Ex Vivo 利用共聚焦宏观成像技术观察出生后小脑颗粒细胞迁移

摘要

在出生后小脑发育过程中，起源于生发区的未成熟颗粒细胞表现出不同的迁移模式，以到达其最终位置并建立神经元网络。本方案描述了小脑切片的制备方法以及利用共聚焦宏观成像技术研究调控神经元迁移因素的实验方法。

摘要

出生后发育过程中，未成熟的颗粒细胞（兴奋性中间神经元）首先在小脑外颗粒层中进行切向迁移，随后在分子层和浦肯野细胞层中进行径向迁移，最终到达小脑皮层的内颗粒层。迁移过程异常可导致细胞死亡或神经元定位错误，进而引起多种小脑功能缺陷。颗粒细胞向心性迁移涉及多种机制，例如趋化性及细胞外基质降解，以引导细胞到达最终位置，但目前对各皮层中调控细胞迁移的具体因子仍了解有限。在本方法中，取出生10天（P10）大鼠制备急性小脑脑片，用荧光细胞质标记物标记颗粒细胞，将组织置于膜插件上培养4至10小时，随后在37 °C、含CO₂条件下，通过共聚焦宏成像技术实时监测细胞迁移过程。在颗粒细胞穿越小脑不同皮层区域迁移的过程中，可施加神经肽激动剂或拮抗剂、蛋白酶抑制剂、细胞内效应分子阻断剂，甚至乙醇或甲基汞等毒性物质，以研究这些因素在神经元迁移调控中的可能作用。

引言

在发育中的小脑中，啮齿类动物从胚胎第二周到出生后第二周会依次产生八种不同类型的神经元¹。未成熟颗粒细胞（GC）最初起源于一个主要生发区，是继发性生发区——外颗粒层（EGL）所产生的最后一批神经元²。在出生后的前三周内，小脑皮层呈叶状结构，由四层组成，包括EGL、分子层（ML）、浦肯野细胞层（PCL）和内颗粒层（IGL）（图1）。未成熟的GC作为谷氨酸能中间神经元，通过向心性迁移，在大约2天内到达IGL。到出生后第三周，EGL消失，IGL即形成成年小脑中所谓的颗粒层（GL）。在GL中，GC接收来自苔藓纤维和单极刷状细胞的兴奋性突触输入，以及来自戈尔吉细胞轴突的抑制性突触输入。在ML中，GC的轴突与GABA能神经元（包括浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和戈尔吉细胞）形成兴奋性突触²。

通过对出生后早期啮齿类动物小脑急性切片中细胞运动的实时观察表明，颗粒细胞（GC）在其迁移过程中伴随迁移方式和速度的变化而同步改变其形态³。在出生后的前两周内，GC前体细胞在外部颗粒层（EGL）顶部活跃增殖。在EGL中层区域，终末有丝分裂后的GC沿其较大突起的方向进行切向迁移。当到达EGL-分子层（ML）交界处时，GC迁移速度减慢，并开始进入短暂的垂直下行过程进入ML。在ML中，GC具有垂直拉长的胞体、细长的尾随突起以及更为粗大的前端突起，并沿伯格曼胶质细胞纤维进行径向迁移。在颗粒细胞层（PCL）中，GC停止迁移，但在经历一段较长的静止期（约2小时）后，会跨越PCL-内颗粒层（IGL）边界进入IGL。在IGL中，GC在缺乏胶质纤维支持的情况下向该层底部迁移。当前端突起的尖端接近IGL-白质（WM）边界时，GC迁移速度减慢并最终停止。为研究EGL中的切向迁移，通常采用小脑的横断切片；而研究ML、PCL和IGL中的径向迁移则使用矢状切片。目前已鉴定出一些调控GC运动的因子，包括神经肽（e.g.，生长抑素、PACAP）等，但各皮层区域中GC迁移时空调控的完整机制仍远未阐明^1,4,5,6。

