芬注射液 100 mg/ml	Anafen	DIN 01938126
酒石酸布托啡诺 注射液 10 mg/ml	Torbugesic	DIN 008450000
丁丙诺啡注射液 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
盐酸阿替美唑无菌注射液	Antisedan	DIN 02237744
肝素钠注射液，USP，1,000 单位/ml	McKesson Distribution	DIN 02264315
天然泪眼用软膏	Alcon	DIN 02082519
体视显微镜	Leica	M80
0.9% 氯化钠，无菌	Baxter Corporation
乳酸林格’s 溶液，无菌	Baxter Corporation
0.9% 氯化钠注射液，无菌，10 ml	Baxter Corporation
酒精消毒片	Loris
聚维酮碘	Betadine
葡萄糖酸氯己定 4% w/v	Germi-Stat
黑色聚酰胺单丝线	AROSurgical Instruments	T4A10Q07
缝合线，10-0 规格，70 微米	Corporation
蓝色单丝缝合线 5-0，P3 针	Ethicon	8698G
1 ml 注射器	BD	货号 309659
10 ml 注射器	BD	货号 309604
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27 G 1/2 皮下注射针头	BD	货号 305109
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