在嵌合小鼠模型中通过鼻内给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫

摘要

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。

摘要

疫苗是人类最伟大的成就之一，在过去的一个世纪中挽救了数百万人的生命。具有讽刺意味的是，人们对介导疫苗免疫反应的生理机制却知之甚少，这或许正是由于疫苗接种总体上非常成功，从而降低了人们对疫苗免疫的分子和生理机制的研究兴趣。然而，包括流感病毒在内的若干重要人类病原体仍然对疫苗接种构成挑战，可能受益于基于免疫的策略。

尽管流感反向遗传学已成功应用于研制减毒活流感疫苗（LAIVs），但在疫苗制剂中添加分子工具（如示踪组分）以追踪疫苗接种动力学的过程 体内，尚未得到解决。此外，近期开发的可在动力学研究期间特异性耗竭白细胞的小鼠模型，为理解疫苗诱导保护作用背后的免疫基本机制提供了新的契机。在此，我们以重组冷适应型减毒活流感疫苗（LAIV）为例，阐述反向遗传学与嵌合小鼠模型相结合的方法如何帮助揭示疫苗在生理和分子水平上的作用机制。我们利用实验室构建的携带细胞示踪标记的LAIV以及竞争性骨髓嵌合小鼠（BMCs），来确定疫苗免疫的早期动力学特征及启动疫苗特异性适应性免疫的主要生理机制。此外，我们展示了该技术如何促进在单个动物体内开展疫苗免疫应答过程中的基因功能研究。我们建议，该技术可应用于改进针对亟需医疗干预措施的病原体（例如流感病毒、HIV）的现有预防策略， 疟原虫以及埃博拉病毒等出血热病毒。

引言

在不引发疾病的情况下产生免疫记忆是高效疫苗接种的生理学基础¹。近年来，基于系统生物学的研究方法发现，诸如黄热病疫苗等成功的疫苗可强烈诱导先天性免疫应答，并激活多种树突状细胞（DC）亚群，进而引发抗原特异性T细胞的多谱系活化^2,3。由于树突状细胞是唯一具有激活抗原特异性初始T细胞能力的免疫细胞群体⁴，因此研究其在疫苗接种过程中的功能，对于理解疫苗诱导的免疫应答以及设计针对难治性病原体的未来策略至关重要。

为了准确建立树突状细胞（DC）向淋巴组织迁移的动力学特征，从而深入了解启动疫苗特异性适应性免疫反应的生理机制，理想情况下需要一种能够在疫苗免疫应答过程中追踪不同DC亚群的系统。基于反向遗传学的方法为制备可用于此类研究的减毒活疫苗提供了可能。自反向遗传学技术应用于流感病毒研究以来，基于质粒的反向遗传系统已被广泛用于生成包括减毒活流感疫苗（LAIV）在内的重组流感病毒株。标准的重组流感病毒拯救流程需要将包含八段流感病毒基因组片段的双向质粒（可同时产生正链和负链RNA）共转染至高转染效率的细胞系，并在允许性系统（如Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞和/或鸡胚）中进行扩增⁵。然而，利用反向遗传学技术构建分子工具以研究疫苗接种免疫机制的应用仍尚未充分探索。

通过建立可特异性耗竭包括树突状细胞（DCs）在内的免疫细胞亚群的新小鼠模型，为理解疫苗诱导保护作用背后的基礎免疫机制开辟了新的可能性。小鼠与人类DC亚群功能的比较表明，小鼠与人类的DC在很大程度上具有功能同源性。^6,7这些发现强烈提示，构建能够在稳态及炎症条件下特异性耗竭树突状细胞（DCs）的小鼠模型，有助于理解人类树突状细胞反应的生理机制。近年来，已构建出多种小鼠模型，其携带的转基因可在目的基因启动子区域的调控下表达猴源白喉毒素（DT）受体（DTR）^8,9由于小鼠组织不天然表达DTR，这些模型可在小鼠接种白喉毒素（DT）后，实现对携带特定靶基因的细胞亚群进行条件性清除。因此，我们能够特异性清除树突状细胞（DCs）及其他白细胞 体内 在生理过程中，DTR介导的重组技术的发展极大地促进了相关研究。尽管这些转基因小鼠模型已被广泛用于解析免疫系统的发生过程，但其在疫苗研发中的应用却鲜有报道。在此，我们结合流感病毒反向遗传学与DTR介导的竞争性骨髓嵌合小鼠模型，提出一种用于研究疫苗免疫动力学及免疫应答过程中单个基因功能的方法。 体内该技术在针对难治性传染病的新疫苗临床前评估中的应用，有助于合理化疫苗设计并筛选候选疫苗。 体内.