过去20年中，通过视频显微镜和共聚焦显微镜，利用透射光照明观察分离培养的细胞，或通过荧光检测观察急性小脑切片，研究人员对颗粒细胞（GC）的迁移过程进行了研究。最初使用疏水性染料DiI，而近年来则更多采用“Cell Tracker”染料以及细胞表达的荧光蛋白，用于共聚焦或双光子显微镜观察^7,8。成功的实验依赖于一系列特定的操作步骤，使得该方案虽结构简单但实际操作并不容易。特别是，在观察过程中必须对急性切片进行稳定，通常使用自制的尼龙网架⁹。光照强度应尽可能降低，以避免光毒性和光漂白，这一点可借鉴多点扫描共聚焦显微镜的方法。此外，温度和CO₂是关键的环境参数，其不稳定可能影响神经元的迁移。为了简化并优化实验流程，我们开发了一种共聚焦宏显微镜技术，该方法可限制切片移动，确保环境参数恒定，减少光漂白，扩大视野范围（达到毫米量级），从而增加可通过图像分析追踪的细胞数量（数十个）。具体而言，将180 µm厚的小脑切片培养在膜插件上，随后将6孔板直接转移至商用共聚焦宏显微镜下方，该设备配备有大型培养室、温度与CO₂控制器以及振动控制系统，物镜为2X电动物镜。随后可在数小时内连续采集延时图像和z轴层扫图像，并可在培养基中添加药理学工具或生物活性分子。该方法也可经适当调整，用于研究不同发育阶段小脑或其他脑区其他类型神经元的迁移过程。

方案

动物（雄性或雌性Wistar大鼠）在经认证的动物饲养设施中（批准号：B.76-451-04）出生并繁殖，该设施遵循法国《实验动物护理与使用指南》。实验在授权研究人员（M.B、D.V. 和 L.G.）的监督下进行，符合欧盟委员会指令（2010/63/UE，2010年9月22日）以及法国农业部的相关规定。

1. 培养基与工具的准备

1. 在生物安全柜中，将含有 CaCl₂（1.85 g/l）/MgSO₄（0.9767 g/l）但不含 MgCl₂ 的 10 倍浓缩液用无菌水稀释，配制成 1 倍 Hank’s BSS（HBSS）溶液。向 1 倍 HBSS 溶液中加入 NaHCO₃（350 µg/ml）。
2. 在生物安全柜中，将 N2 添加剂（来自 100 倍浓缩液）以及青霉素（100 单位/ml）-链霉素（0.1 mg/ml）溶液加入 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）与营养混合物 F-12（1 : 1）中。
3. 在无菌条件下，将细胞质荧光染料 Cell Tracker Green 配制成 DMSO 溶液（1 mg 溶于 1.075 ml，分装为每份 25 µl，2 mM）。取一份分装液溶于 15 ml 锥形管中的 5 ml DMEM 培养基中进行稀释。
4. 准备装满冰的冰桶，以保持培养基在 4 °C。
5. 使用 70% 乙醇对实验台面和实验工具进行去污染处理。

2. 从 P10 大鼠中解离小脑

1. 使用弯头手术剪在耳后迅速切断幼鼠（P10）头部，以获取脊髓起始部位。
2. 在去头的鼠头背面，用精细虹膜剪从颈部至鼻部沿中线剪开皮肤，并用精细虹膜剪和Dumont #3镊子将皮肤与颅骨分离。
3. 用精细虹膜剪从颅骨基部向头侧方向小心地做两条侧向切口。用两把#3镊子取下已分离的颅骨，并用同一镊子将脑组织与颅骨残留的附着物分离。
4. 用刮勺末端将脑组织转移至含有2 ml冰浴HBSS培养基的培养皿（Ø 35 mm）中。
5. 将盛有脑组织的培养皿置于装满冰块的大培养皿（Ø 100 mm）中，并转移至体视显微镜载物台上。
6. 在体视显微镜下，使用两把#3镊子通过撕裂法分离小脑。同样方法去除残留的脊髓和软脑膜。
7. 用刮勺末端将小脑转移至新的盛有HBSS培养基的培养皿（Ø 35 mm，2 ml）中，并保持在冰上。

