小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

摘要

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。

摘要

将小鼠胚胎干细胞（ESC）诱导分化为神经前体细胞的能力，使得研究调控神经特化的机制以及生成用于进一步研究的成熟神经细胞类型成为可能。在本实验方案中，我们描述了一种在无血清、单层培养条件下将ESC分化为神经前体细胞的方法。该方法具有可扩展性、高效性，可在4至6天内获得约70%的神经前体细胞。该方法适用于在不同培养条件下生长的多种品系的ESC。神经前体细胞可进一步分化为功能性神经元和胶质细胞，也可通过显微镜观察、流式细胞术或分子生物学技术进行分析。该分化过程适用于活细胞延时成像，并可结合报告基因细胞系以监测神经特化过程。我们提供了详细的培养基制备和细胞密度优化步骤，以确保该方法可广泛应用于大多数ESC细胞系及多种细胞培养器皿。

引言

胚胎干细胞是从早期胚胎中分离得到的多能细胞，具有无限增殖的能力 体外 同时保留了在重新引入适当发育阶段的胚胎后（通过形成嵌合体）、注射到同系或免疫缺陷宿主后（通过形成畸胎瘤）分化为所有成体细胞类型的能力，或 体外 受适当信号的调控¹。该 体外 小鼠胚胎干细胞向神经谱系的分化最早于1995年被描述，该方法涉及在含血清并添加形态发生素视黄酸的培养基中形成多细胞悬浮聚集体（类胚体，EBs）。^2-4此后，已开发出多种方案以实现神经分化⁵许多方法仍采用聚集法，其他方法则与诱导性细胞类型共培养，还有一些涉及使用无血清培养基。所有方案均有其优缺点，且所产生的神经细胞或神经元细胞的具体特性也因所采用的方案不同而有所差异。

理想的方案应具有高度稳健性、可扩展性，使用成分明确的培养基和基质，便于对分化过程进行无创监测，并能够在相对较短的时间内高效、高产量地获得纯度较高的神经前体细胞群体；这些神经前体细胞应能响应外部信号诱导进行模式化，并进一步分化为所有类型的神经元和胶质细胞。在过去的十二年中，我们一直采用一种在低密度、无血清、贴壁单层培养条件下由小鼠ESC诱导生成神经前体细胞及神经元的方法。^6-10该方案满足了上述多项标准：在我们的实验中，该分化方法的效率在多年间及多种细胞系中均表现出良好的一致性，可灵活放大或缩小规模（我们已成功使用从96孔板到直径15 cm培养皿的各种容器），所用培养基成分明确。该过程适用于活细胞延时显微成像以监测分化进程，并可添加多种模式诱导信号，以诱导生成不同类型的神经元亚型。例如， Shh 和 Fgf8 在多巴胺能神经元中的作用⁶).

然而，该方案的成功应用仍存在一些挑战。其中一个关键方面是培养基的仔细制备。尽管有商业化的替代产品，我们始终自行配制培养基。所使用的某种添加剂（N2；见方案）与标准的商业化版本相比有所改良。最后，该方法成功应用的最重要步骤之一是接种时达到最佳的细胞密度。这主要是因为其中一个诱导信号分子（Fgf4¹¹）具有自分泌特性，需要存在足够数量的细胞以保证最佳的存活率和分化能力；但密度过高时，分化能力会受到抑制（可能部分归因于LIF¹²的自分泌产生）。因此，必须仔细且一致地进行培养基制备和细胞接种，以确保获得最佳结果。

方案

1. 培养基制备

注意：该实验方案依赖于两种不同培养基的混合使用：DMEM/F12 添加改良型 N2 补充剂，以及 Neurobasal 添加 B27 补充剂，通常按 1:1 比例混合。

1. 通过在15 ml离心管中混合各组分来配制改良N2补充剂。切勿涡旋或过滤该溶液；通过反复倒置离心管直至溶液澄清来进行混匀。
   1. 首先用移液器加入7.2 ml DMEM/F12，然后加入1 ml浓度为25 mg/ml的胰岛素（溶于0.01 M HCl中），通过反复倒置离心管充分混匀。溶液澄清约需数分钟。
   2. 加入1 ml浓度为100 mg/ml的apo-转铁蛋白（溶于水中）、33 µl浓度为0.6 mg/ml的孕酮（溶于乙醇中）、100 µl浓度为160 mg/ml（1 M）的腐胺（溶于水中）、10 µl浓度为3 mM的亚硒酸钠（溶于水中）以及666 µl浓度为7.5%的牛血清白蛋白，充分混匀。分装成每份2.5 ml，于-20 °C保存，可保存长达2个月。
2. 配制培养基。
   1. 向250 ml DMEM/F12中加入2.5 ml N2补充剂，充分混匀，但不要震荡或过滤。
   2. 向250 ml Neurobasal培养基中加入5 ml B27补充剂，充分混匀，但不要震荡或过滤。
   3. 将步骤1.2.1和1.2.2中的培养基按1:1比例混合。在某些情况下可能需要1:3的比例（补充方式同1.2.4步骤中的1:1混合液）。
   4. 向混合液中加入0.5 ml L-谷氨酰胺（终浓度0.2 mM）和3.5 µl 2-巯基乙醇（终浓度0.1 mM），轻轻混匀，避免震荡。将培养基于4 °C保存，可保存长达3周，并避免光照。此最终混合液称为N2B27。
3. 配制明胶溶液。
   1. 用超纯水配制1%明胶溶液，在121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟。用于此操作的瓶子必须彻底清除洗涤剂或消毒剂残留，因此建议使用新瓶子，并且每次使用后仅用超纯水冲洗。将1%溶液分装为每份50 ml，于4 °C保存数月。
   2. 将一份1%明胶溶液置于37 °C水浴中加热至溶解，加入500 ml预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀，用移液器吸取适量覆盖每个孔或培养板底部。让明胶在表面包被至少30分钟。

