在嵌合小鼠模型中通过鼻内给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫

摘要

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。

摘要

疫苗是人类最伟大的成就之一，在过去的一个世纪中挽救了数百万人的生命。具有讽刺意味的是，人们对介导疫苗免疫反应的生理机制却知之甚少，这或许正是由于疫苗接种总体上非常成功，从而降低了人们对疫苗免疫的分子和生理机制的研究兴趣。然而，包括流感病毒在内的若干重要人类病原体仍然对疫苗接种构成挑战，可能受益于基于免疫的策略。

尽管流感反向遗传学已成功应用于研制减毒活流感疫苗（LAIVs），但在疫苗制剂中添加分子工具（如示踪组分）以追踪疫苗接种动力学的过程 体内，尚未得到解决。此外，近期开发的可在动力学研究期间特异性耗竭白细胞的小鼠模型，为理解疫苗诱导保护作用背后的免疫基本机制提供了新的契机。在此，我们以重组冷适应型减毒活流感疫苗（LAIV）为例，阐述反向遗传学与嵌合小鼠模型相结合的方法如何帮助揭示疫苗在生理和分子水平上的作用机制。我们利用实验室构建的携带细胞示踪标记的LAIV以及竞争性骨髓嵌合小鼠（BMCs），来确定疫苗免疫的早期动力学特征及启动疫苗特异性适应性免疫的主要生理机制。此外，我们展示了该技术如何促进在单个动物体内开展疫苗免疫应答过程中的基因功能研究。我们建议，该技术可应用于改进针对亟需医疗干预措施的病原体（例如流感病毒、HIV）的现有预防策略， 疟原虫以及埃博拉病毒等出血热病毒。

引言

在不引发疾病的情况下产生免疫记忆是高效疫苗接种的生理学基础¹。近年来，基于系统生物学的研究方法发现，诸如黄热病疫苗等成功的疫苗可强烈诱导先天性免疫应答，并激活多种树突状细胞（DC）亚群，进而引发抗原特异性T细胞的多谱系活化^2,3。由于树突状细胞是唯一具有激活抗原特异性初始T细胞能力的免疫细胞群体⁴，因此研究其在疫苗接种过程中的功能，对于理解疫苗诱导的免疫应答以及设计针对难治性病原体的未来策略至关重要。

为了准确建立树突状细胞（DC）向淋巴组织迁移的动力学特征，从而深入了解启动疫苗特异性适应性免疫反应的生理机制，理想情况下需要一种能够在疫苗免疫应答过程中追踪不同DC亚群的系统。基于反向遗传学的方法为制备可用于此类研究的减毒活疫苗提供了可能。自反向遗传学技术应用于流感病毒研究以来，基于质粒的反向遗传系统已被广泛用于生成包括减毒活流感疫苗（LAIV）在内的重组流感病毒株。标准的重组流感病毒拯救流程需要将包含八段流感病毒基因组片段的双向质粒（可同时产生正链和负链RNA）共转染至高转染效率的细胞系，并在允许性系统（如Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞和/或鸡胚）中进行扩增⁵。然而，利用反向遗传学技术构建分子工具以研究疫苗接种免疫机制的应用仍尚未充分探索。

通过建立可特异性耗竭包括树突状细胞（DCs）在内的免疫细胞亚群的新小鼠模型，为理解....

方案

动物实验根据批准的方案并遵循德国动物保护法指南进行。所有从事动物实验的工作人员均通过了欧洲实验动物科学协会联合会B类或C类培训项目。

1. 利用反向遗传学技术构建重组减毒流感疫苗

注意：重组流感病毒的反向遗传学生成详细实验方案此前已有研究描述⁵ 且超出本报告的范围。简而言之，冷适应流感疫苗（CAV）的拯救操作在生物安全二级（BSL2）条件下于生物安全二级柜中进行，包括以下详述的步骤。转染与感染方案遵循 Martinez-Sobrido 等.⁵.

1. 利用冷适应株 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 作为背景，结合 A/PR/8/34 (H1N1) 毒株的血凝素（HA）和修饰后的神经氨酸酶（NA），构建重组冷适应流感疫苗（图1A）。NA 基因的修饰是通过 PCR 方法将蛋白茎部一段保守序列（第65至72位氨基酸）替换为编码鸡卵清蛋白（OVA）来源肽段 SIINFEKL 的短cDNA序列（图1B）。SIINFEKL 肽段在 C57BL/6 小鼠 H-2b MHC I 类限制性免疫应答中具有高度免疫优势¹²。
2. 在6孔板中每孔接种 10⁶ 个 293T 细胞，使用含10%胎牛血清（FB....