3. 急性小脑切片的制备

1. 在体视显微镜下，沿图中双头箭头所示位置，于小脑蚓部与右半球之间进行切割。 图2A 使用标准的#3号实心手术刀柄和#15号手术刀片。
2. 在振动切片机样品盘上滴加一滴氰基丙烯酸酯胶水，静置15–25秒以消除有毒溶剂蒸气。
3. 用解剖勺一端收集切下的小脑，并用干净的纸巾吸去多余的HBSS。
4. 将小脑靠近标本盘。将切缘固定在标本盘上，等待10秒。
5. 使用操作器将样本盘插入缓冲槽中，并旋转样本盘，使小脑的横轴与刀架垂直。用内六角扳手固定样本盘，然后轻轻向缓冲槽中加入HBSS培养基，直至完全覆盖小脑组织。
6. 将碎冰加入冷却浴中。
7. 用70%乙醇将刀片清洗三次，以去除任何油渍。
8. 将刀片插入刀架中，并用夹紧螺钉固定。
9. 将刀刃边缘置于样本后缘（从使用者视角）正后方 将其定义为起点。使用前进指令，在试样前缘之后定义终点。
10. 将切片速度设为2.5，切片频率设为8，选择修块模式 厚度设为180 µm，开始切片。
11. 使用宽口玻璃截断巴斯德移液管逐片拾取，并转移至置于冰上的含 HBSS 的培养皿（Ø 35 mm）中。
12. 使用两把5号镊子，在妨碍刀片操作时小心去除小脑的脑膜。每只小脑最多收集5个切片（图2B、C).
13. 在体视显微镜下，使用两把#5镊子小心去除小脑切片的软脑膜，并轻柔分离小脑叶，以利于探针加载。

4. 活体中间神经元的荧光染色

1. 使用宽口玻璃截断的巴斯德移液管将小脑切片转移至6孔板中（每孔最多3个切片）。吸除HBSS培养基。
2. 将切片（最多3个）置于5 ml荧光染料负载溶液（10 µM）中孵育。
3. 为避免光照，用铝箔包裹培养板。将其置于以35 rpm旋转的摇床上，在室温下孵育10分钟，以促进细胞标记。
4. 使用宽口玻璃截断的巴斯德移液管将切片转移至Transwell插入式培养小室的膜上（孔径3.0 µm；图2D）。用移液管吸除负载溶液。
5. 取出插入式小室，向孔中加入1.9 ml DMEM培养基，再将插入式小室放回，并在切片上方加入100 µl DMEM以覆盖组织。
6. 将含有培养插入小室的培养板放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育2小时，此时间足以在分子层（ML）中观察到颗粒细胞（GCs）。使组织平放，以利于其附着在插入小室的膜上（图2E）。确保切片不干燥。

5. 离体 通过共聚焦宏观成像

1. 将无塑料盖的培养板放入与共聚焦宏观显微镜支架相连的培养箱中。在显微镜的培养板插件上放置玻璃盖玻片。保持腔室温度为 37.0 °C ± 0.5 °C，并通过培养板插件持续通入混合气体（95% O₂，5% CO₂），以维持 pH 恒定。在开始延时成像实验前，额外孵育 2 小时。
2. 为观察组织切片中颗粒细胞（GC）的迁移，使用配备 X2 干式物镜（工作距离：39 mm，直径：58 mm，NA = 0.234）的共聚焦激光扫描宏观显微镜，通过激光二极管以 488 nm 波长光照射样品，并检测 500 至 530 nm 范围内的荧光发射信号。
   1. 为更清晰地分辨颗粒细胞的运动，以 1.5 至 2.0 倍的额外光学放大倍数采集图像。每 30 分钟采集一次颗粒神经元（GN）在单一焦平面或沿 z 轴最多 10 个不同焦平面的图像，持续最长 12 小时。
3. 必要时，移去玻璃盖玻片，使用 10 µl 移液器向 DMEM 中加入少量（1–10 µl）生物激活剂或抑制剂，以研究其对颗粒细胞迁移的影响。