方案

动物实验根据批准的方案并遵循德国动物保护法指南进行。所有从事动物实验的工作人员均通过了欧洲实验动物科学协会联合会B类或C类培训项目。

1. 利用反向遗传学技术构建重组减毒流感疫苗

注意：重组流感病毒的反向遗传学生成详细实验方案此前已有研究描述⁵ 且超出本报告的范围。简而言之，冷适应流感疫苗（CAV）的拯救操作在生物安全二级（BSL2）条件下于生物安全二级柜中进行，包括以下详述的步骤。转染与感染方案遵循 Martinez-Sobrido 等.⁵.

1. 利用冷适应株 A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) 作为背景，结合 A/PR/8/34 (H1N1) 毒株的血凝素（HA）和修饰后的神经氨酸酶（NA），构建重组冷适应流感疫苗（图1A）。NA 基因的修饰是通过 PCR 方法将蛋白茎部一段保守序列（第65至72位氨基酸）替换为编码鸡卵清蛋白（OVA）来源肽段 SIINFEKL 的短cDNA序列（图1B）。SIINFEKL 肽段在 C57BL/6 小鼠 H-2b MHC I 类限制性免疫应答中具有高度免疫优势¹²。
2. 在6孔板中每孔接种 10⁶ 个 293T 细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/E）的 DMEM 培养基。
3. 配制质粒转染混合物：分别加入编码流感 A/Ann Arbor/6/60 毒株 PB2、PB1、PA、NP、M、NS 基因的 cDNA 质粒各 1 µg，以及编码 NA-SIINFEKL 和来自流感 A/PR/8/34 毒株 HA 的质粒各 1 µg，再加入预温的 OptiMEM（每孔总量为 100 µl，其中 OptiMEM 体积为 15 µl）。
4. 室温孵育转染混合物 30 分钟。
5. 每孔加入 100 µl 转染混合物，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 小时 。
6. 更换细胞培养基为含 0.3% BSA 和 1% P/E 的 DMEM，在 33 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 5 小时。
7. 向培养体系中加入 10⁶ 个对流感病毒敏感的 MDCK 细胞，使用含 1 µg/ml 牛胰蛋白酶（经 TPCK 处理，即 TPCK-胰蛋白酶）的 DMSO 进行处理。将 293T 与 MDCK 细胞共培养体系在 33 °C、5% CO₂ 条件下维持 2 至 3 天。
8. 收集 MDCK-293T 细胞共培养的上清液，以 260 x g 离心 5 分钟去除细胞碎片。
9. 在无菌条件下接种 9 至 10 日龄的鸡胚。操作时，参照 Martinez-Sobrido et al.⁵ 所述方法，在蛋壳顶部打孔。
10. 用棉签涂抹熔化的石蜡封闭蛋壳开口，并将接种后的鸡胚在 33 °C 条件下孵育 3 天。
11. 采集感染后鸡胚的尿囊液：用 70% 乙醇清洗蛋壳表面，在蛋的上部轻轻敲裂开口，用无菌镊子移除尿囊膜，使用 10 ml 移液管尽可能多地收集液体（通常可得 6–10 ml）。在 4 °C 条件下以 260 x g 离心 10 分钟，将上清液转移至新管中。