2. 细胞接种

注意：本方案同样适用于在以下条件下培养的小鼠胚胎干细胞（ESC）：含10%血清和白血病抑制因子（LIF）的培养基、含血清替代物和LIF的培养基，或含LIF及骨形态发生蛋白4（BMP4）的无血清培养基，或含MEK和GSK3抑制剂（2i培养基）并有或无LIF的培养基。然而，分化的时间和效率可能因培养基和细胞类型的不同而有所差异（见讨论部分）。本实验中所展示的结果使用的是46C小鼠ESC系（该细胞系在一个内源性Sox1等位基因中敲入了EGFP报告基因），在GMEM培养基中添加10%血清和LIF进行培养。为获得最佳结果，关键步骤是将细胞解离后重新接种至N2B27培养基中；若仅将培养基从GMEM/血清/LIF更换为N2B27，而不进行细胞重铺板，总会导致分化效率降低。

1. 在GMEM培养基中培养细胞，添加10%血清、1 mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、0.1 M 2-巯基乙醇和100单位/毫升LIF¹³为了获得小鼠胚胎干细胞的亚融合培养物，接种 1 x 10⁶ 将细胞接种至T25培养瓶中，培养时间为2-3天。
2. 在明场显微镜下观察细胞。当细胞处于亚融合状态并准备传代时，用PBS洗涤细胞两次。加入1 ml细胞解离试剂，放回培养箱中孵育2–5分钟。尽管胰蛋白酶及其他酶也可用于细胞解离，但可能对细胞贴壁产生不利影响，因此需要调整接种密度。
3. 当细胞开始从培养板上脱落时，轻敲容器，使细胞分散成单细胞悬液。用总共10 ml的培养基和细胞解离试剂收集细胞，并用移液器转移至15 ml离心管中。
4. 在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。
5. 小心吸除上清液，将沉淀物用 10 ml 预热的 N2B27 培养基重悬，轻轻吹打 3–5 次。吹打时，将移液枪头紧贴离心管管壁缓慢释放液体，以避免产生气泡。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并记录细胞浓度。
6. 在预热的N2B27培养基中制备细胞悬液，使其浓度达到每平方厘米接种10,500个细胞的密度。² 在6孔板中（即， 1 × 10⁵ 每孔6孔板的细胞数）为最佳。参见 表1 建议每平方厘米的细胞数量² 以及多种细胞培养容器的铺板培养基体积。
7. 吸出培养容器中的明胶，并根据建议的密度和体积接种细胞悬液 表1不要晃动培养板，以免细胞聚集到中心。将培养物置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中₂.
8. 每1至2天更换一次培养基，用新鲜的N2B27完全替换原有培养基。吹打时动作需轻柔，以免冲刷细胞影响细胞密度，进而降低后续分化效率。若铺板后初始细胞活力较差，可将细胞接种于N2与B27补充培养基按1:3比例混合的培养基中，并在前两天后更换为N2B27。细胞将开始分化，并应表现出 Sox1 4至6天内出现表达（通过此处使用的46C细胞系中报告基因的绿色荧光可见）。