6. 细胞示踪

1. 对于电影的每个时间点，使用 ImageJ 中的 ecart-type 模式进行 z-stack 投影。调节连续图像的对比度和亮度水平，以方便识别和追踪标记的颗粒细胞（GCs）。在参考快照（t = 0 时）上手动标定每个位置。
   1. 在“分析颗粒”菜单中使用“手动追踪”插件，通过点击延时过程中每个细胞体的重心点来确定其位置。将原始追踪数据导出至电子表格中。
2. 使用自主开发的智能程序（http://primacen.fr，采用 PHP 代码编写）对从 ImageJ 导出的原始追踪数据进行重组，该程序可识别每个细胞及其对应的位置。利用该程序计算每个细胞的总迁移距离和平均迁移速度。在相同程序中，通过适当的筛选条件对对照组和处理组条件下细胞迁移特征进行分类和比较。

结果

在出生后早期的小脑中，颗粒细胞（GCs）在穿越不同皮层时，其迁移方式和速度表现出显著变化¹（图1）。本节展示了在天然细胞环境中研究GC迁移所能获得的部分结果示例。对P10大鼠小脑组织切片用绿色荧光染料标记后，在共聚焦宏观显微镜下进行观察（图3A），结果显示GCs在分子层（ML）中呈放射状迁移，平均速度为18 µm/hr（图3B, C）。迄今为止，神经元与胶质细胞之间的相互作用/通讯在调控各皮层细胞迁移过程中所涉及的调节因子及分子机制仍 largely 未知。因此，关键问题在于识别可能在迁移过程中参与调控各皮层特异性速度变化的神经肽、神经递质、神经营养因子以及细胞外基质成分。垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）主要在浦肯野细胞层（PCL）中检测到，但在出生后前两周的大鼠小脑中，也在分子层（ML）和颗粒层（IGL）中存在^7,10,11。将PACAP38（10^-6 M）加入培养基后，导致ML中GC的迁移速度下降79%。例如，GCs在ML中的迁移速度从对照条件下的11.9 µm/hr降至给予PACAP38后的2.5 µm/hr（图4A）。组织型纤溶酶原激活物（tPA）是导致细胞外基质（EM）成分（如细胞黏附分子或层粘连蛋白）降解的蛋白水解级联反应的一员^12,13。tPA及其底物纤溶酶原在出生后小脑发育期间的皮层各层中均可检测到^14,15,16。加入内源性tPA的抑制剂PAI-1（10^-7 M）后，ML中GC的迁移减少了78%。例如，GCs在ML中的迁移速度从对照条件下的19.2 µm/hr降至添加PAI-1后的4.2 µm/hr（图4B）。这些结果表明，PACAP对GC的运动具有直接抑制作用，而丝氨酸蛋白酶tPA则促进发育期大鼠小脑ML中GC的迁移。

图1：出生后小脑皮层中颗粒细胞（GC）迁移的三维示意图。1-4，颗粒细胞突起的延伸及在外颗粒层（EGL）中的切向迁移。5，沿伯格曼胶质纤维在分子层（ML）中的径向迁移。6，在浦肯野细胞层（PCL）中的短暂静止阶段。7，在内颗粒层（IGL）中不依赖胶质细胞的径向迁移。8，颗粒细胞在内颗粒层（IGL）中完成迁移。GC，颗粒细胞，红色表示；EGL，外颗粒层；B，伯格曼胶质细胞，深紫色表示；G，高尔基细胞，黄色表示；cf，攀爬纤维，蓝色表示；g，迁移后颗粒细胞，浅绿色表示；IGL，内颗粒层；mft，苔藓纤维终末，深绿色表示；ML，分子层；P，浦肯野细胞，浅紫色表示；PCL，浦肯野细胞层。该图改编自⁵。

