本方案的目的是利用一种台式、自动化、第二代细胞富集装置，制备针对病原体的临床级T细胞。该装置采用封闭式细胞因子捕获系统，无需专业人员操作，也无需使用GMP设施。所生成的巨细胞病毒pp65特异性T细胞可直接用于患者治疗。
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方法文章
使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性T细胞的自动化富集及其临床应用
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
过继性转移病原体特异性T细胞可用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后发生的伺机性感染，例如巨细胞病毒（CMV）感染。来自异基因供体（包括第三方供体）的病毒特异性T细胞可在体外（ex vivo）通过符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的流程进行扩增，该流程采用多轮抗原驱动的刺激，以选择性扩增所需的T细胞。抗原特异性T细胞的鉴定与分离也可基于细胞因子捕获系统（CCS）进行，该系统针对已被激活并分泌γ-干扰素（IFN-γ）的T细胞。然而，由于该生产过程耗时较长且需要熟练操作人员，细胞因子捕获系统在人类免疫重建中的广泛应用受到限制。第二代细胞富集装置（如CliniMACS Prodigy）的开发使研究人员能够利用自动化、劳动强度更低的系统来生成病毒特异性T细胞。该装置采用磁性激活细胞分选技术，将磁标记细胞与未标记细胞分离，从而生成符合临床级标准的产品，其设计为封闭系统，可在实验台面上直接操作。本文展示了利用这一新型自动化细胞富集装置，从CMV血清学阳性供体的稳态单采血液制品中制备CMV pp65特异性T细胞的操作过程。所分离的T细胞可在机构和联邦监管监督下直接输注给患者。所有生物处理步骤，包括红细胞去除、T细胞刺激、抗原特异性T细胞分离、纯化和洗涤，均实现全自动化。此类装置的出现使得用于人体的T细胞制备可能不再局限于专用的药品生产质量管理规范（GMP）设施，而可在血库设施中完成，由工作人员监督自动化程序以生产多种产品。
引言
造血干细胞移植（HSCT）1 可与过继性T细胞治疗联合应用，以增强移植物抗肿瘤效应，并提供对机会性感染的免疫保护2。传统上，生成供体来源的抗原特异性T细胞用于输注需要熟练的技术人员以及符合GMP标准的专用设施。此类T细胞的输注已成功清除机会性感染3，并治疗潜在的恶性疾病4。最近，研究人员已证实，仅回输数千个病毒特异性T细胞（约 1 × 104 – 2.5 × 105 个细胞/kg 受体体重）即可有效治疗异基因HSCT后出现的机会性巨细胞病毒（CMV）感染5-9。然而，由于GMP设施数量有限、相关细胞制备对技术要求较高，以及细胞生产成本高昂，患者获得此类有前景的T细胞治疗的机会受到限制10。一种分离抗原特异性T细胞的方法基于CCS技术，使用一种双特异性试剂识别CD45和IFN-γ。如图所示，该方法可利用自动化细胞富集CCS装置制备符合临床级标准的CMV特异性T细胞（图1B）。
通过将来自CMV血清阳性供体的白细胞分离术获得的总核细胞（TNC）与CMV pp65抗原的重叠肽段共同孵育，可生成CMV特异性T细胞。这些肽段在人类白细胞抗原（HLA）的呈递背景下，激活TNC中的CMV pp65特异性T细胞分泌IFN-γ。随后这些T细胞可被“捕获”并通过磁性分离。第一代细胞富集装置....
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方案
1. 在无菌条件下准备材料（参见材料与设备表）
- 配制3 L PBS/EDTA缓冲液，并加入人血清白蛋白（HSA）至终浓度为0.5%（w/v）。
- 准备1 L临床级0.9%氯化钠（NaCl）溶液和2 L符合GMP标准的细胞培养基。
- 通过将一管CMV pp65溶解于8 ml无菌水中，重悬获得60 nmol的CMV特异性肽抗原混合物。
- 使用鲁尔接头/穿刺连接器将CMV pp65肽混合物转移至50 ml冷冻袋中，并用锁紧止血钳夹闭，防止混合物进一步流入管路系统。在无菌条件下打开细胞富集管路系统（TS 500）。
- 使用无菌管路焊接仪，将肽混合物冷冻袋连接至管路系统TS 500的阀2管路接口。此时切勿打开肽混合物袋的夹子。
- 从起始细胞产品中取出1 × 109个总核细胞（TNC），重悬于含2.5% HSA的PBS/EDTA缓冲液中，总体积为50 ml。将细胞产品注入150 ml转移袋中。
2. 自动化细胞富集系统的制备与使用（参见材料与设备表）
- 启动细胞富集系统（图1B），并选择程序“CCS_IFN-γ Enrichment”。观察用户界面，屏幕上会显示操作步骤说明和图片，指导操作人员完成整个流程。
- 输入参数“操作人员”和....