2. 追踪疫苗特异性免疫反应

1. 追踪携带肽段的树突状细胞（DCs）
   1. 进行小鼠免疫接种时，使用精密汽化器以氧气中5%异氟烷麻醉小鼠。用200 µl移液器将50 µl含10³空斑形成单位（pfu）表达SIINFEKL肽段的疫苗溶于PBS中，以液滴形式直接施加至小鼠鼻孔。
   2. 接种后第3天，通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死小鼠。
   3. 用镊子在肋骨下方中线处提起小鼠皮肤，用剪刀剪开一小切口。从切口处沿头尾方向分别剪开3–5 cm长的切口，再从中线向两侧各剪开两条2 cm长的横向切口。剥离皮肤以暴露腹膜腔和胸腔。小心剪开腹膜周围膜组织，暴露胸腔。
   4. 为进入纵隔，剪开膈肌及胸廓底部肋骨。寻找并摘取2个位于胸腺稍背侧及外侧、靠近头臂动脉、紧邻气管腹侧面的纵隔淋巴结（mLNs）。
   5. 使用弯头镊摘取mLNs。将镊子置于淋巴结下方，轻柔提起。将淋巴结置于含1 ml DMEM的6孔板中，并清除周围结缔组织或脂肪组织。
      1. 使用连接于1 ml注射器的两根26 G针头充分研磨每个样本。操作时，用一根针固定淋巴结，另一根针刺破组织。正确操作时，可见大量细胞从淋巴结中释放至培养基中。将所有组织材料通过70 µm尼龙滤器，以获得单细胞悬液。
   6. 将单细胞悬液在冷藏离心机中以260 × g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于2 ml红细胞裂解（RBCL）缓冲液中，以裂解红细胞。室温下裂解3分钟。
   7. 通过离心并用2 ml冰预冷的PBS重悬细胞，中和RBCL缓冲液作用。
   8. 将细胞以10⁷个细胞/ml的浓度接种于U型96孔板中，终体积为100 µl。
   9. 进行流式细胞术分析时，在冰上用每10⁶个细胞加入1 µg抗小鼠CD16/CD32抗体封闭Fc受体，孵育15分钟。
   10. 离心板后通过轻弹去除上清液。向各孔加入选定的表面抗体组合进行孵育。通常检测淋巴结中树突状细胞时，抗体混合液应包含：抗CD11c 0.25 µg、CD11b 0.25 µg、MHC II类分子0.5 µg、CD103 0.25 µg和CD8α 0.15 µg，终体积为100 µl。
   11. 为进行阴性门控，加入0.25 µg抗CD3、CD19、NK1.1抗体或谱系抗体混合液（图2A）。其他门控策略以及多荧光染料补偿校正的详细方案可参考免疫基因组计划（Immunological Genome Project）网站。除所选表面标志物外，还需在抗体混合液中加入1 µg针对与SIINFEKL结合的H-2K^b的抗体。该商业可得抗体可用于检测SIINFEKL肽段与表面MHC I类分子结合的DCs。
   12. 将细胞在冰上与表面抗体孵育30分钟，避光。以260 × g离心5分钟，用2 ml PBS洗涤两次。将细胞转移至流式管中进行分析。
2. 评估疫苗特异性T细胞增殖
   1. 从小鼠TCR转基因（OT-I小鼠）（C57BL/6-Tg(Tcr aTcrb)1100Mjb/J）中获取供体T细胞，这些小鼠产生的所有CD8 T细胞均特异性识别SIINFEKL肽段。通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死小鼠。通过腹腔切口摘取脾脏。将脾脏置于每脾2 ml DMEM中，并去除结缔组织和脂肪组织。
   2. 按照2.1.2和2.1.3所述方法制备脾脏单细胞悬液。
   3. 为进一歩富集T细胞，采用磁珠分选技术，通过阳性或阴性筛选方案¹²。为区分供体与受体细胞，使用同源品系小鼠，例如受体小鼠表达白细胞标志物CD45.1，而供体T细胞表达CD45.2¹²。
   4. 标记T细胞时，将细胞在含5 µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的1 ml PBS中孵育，细胞密度为5 × 10⁶个细胞/ml。37 °C避光孵育20分钟。孵育后以260 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于3 ml胎牛血清（FBS）中以中和CFSE。
   5. 以260 × g离心10分钟，重悬于适量PBS中，使100 µl溶液含2 × 10⁶个细胞。通过眶后静脉窦注射向受体同源小鼠每只注入2 × 10⁶个细胞¹³。
   6. 在接种后第3、4、5天，通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死受体小鼠。摘取纵隔淋巴结，并按2.1.2–2.1.5所述方法制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
   7. 通过在100 µl含0.25 µg抗小鼠CD3、CD4和CD8抗体及0.5 µg抗小鼠CD45.1或CD45.2抗体（根据供体细胞表型选择）的抗体混合液中染色，鉴定供体细胞。保持流式细胞仪FL-1通道（FITC）开放，以检测CFSE的稀释情况¹²（图2B）。

3. 嵌合小鼠用于解析基因特异性的疫苗应答

注意：利用基于DTR的小鼠模型生成竞争性骨髓嵌合体，可区分免疫应答疫苗过程中特定细胞的功能。本文展示了一种补充策略，即将表达DTR的供体细胞与基因敲除小鼠的细胞联合使用，从而研究特定细胞区室在免疫反应中基因的特异性功能。在本示例中，我们构建了在Langerin⁺CD103⁺树突状细胞（DCs）中特异性缺失Toll样受体3（TLR3）的小鼠模型。