图2： 离体培养P10小鼠小脑切片。（A）来自P10大鼠的小脑组织解剖图。比例尺 = 6 mm。（B）通过体视显微镜观察的活体180 µm厚小脑切片显微图像。比例尺 = 3 mm。（C）在更高放大倍数下，小脑的四层皮质结构（外颗粒层EGL、分子层ML、浦肯野细胞层PCL、内颗粒层IGL）已可清晰分辨。比例尺 = 1 mm。（D）经荧光标记后，将组织切片置于培养插件（直径24 mm）中，并放入6孔板内。（E）带有组织培养处理的聚酯膜的培养插件示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：P10 大鼠小脑皮层各层中颗粒细胞（GCs）的动态迁移。（A）P10 大鼠小脑切片的宏观共聚焦图像（xyz，二维投影），其中颗粒细胞（GCs）被绿色胞质荧光染料标记。比例尺 = 75 µm。（B）在对照条件下，通过共聚焦宏观成像连续记录颗粒细胞（GCs）在分子层（ML）中迁移过程，持续 4 小时。星号（*）标记颗粒细胞的胞体。每张显微照片底部标注了经过的时间（单位：分钟）。比例尺 = 10 µm。（C）颗粒细胞胞体迁移距离的连续变化。

图 4：神经肽与蛋白酶抑制剂对颗粒细胞（GC）迁移的影响。（A）在对照条件下，通过共聚焦宏观显微镜追踪分子层（ML）中的颗粒细胞（GC）2 小时，随后在垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）存在下继续追踪 2 小时。（B）在对照条件下，通过共聚焦宏观显微镜追踪分子层（ML）中的颗粒细胞（GC）2 小时，随后在纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）存在下继续追踪 2 小时。

讨论

本方案描述了在Transwell系统中培养新生后10天（P10）大鼠小脑急性脑片，并使用绿色荧光染料对颗粒细胞（GC）进行荧光标记，以通过共聚焦宏成像技术研究出生后发育过程中的细胞迁移。该方案可实现长达12小时的细胞迁移过程观察，并可在实验过程中检测多种调节因子在细胞迁移中的潜在作用，包括神经肽的激动剂或拮抗剂、酶抑制剂、细胞信号通路调节剂或有毒物质。为便于向培养基中添加化合物，需使用移液枪头在膜插件上打一个小孔。可使用自制的弯头移液枪头以更方便地递送溶液。

在活体组织切片上进行细胞迁移研究的一个问题是，组织本身的运动可能导致细胞追踪困难。尽管以往的方法提出使用尼龙网或一层薄的鼠尾胶原来轻柔地稳定切片^7,17，但该技术的主要优势在于，可将含有小脑切片的膜插件六孔培养板直接从CO₂培养箱转移至共聚焦宏镜的物镜下进行观察。集成的温度和CO₂控制器还能提供细胞迁移所必需的适宜且稳定的环境参数⁹。因此，在观察过程中可维持培养条件，同时由于切片牢固地附着在膜插件上，组织运动被最小化。通过追踪切片边缘或浦肯野细胞的位置（在图像采集期间应保持固定）可验证组织的稳定性。此外，分布在六孔板各孔中的小脑切片（每孔12至18片）可通过电动载物台和光学变焦快速地进行详细观察。由于干式物镜具有较大的工作距离（X2，39 mm），表层观察无需浸液，向培养基中添加化合物也更加方便。因此，CO₂培养箱与共聚焦宏镜在环境参数和培养支持条件上的高度一致性，有助于生物样本的最大程度保存。