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结果
本研究中，采用自动化细胞富集CCS系统，用于自动化制备针对巨细胞病毒（CMV）pp65特异性T细胞。从三个单采血液成分产品中富集获得CMV特异性T细胞。稳态单采血液成分产品自CMV血清阳性供者采集，历时2小时，共获得1010个总有核细胞（TNC）。取109个TNC，使用CMV pp65来源的肽段（60 nmol）激活4小时，随后利用自动化细胞富集装置上的CCS系统分离分泌IFN-γ的T细胞。实验开始时需操作人员加载所有试剂和管路组件。系统从初次拆包至启动设备的设置过程约需60至120分钟。需注意，设备可在加载试剂和管路组件后进行编程，实现自动启动，从而支持无人值守运行（例如过夜操作）。15小时后需再次由操作人员对终产品进行细胞纯度和活力的表征分析。富集后，收集细胞上清液检测支原体和内毒素是否存在。经验证合格后，处理后的细胞可直接输注给患者，或冻存以用于后续应用。
细胞计数根据细胞计数的标准操作流程，使用表2中提供的公式进行确定。每种类型的细胞计数均重复三次，结果以总细胞数的平均值±标准差（SD）表示。随后.......
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讨论
过继性T细胞治疗已成为治疗B细胞恶性肿瘤的一种可行方案4。其治疗潜力取决于输注足够数量、具有靶向抗原特异性且未发生复制性衰老的T细胞2。为此，可在符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的条件下，从扩增后的T细胞中分选出高纯度的抗原特异性T细胞群体。目前广泛采用两种分选方法，即荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠激活细胞分选（MACS），用于制备巨细胞病毒（CMV）抗原特异性T细胞，我们近期已对此进行综述5。不同策略之间的优势比较见表5。与FACS技术相比，MACS技术在成本更低、速度更快的同时，可实现最高的细胞富集纯度。此外，使用一次性柱子和试剂进行细胞富集可完全避免样本间的交叉污染，更易于在临床环境中应用。半自动化的细胞富集设备劳动强度大且耗时较长，因此为满足临床需求，开发自动化细胞富集设备势在必行。
自动细胞富集CCS装置是一种多功能仪器，可用于分离临床级细胞，例如造血干细胞、体细胞干细胞以及用于过继性转移的T细胞。该自动化装置集成了细胞处理的多个步骤，包括起始材料的组分分离、细.......
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披露
MD 安德森癌症中心和库珀博士均在 ZIOPHARM Oncology, Inc. 和 Intrexon Corporation 拥有经济利益。2015年5月7日，库珀博士被任命为 ZIOPHARM Oncology 的首席执行官。 目前，库珀博士是 MD 安德森癌症中心的访问科学家。库珀博士创立并拥有 InCellerate, Inc. 公司。他与 Sangamo BioSciences 公司在人工核酸酶方面拥有多项专利。他担任 Targazyme, Inc.（前身为 American Stem Cells, Inc.）、GE Healthcare、Ferring Pharmaceuticals、Fate Therapeutics、Janssen Pharmaceuticals 和 Bristol-Myers Squibb 公司的顾问。他还是 Cellectis 公司科学咨询委员会成员。他从 Miltenyi Biotec 公司获得酬金。
致谢
我们感谢德国 Miltenyi Biotec 提供用于评估研究的试剂和 CliniMACS Prodigy 仪器。我们感谢 George T. McNamara（美国安德森癌症中心儿科）对稿件的校对。基金支持：癌症中心核心资助（CA16672）；RO1（CA120956，CA124782，CA141303；CA141303）；R33（CA116127）；P01（CA148600）；Burroughs Wellcome 基金会；德克萨斯州癌症预防与研究所；CLL 全球研究基金会；Noelan L. Bibler 遗产基金；Gillson Longenbaugh 基金会；Harry T. Mangurian, Jr. 白血病免疫治疗基金；个性化癌症治疗研究所；白血病与淋巴瘤学会；淋巴瘤研究基金会；MDACC 姐妹机构网络基金；Miller 基金会；Herb Simons 先生；Joe H. Scales 先生及夫人；Thomas Scott 先生；国家癌症研究基金会；儿科癌症研究基金会；William Lawrence 和 Blanche Hughes 儿童基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CliniMACS PBS/EDTA 缓冲液 3 L 袋装 | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy 管路套装 TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L 废液袋 | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS 细胞因子捕获系统（IFN-γ） | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| 白蛋白（人源）25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/穿刺连接器 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9% NaCl 溶液（1 L） | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| 注射用水 | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV 滤器单元 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP 培养基 2 L 袋装 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| 转移袋，150 ml（用于细胞起始材料） | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS 冻存袋 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml 注射器，无菌 | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV 血清学阳性单采产品 | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| 流式细胞术材料 | 生产厂家 | 目录编号 | |
| AB 血清，GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE，人源 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| 碘化丙啶溶液（100 µg/ml） | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| 设备 | 生产厂家 | 目录编号 | |
| CliniMACS Prodigy 仪器 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| 软件 V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| 软件 2.4 | |||
| 离心机 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| 无菌管路焊接仪 SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
参考文献
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al.
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重印与许可
