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小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

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DOI：

10.3791/52823

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2015年5月14日

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

本文内容

摘要

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。

摘要

将小鼠胚胎干细胞（ESC）诱导分化为神经前体细胞的能力，使得研究调控神经特化的机制以及生成用于进一步研究的成熟神经细胞类型成为可能。在本实验方案中，我们描述了一种在无血清、单层培养条件下将ESC分化为神经前体细胞的方法。该方法具有可扩展性、高效性，可在4至6天内获得约70%的神经前体细胞。该方法适用于在不同培养条件下生长的多种品系的ESC。神经前体细胞可进一步分化为功能性神经元和胶质细胞，也可通过显微镜观察、流式细胞术或分子生物学技术进行分析。该分化过程适用于活细胞延时成像，并可结合报告基因细胞系以监测神经特化过程。我们提供了详细的培养基制备和细胞密度优化步骤，以确保该方法可广泛应用于大多数ESC细胞系及多种细胞培养器皿。

引言

胚胎干细胞是从早期胚胎中分离得到的多能细胞，具有无限增殖的能力 体外 同时保留了在重新引入适当发育阶段的胚胎后（通过形成嵌合体）、注射到同系或免疫缺陷宿主后（通过形成畸胎瘤）分化为所有成体细胞类型的能力，或 体外 受适当信号的调控1。该 体外 小鼠胚胎干细胞向神经谱系的分化最早于1995年被描述，该方法涉及在含血清并添加形态发生素视黄酸的培养基中形成多细胞悬浮聚集体（类胚体，EBs）。2-4此后，已开发出多种方案以实现神经分化5许多方法仍采用聚集法，其他方法则与诱导性细胞类型共培养，还有一些涉及使用无血清培养基。所有方案均有其优缺点，且所产生的神经细胞或神经元细胞的具体特性也因所采用的方案不同而有所差异。

理想的方案应具有高度稳健性、可扩展性，使用成分明确的培养基和基质，便于对分化过程进行无创监测，并能够在相对较短的时间内高效、高产量地获得纯度较高的神经前体细胞群体；这些神经前体细胞应能响应外部信号诱导进行模式化，并进一步分化为所有类型的神经元和胶质细胞。在过去的十二年中，我们一直采用一种在低密度、无血清、贴壁单层培养条件下由小鼠ESC诱导生成神经前体细胞及神经元的方法。6-10该方案满足了上述多项标准：在我们的实验中，该分化方法的效率在多年间及多种细胞系中均表现出良好的一致性，可灵活放大或缩小规模（我们已成功使用从96孔板到直径15 ....

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方案

1. 培养基制备

注意：该实验方案依赖于两种不同培养基的混合使用：DMEM/F12 添加改良型 N2 补充剂，以及 Neurobasal 添加 B27 补充剂，通常按 1:1 比例混合。

  1. 通过在15 ml离心管中混合各组分来配制改良N2补充剂。切勿涡旋或过滤该溶液；通过反复倒置离心管直至溶液澄清来进行混匀。
    1. 首先用移液器加入7.2 ml DMEM/F12，然后加入1 ml浓度为25 mg/ml的胰岛素（溶于0.01 M HCl中），通过反复倒置离心管充分混匀。溶液澄清约需数分钟。
    2. 加入1 ml浓度为100 mg/ml的apo-转铁蛋白（溶于水中）、33 µl浓度为0.6 mg/ml的孕酮（溶于乙醇中）、100 µl浓度为160 mg/ml（1 M）的腐胺（溶于水中）、10 µl浓度为3 mM的亚硒酸钠（溶于水中）以及666 µl浓度为7.5%的牛血清白蛋白，充分混匀。分装成每份2.5 ml，于-20 °C保存，可保存长达2个月。
  2. 配制培养基。
    1. 向250 ml DMEM/F12中加入2.5 ml N2补充剂，充分混匀，但不要震荡或过滤。
    2. 向250 ml Neurobasal培养基中加入5 ml B27补充剂，充分混匀，但不要震荡或过滤。
    3. 将步骤1.2.1和1.2.2中的培养基按1:1比例混合。在....