该方案的另一个优势是视场大，因而能够同时观察到大量细胞。例如，我们此前已确定，分子层（ML）中呈放射状迁移的荧光颗粒细胞（GCs）密度为 1124 ± 138 个细胞/mm^{2 18}。共聚焦宏成像（X2，NA = 0.234）与共聚焦显微成像（40X，NA = 1.25）相比，横向分辨率较低，但颗粒细胞的细胞体仍可被轻松追踪，并且两种技术测得的细胞迁移平均速度具有可比性^7,18。

除了图像采集技术的改进外，组织切片的质量和标记的质量是实验成功的关键因素。在解剖过程中，应始终将培养基和组织置于冰上，清除振动切片机刀片上的油渍，并避免使用接触过胶水的组织切片。小脑的矢状切面适用于观察放射状迁移，而横切面则适用于观察切向迁移。针对小脑不同皮层区域的检测，应采用不同的孵育时间。较长的孵育时间（长达8小时）对于检测颗粒细胞层（PCL）和内颗粒层（IGL）中大量颗粒细胞（GC）的迁移是必要的。由于颗粒细胞的迁移是在特定时空窗口内发生的生理过程，因此阳性对照的标准是细胞必须能够正常迁移。特别是，分子层（ML）中存在大量纺锤形颗粒细胞，是小脑矢状切片健康状态的主要指标之一。对于初学者，建议首先在分子层观察颗粒细胞的运动。实际上，应将细胞体呈垂直拉长的纺锤形态的颗粒细胞作为参考标准，以此为起点开始进行成像采集，并依次进行对照（2小时）和处理（2小时）阶段，这些操作在分子层中较易实现。

荧光染料（如Cell Tracker系列）或通过基因构建表达的荧光蛋白可用于细胞迁移研究中的示踪。由于颗粒细胞（GC）迁移动力学较慢（每30分钟采集一个图像栈），系统配备4种激光（405、488、532和633 nm），因此多色实验也可采用顺序成像模式进行。考虑到向心性和离心性径向迁移，该方法也可用于追踪其他中间神经元¹⁸。特别是对于数量较少的细胞类型，使用大视野更易于定位。最后，本方案不仅可用于研究小脑发育其他阶段的细胞迁移，也可应用于其他脑区的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’DMEM/F12培养基	Sigma-Aldrich	D8437
Hank's 平衡盐溶液 10x	Sigma-Aldrich	H1641
PACAP38	加拿大 INRS		Bourgault 等, 200919
PAI-1	Calbiochem	528208
N-2 补充剂	赛默飞世尔科技 / 吉布科 / 英维特罗根	O973
氰基丙烯酸酯胶水	Loctite
细胞示踪绿 CMFDA	Invitrogen	C2925
聚酯Transwell-Clear小室	康宁	3452
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781
6孔细胞培养板	康宁	3516
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
35 mm 直径组织培养皿	BD Falcon	353004
直径100 mm的组织培养皿	Thermo SCIENTIFIC	130182
聚丙烯管（15 ml）	BD Falcon	352096
70% 乙醇	Fisher Chemical	E/0800DF/21
生物安全柜 通风橱	赛默飞世尔科技	MSC9 II类A2
可调体积移液器（0.5–10 µL	Eppendorf	4910 000.018
Gyro-rocker，SSL3	Stuart
CO2 孵育箱，Hera Cell 150	赛默飞世尔科技
振动刀片切片机，VT1000S	徕卡显微系统
共聚焦宏观显微镜，TCS LSI	Leica Microsystems
温度控制器	PeCon
CO2控制器	PeCon
体视显微镜，M205 C	Leica Microsystems
手术剪，弯型，钝/钝	Medicon	03.03.17
硬化精细虹膜剪，直型，尖端双刃	FST	149090-11
Dumont #3 和 #5 镊子	FST	11293-00 和 11252-20
振动切片机注射刀片/单刃	徕卡显微系统	39053250
标准手术刀柄 #3 实心	FST	10003-12
手术刀片 #15	Swann-Morton	205