1. 骨髓供体细胞的制备
   1. 在生物安全二级柜内操作。使用经高压灭菌的器械以避免污染。
   2. 为构建骨髓嵌合小鼠，使用同源性CD45.1⁺ C57BL/6雌性小鼠作为受体，使用TLR3^-/-、Langerin-DTR/EGFP或表达CD45.2⁺的野生型小鼠作为供体。使用同源性供体与受体小鼠可通过流式细胞术区分供体与受体来源的细胞，从而评估移植情况。
   3. 为获取供体骨髓细胞，先以异氟烷麻醉处死供体小鼠，随后行颈椎脱位。用锋利剪刀在踝关节周围做切口，暴露肌肉组织。
   4. 用钝头镊子从踝部向髋部方向轻柔地剥离小鼠皮肤和毛发，使腿部肌肉可见。
   5. 用锋利剪刀在髋部水平及股骨头部上方切断小鼠后肢。
   6. 将断肢置于培养皿中并置于冰上。迅速操作，去除全部肌肉以暴露骨骼。
   7. 分离股骨和胫骨。将骨骼置于70%乙醇溶液中5分钟以去除可能存在的细菌，随后立即转移至另一含有5 ml无血清DMEM的培养皿中。用锋利剪刀剪去骨端，用连接5 ml注射器的26 G针头将骨髓冲洗至DMEM中。冲洗时，将1 ml DMEM注入骨内，确保冲洗后骨骼呈白色（空心状）。
   8. 将所有供体小鼠的骨髓细胞收集于10 ml DMEM中。通过70 µm细胞滤网过滤，制备单细胞悬液。
   9. 将骨髓单细胞悬液在4 °C下以260 × g离心10分钟（使用冷冻离心机），去除上清。将细胞沉淀重悬于10 ml PBS中。按照2.1.3和2.1.4所述方法，使用RBCL溶液裂解红细胞。
   10. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数骨髓细胞。通过台盼蓝染色¹³检测细胞活力。理想情况下，单只小鼠可获得约3 × 10⁷个白细胞/小鼠，细胞活力至少达80%。
   11. 在构建全骨髓嵌合小鼠时，准备TLR3^-/-或野生型供体细胞。最佳细胞浓度为2 × 10⁷个细胞/ml，因移植时将使用100 µl PBS中含有2 × 10⁶个细胞。若不立即使用，应采用缓慢冷冻法将供体细胞保存于含10% DMSO的FBS中，置于-80 °C。对于混合嵌合模型，将Langerin-DTR供体细胞与TLR3^-/-供体细胞按75:25比例混合。为构建对照小鼠，制备75 : 25的Langerin-DTR : 野生型骨髓细胞混合物。
2. 小鼠辐照与移植
   1. 对6–8周龄的雌性小鼠使用铯-137辐照仪进行辐照。分两次给予550 rad剂量，间隔4 hr 。分次辐照可最小化急性肝毒性，从而降低因辐照方案导致的小鼠死亡率。
   2. 辐照后，给予小鼠为期两周的抗生素治疗。通过饮水给予拜耳菌素（Baytril），剂量为2.5–5 mg/kg。
   3. 第二次辐照后2–4 hr ，通过尾静脉注射将供体骨髓细胞移植至小鼠体内。在异氟烷麻醉下，通过眶后静脉窦注射方式进行细胞注射¹³，最大注射体积为100 µl PBS，含2 × 10⁶个细胞。
   4. 移植后四周，采集100 µl外周血样本，使用至少可检测两种荧光的流式细胞仪评估嵌合率。为区分供体细胞与放射抗性受体细胞，使用商品化的荧光标记CD45.1和CD45.2抗小鼠抗体，稀释比例为1/100至1/200。理想情况下，供体细胞在外周血总造血细胞中的嵌合率应至少达到80%。
3. 免疫接种与靶向清除
   1. 通过鼻内接种重组减毒活流感疫苗对小鼠进行免疫。免疫前，使用精密汽化器以5%异氟烷在氧气中麻醉小鼠。使用200 µl移液器给予50 µl PBS，其中含10³个空斑形成单位（pfu）的疫苗。
   2. 为构建最终小鼠模型，通过鼻内给予50 ng白喉毒素（DT），溶于50 µl PBS中。按照3.3.1所述方法，将DT逐滴直接滴入麻醉小鼠的鼻孔。从免疫前第-2天开始，每日给药，持续至免疫后第2天（图3B）。

结果

通过转染含有受双向启动子调控的流感病毒八个节段编码序列的质粒，可实现重组减毒活流感疫苗的制备⁵一种冷适应流感疫苗通常包含六段冷适应毒株的基因片段，以及所选流感毒株的HA和NA。例如，H1N1）（图1A）。冷适应的原理基于病毒在低温条件下的复制受限 33 °C，小鼠和人类上呼吸道的温度¹⁴因此，该疫苗可在上呼吸道一定程度地复制，但不会引起下呼吸道肺炎。利用融合PCR技术，将病毒神经氨酸酶（NA）茎部的一个保守区域替换为可追踪的卵清蛋白来源肽段（SIINFEKL）。图1B).