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结果

在本实验中，我们使用了46C细胞系14，即带有内源性Sox1-GFP报告基因的小鼠胚胎干细胞，以追踪神经分化过程。通过使用该细胞系，可利用绿色荧光检测神经前体细胞标志物Sox1的表达。铺板密度是实现神经分化的关键因素。将小鼠胚胎干细胞以不同的密度接种于6孔板中，密度范围为10,500至88,500个细胞/cm2。图1A展示了在6孔板中不同铺板密度所达到的分化效率。在分化第6天，细胞用4%多聚甲醛固定，并对神经元标志物βIII-微管蛋白进行染色。在最佳密度（10,500个细胞/cm2）下，细胞分化为神经前体细胞和神经元，这可通过Sox1-GFP报告基因的绿色荧光信号以及针对神经元标志物βIII-微管蛋白的免疫荧光染色观察到。过低的铺板密度会导致细胞在3天内死亡；然而，过高的铺板密度（>36,500个细胞/cm2）则导致绿色荧光细胞和βIII-微管蛋白阳性细胞的比例下降。图1B展示了一项在96孔板中进行的实验，该实验需要约10倍更高的细胞密度才能达到最佳密度（155,000个细胞/cm<.......

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讨论

单层神经分化方案已应用十余年6。该方案效率高，采用成分明确的培养基，并在单层体系中进行，使其更适用于临床前（例如，药物筛选）应用。然而，存在一些决定分化效率的关键因素。本文指出了这些因素及每种障碍的解决方案。

细胞在分化条件下接种后的密度可能是最关键的因数。接种密度过高会降低分化效率，而密度过低则会导致细胞死亡。这一现象可能与自分泌生长因子信号传导有关。Fgf4是一种自分泌生长因子，可激活MAPK级联反应并促进胚胎干细胞（ESC）分化11。LIF是ESC产生的另一种细胞因子，它可激活STAT3通路并促进自我更新15。本实验方案采用N2B27培养基诱导神经细胞生成。N2B27含有多种支持ESC存活并促进神经细胞生长的因子，且不含会抑制神经分化的LIF和BMP46。在合适的细胞密度下，Fgf4与LIF信号通路之间可维持适当的平衡，从而使ESC得以分化。当密度过高时，过量的自分泌LIF和BMP会抑制分化；相反，在密度过低的情况下，细胞在此类较为基础的培养基中存活能力受损。因此，若观察.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由泰国教育部授予W.W.的科技发展与推广奖学金以及Tenovus和Anonymous Trust基金授予M.P.S.的资助支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清Life Technologies10270-106
DMEM/F12Life Technologies11320-074
Neurobasal 培养基Life Technologies21103-049
StemPro Accutase 细胞解离试剂Life TechnologiesA11105-01
B-27 添加剂，无血清Life Technologies17504-044
胰岛素SigmaI6634用无菌的 0.01 M HCl 重悬
去铁转铁蛋白SigmaT1147用无菌水重悬
孕酮SigmaP8783用乙醇重悬
腐胺SigmaP5780用无菌水重悬
亚硒酸钠SigmaS5261用无菌水重悬
牛血清白蛋白 V 组分Life Technologies15260-037
L-谷氨酰胺Life Technologies25030-081使用前确保完全溶解，因为谷氨酰胺通常会沉淀
明胶SigmaG1890
6 孔组织培养皿Thermo Scientific140675
24 孔组织培养皿Thermo Scientific142475
96 孔组织培养皿Thermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM 非必需氨基酸溶液Life Technologies11140-050
丙酮酸钠Life Technologies11360-070
2-巯基乙醇SigmaM7522
白血病抑制因子参照 Smith 1991 年《组织培养方法杂志》自行制备
吐温-20SigmaP1379
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）SigmaD9542避光保存
小鼠抗 βIII 微管蛋白 IgG 抗体CovanceMMS-435P
荧光标记的抗小鼠 IgG 抗体Life TechnologiesA31571避光保存
25 cm2 组织培养瓶Thermo Scientific156367

参考文献

  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A....

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SOX1 GFP Beta III

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