结果

通过转染含有受双向启动子调控的流感病毒八个节段编码序列的质粒，可实现重组减毒活流感疫苗的制备⁵一种冷适应流感疫苗通常包含六段冷适应毒株的基因片段，以及所选流感毒株的HA和NA。例如，H1N1）（图1A）。冷适应的原理基于病毒在低温条件下的复制受限 33 °C，小鼠和人类上呼吸道的温度¹⁴因此，该疫苗可在上呼吸道一定程度地复制，但不会引起下呼吸道肺炎。利用融合PCR技术，将病毒神经氨酸酶（NA）茎部的一个保守区域替换为可追踪的卵清蛋白来源肽段（SIINFEKL）。图1B).

为了在动力学研究中追踪疫苗特异性反应，我们利用了来自疫苗制剂的可示踪肽段以及嵌合小鼠模型。在接种疫苗后的第3至6天，可在肺引流淋巴结中检测到携带SIINFEKL的CD103⁺ DCs¹²（图2A）。多参数流式细胞术可实现对疫苗来源抗原呈递的实时定量。此外，通过输注SIINFEKL特异性T细胞，可定量疫苗特异性.......

讨论

本研究中，我们描述了如何利用反向遗传学和嵌合小鼠模型来阐明疫苗诱导免疫的生理和分子机制。流感病毒反向遗传学已在许多实验室建立，并在理解流感病毒的致病性、复制和传播方面发挥了核心作用¹⁷。本方案的一个关键点是拯救表达外源表位的冷适应流感疫苗。尽管多个研究团队已报道将短cDNA插入神经氨酸酶茎部的策略，但研究者需确保在鸡胚中生产疫苗时未引入额外突变，并且该疫苗能够在呼吸道中复制而不引发肺炎^5,12。由于病毒神经氨酸酶的茎部以及流感病毒基因组的其他区域（如NS基因片段和PB1片段）均允许插入外源序列^19,20，因此可通过修改本方案，添加额外的外源肽段，例如用于研究针对流感病毒的T细胞免疫应答的层级结构，这对于理性疫苗设计至关重要。

通过结合可示踪疫苗与基于DTR的树突状细胞亚群耗竭技术，我们已能够将基因功能的缺失特异性地靶向至特定细胞亚群。该技术此前已被用于阐明机体对病原体的免疫应答机制²¹，但尚未用于解析介导疫苗保护作用的信号通路。由于DTR模型的可获得性以及该技术在构建嵌合小鼠模型方面的灵活性，该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco´s 改良型 Eagle 培养基（DMEM 1x）	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
OptiMEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamine 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	PAA	p11-010
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153
鸡胚蛋	Valo biomedia Gmbh
PBS (1x)	Sigma-Aldrich	D8537
70 μM 尼龙滤器	Greiner-Biorad	542-070
红细胞裂解缓冲液（RBCL）10x	BD Bioscience	555899
CD16/CD32 小鼠 BD Fc 封闭抗体（2.4G2）	BD Pharmigen	553142
APC 标记抗小鼠 SIINFEKL-H2kb 抗体（25 D1.16）	Biolegend	141605
PE 标记抗小鼠 CD11c 抗体（HLA3）	BD Biosciences	553802
eFluor 450 标记抗小鼠 MHCII 抗体（Md/114.15.2）	eBioscience	48-5321-82
Pe-Cy7 标记抗小鼠 CD11b 抗体（M1/70）	Biolegend	101216
PerCp/Cy5.5 标记抗小鼠 CD103 抗体（2E7）	Biolegend	121416
PE 标记抗小鼠 CD45.1 抗体（A20）	eBioscience	12-0453-82
V500 标记抗小鼠 CD45.2 抗体（1O4）	BD Bioscience	562130
PerCp-eFluor710 标记抗小鼠 CD8a 抗体（53-6.7）	eBioscience	46-0081-80
APC-Cy7 标记抗小鼠 CD3ε 抗体（145-2611）	Biolegend	100325
eFluor450 标记抗小鼠 CD4 抗体（GK 1.5）	eBioscience	48-0041-80
CFSE 增殖染料	eBioscience	65-0850-85
Baytril 2.5%	Bayer	65-0850-85
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
卵清蛋白	Molecular probes	O23020
白喉毒素（DT）	Sigma-Aldrich	D0564
胰蛋白酶-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426
BD FACsCanto II 流式细胞仪	BD Biosciences
FlowJo 细胞分析软件 9.5	Flowjo inc.
台盼蓝染色液（0.4%）	Life technologies	T10282
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen-Life Technologies	C10227