3. 免疫荧光染色

注意：该方案可适用于任何类型的容器。每种试剂的体积均以6孔板的每孔为单位进行描述，可根据表面积按比例调整。由于后续细胞存活率较低，不建议进行重铺板操作。

1. 移除分化培养基，并通过加入 500 µl 的 4% (v/v) 多聚甲醛固定细胞，静置 15 分钟。
2. 用 2 ml PBS-T（含 0.5% (v/v) Tween-20 的磷酸盐缓冲盐水）洗涤并透化细胞，重复两次。细胞可在 4 °C 下保存于 PBS-T 中，最长可达 2 个月。
3. 将 PBS-T 替换为含 10% (v/v) 血清（与二抗同源物种）的 1 ml PBS-T。在室温下置于摇床上孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。
4. 孵育 1 小时后，用 2 ml PBS-T 洗涤细胞两次，然后加入 500 µl 针对 βIII-微管蛋白的小鼠 IgG 抗体（用含 10% 血清的 PBS-T 按 1:1,000 稀释）。置于摇床上，4 °C 过夜孵育。
5. 从本步骤开始，始终避免光照。用 PBS-T 洗涤细胞两次，然后加入 500 µl 荧光标记的抗小鼠 IgG 抗体（用含 10% 血清的 PBS-T 稀释至 2 µg/ml）。在室温下置于摇床上孵育 1 小时。
6. 用 PBS-T 再次洗涤细胞两次，然后加入 500 µl DAPI（用 PBS-T 稀释至 0.5 µg/ml），静置 5 分钟。
7. 再次洗涤细胞，并将细胞保存在 PBS-T 中。细胞即可进行拍照观察，且可在 4 °C 下保存最多 2 周。需注意 GFP 信号会随时间减弱，因此不宜比较固定细胞与活细胞之间，或在不同时间点固定的细胞之间的 GFP 荧光强度。

结果

在本实验中，我们使用了46C细胞系¹⁴，即带有内源性Sox1-GFP报告基因的小鼠胚胎干细胞，以追踪神经分化过程。通过使用该细胞系，可利用绿色荧光检测神经前体细胞标志物Sox1的表达。铺板密度是实现神经分化的关键因素。将小鼠胚胎干细胞以不同的密度接种于6孔板中，密度范围为10,500至88,500个细胞/cm²。图1A展示了在6孔板中不同铺板密度所达到的分化效率。在分化第6天，细胞用4%多聚甲醛固定，并对神经元标志物βIII-微管蛋白进行染色。在最佳密度（10,500个细胞/cm²）下，细胞分化为神经前体细胞和神经元，这可通过Sox1-GFP报告基因的绿色荧光信号以及针对神经元标志物βIII-微管蛋白的免疫荧光染色观察到。过低的铺板密度会导致细胞在3天内死亡；然而，过高的铺板密度（>36,500个细胞/cm²）则导致绿色荧光细胞和βIII-微管蛋白阳性细胞的比例下降。图1B展示了一项在96孔板中进行的实验，该实验需要约10倍更高的细胞密度才能达到最佳密度（155,000个细胞/cm<...

讨论

单层神经分化方案已应用十余年⁶。该方案效率高，采用成分明确的培养基，并在单层体系中进行，使其更适用于临床前（例如，药物筛选）应用。然而，存在一些决定分化效率的关键因素。本文指出了这些因素及每种障碍的解决方案。

细胞在分化条件下接种后的密度可能是最关键的因数。接种密度过高会降低分化效率，而密度过低则会导致细胞死亡。这一现象可能与自分泌生长因子信号传导有关。Fgf4是一种自分泌生长因子，可激活MAPK级联反应并促进胚胎干细胞（ESC）分化¹¹。LIF是ESC产生的另一种细胞因子，它可激活STAT3通路并促进自我更新¹⁵。本实验方案采用N2B27培养基诱导神经细胞生成。N2B27含有多种支持ESC存活并促进神经细胞生长的因子，且不含会抑制神经分化的LIF和BMP4⁶。在合适的细胞密度下，Fgf4与LIF信号通路之间可维持适当的平衡，从而使ESC得以分化。当密度过高时，过量的自分泌LIF和BMP会抑制分化；相反，在密度过低的情况下，细胞在此类较为基础的培养基中存活能力受损。因此，若观察...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Life Technologies	A11105-01
B-27 添加剂，无血清	Life Technologies	17504-044
胰岛素	Sigma	I6634	用无菌的 0.01 M HCl 重悬
去铁转铁蛋白	Sigma	T1147	用无菌水重悬
孕酮	Sigma	P8783	用乙醇重悬
腐胺	Sigma	P5780	用无菌水重悬
亚硒酸钠	Sigma	S5261	用无菌水重悬
牛血清白蛋白 V 组分	Life Technologies	15260-037
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081	使用前确保完全溶解，因为谷氨酰胺通常会沉淀
明胶	Sigma	G1890
6 孔组织培养皿	Thermo Scientific	140675
24 孔组织培养皿	Thermo Scientific	142475
96 孔组织培养皿	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM 非必需氨基酸溶液	Life Technologies	11140-050
丙酮酸钠	Life Technologies	11360-070
2-巯基乙醇	Sigma	M7522
白血病抑制因子	参照 Smith 1991 年《组织培养方法杂志》自行制备
吐温-20	Sigma	P1379
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Sigma	D9542	避光保存
小鼠抗 βIII 微管蛋白 IgG 抗体	Covance	MMS-435P
荧光标记的抗小鼠 IgG 抗体	Life Technologies	A31571	避光保存
25 cm2 组织培养瓶	Thermo Scientific	156367