为了在动力学研究中追踪疫苗特异性反应，我们利用了来自疫苗制剂的可示踪肽段以及嵌合小鼠模型。在接种疫苗后的第3至6天，可在肺引流淋巴结中检测到携带SIINFEKL的CD103⁺ DCs¹²（图2A）。多参数流式细胞术可实现对疫苗来源抗原呈递的实时定量。此外，通过输注SIINFEKL特异性T细胞，可定量疫苗特异性...

讨论

本研究中，我们描述了如何利用反向遗传学和嵌合小鼠模型来阐明疫苗诱导免疫的生理和分子机制。流感病毒反向遗传学已在许多实验室建立，并在理解流感病毒的致病性、复制和传播方面发挥了核心作用¹⁷。本方案的一个关键点是拯救表达外源表位的冷适应流感疫苗。尽管多个研究团队已报道将短cDNA插入神经氨酸酶茎部的策略，但研究者需确保在鸡胚中生产疫苗时未引入额外突变，并且该疫苗能够在呼吸道中复制而不引发肺炎^5,12。由于病毒神经氨酸酶的茎部以及流感病毒基因组的其他区域（如NS基因片段和PB1片段）均允许插入外源序列^19,20，因此可通过修改本方案，添加额外的外源肽段，例如用于研究针对流感病毒的T细胞免疫应答的层级结构，这对于理性疫苗设计至关重要。

通过结合可示踪疫苗与基于DTR的树突状细胞亚群耗竭技术，我们已能够将基因功能的缺失特异性地靶向至特定细胞亚群。该技术此前已被用于阐明机体对病原体的免疫应答机制²¹，但尚未用于解析介导疫苗保护作用的信号通路。由于DTR模型的可获得性以及该技术在构建嵌合小鼠模型方面的灵活性，该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco´s 改良型 Eagle 培养基（DMEM 1x）	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
OptiMEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamine 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	PAA	p11-010
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153
鸡胚蛋	Valo biomedia Gmbh
PBS (1x)	Sigma-Aldrich	D8537
70 μM 尼龙滤器	Greiner-Biorad	542-070
红细胞裂解缓冲液（RBCL）10x	BD Bioscience	555899
CD16/CD32 小鼠 BD Fc 封闭抗体（2.4G2）	BD Pharmigen	553142
APC 标记抗小鼠 SIINFEKL-H2kb 抗体（25 D1.16）	Biolegend	141605
PE 标记抗小鼠 CD11c 抗体（HLA3）	BD Biosciences	553802
eFluor 450 标记抗小鼠 MHCII 抗体（Md/114.15.2）	eBioscience	48-5321-82
Pe-Cy7 标记抗小鼠 CD11b 抗体（M1/70）	Biolegend	101216
PerCp/Cy5.5 标记抗小鼠 CD103 抗体（2E7）	Biolegend	121416
PE 标记抗小鼠 CD45.1 抗体（A20）	eBioscience	12-0453-82
V500 标记抗小鼠 CD45.2 抗体（1O4）	BD Bioscience	562130
PerCp-eFluor710 标记抗小鼠 CD8a 抗体（53-6.7）	eBioscience	46-0081-80
APC-Cy7 标记抗小鼠 CD3ε 抗体（145-2611）	Biolegend	100325
eFluor450 标记抗小鼠 CD4 抗体（GK 1.5）	eBioscience	48-0041-80
CFSE 增殖染料	eBioscience	65-0850-85
Baytril 2.5%	Bayer	65-0850-85
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
卵清蛋白	Molecular probes	O23020
白喉毒素（DT）	Sigma-Aldrich	D0564
胰蛋白酶-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426
BD FACsCanto II 流式细胞仪	BD Biosciences
FlowJo 细胞分析软件 9.5	Flowjo inc.
台盼蓝染色液（0.4%）	Life technologies	T10282
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen-Life Technologies	C10227