通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

摘要

受体转运可调节细胞对配体的信号转导及反应性，并且其自身也响应细胞内的各种条件，包括配体诱导的信号通路。本文中，我们介绍一种强大且灵活的技术，通过免疫标记和共定位分析，定量评估药物诱导的受体转运。

摘要

受体内吞转运是一系列复杂且高度受控的过程。受体的转运调控着信号转导以及细胞对配体的整体反应性，并且其本身也受到细胞内和细胞外环境的影响，包括配体诱导的信号通路。本实验方案优化用于单层培养的细胞，但也可扩展至悬浮组织切片，通过免疫标记与共定位分析，追踪受体在慢性/长期或急性干预（包括外源性药物处理）后细胞内转运的变化。药物处理后，细胞将针对目标受体以及特定细胞内区室的标志物进行双重免疫标记。随后利用连续共聚焦显微镜获取单个细胞的双通道显微图像，并通过计算机共定位分析获得定量的共定位评分。这些评分经过标准化处理，以便在统计分析前合并独立重复实验的数据。代表性显微图像也可进一步处理以生成示意图。本文中，我们介绍了一种强大且灵活的技术，可用于定量评估诱导性受体转运过程。

引言

受体，尤其是G蛋白偶联受体（GPCRs），通常会在细胞内往返于细胞表面进行转运¹。这些高度协调且受到严密调控的过程决定了细胞可利用的受体组成，并调节受体的时间活性、脱敏和再敏化过程^2–4。重要的是，这些过程会响应细胞环境的变化，包括药物诱导的受体激活或失活。也就是说，配体在受体上的作用可以改变这些受体的细胞内转运，从而改变细胞的反应性。通过这种方式，外部配体对细胞功能产生更多影响，甚至超越了经典的信使到效应器级联途径^5,6。

研究诱导的受体转位过程中的此类变化十分困难，所有现有的技术均存在局限性。生物素保护实验已被用于监测细胞表面受体的数量。在该方法中，受体被生物素标记，并通过一系列时间点的免疫沉淀来定量随时间推移生物素化受体的减少情况。该技术本质上是监测最初被标记的受体群体随时间逐渐降解的过程⁷，对于构建该过程的时间进程曲线非常有用。然而，该实验无法监测除原始受体池降解以外的任何其他过程，例如内吞、再循环或新受体的生成。此外，在分子量约为50 kDa的受体上结合一个分子量在150 kDa范围内的抗体，可能会影响受体的转位行为^8,9，并且该技术在低表达水平受体的研究中可能难以应用。

其他方法采用多种手段来鉴定细胞内运输区室（例如，内体等），并评估其与目标受体的共定位情况。这包括使用异源表达系统，表达带有荧光蛋白标签的受体嵌合体以及区室标记物（例如，Rab家族GTP酶）。这种方法可能实现活细胞成像，从而避免固定和通透处理带来的问题。尽管功能强大，此类策略仍存在异源系统普遍存在的局限性：标签和表达水平可能影响运输行为，且难以适用于更接近生理状态的细胞类型。更为常见的方法是使用染料对细胞内区室进行简便标记（例如，溶酶体，理论上）¹⁰。然而，染料可能缺乏特异性（如溶酶体染料会标记所有酸性细胞器），且无法评估物质通过其他区室的运输过程。尽管如此，这些技术仍可在系统和实验条件方面提供较大控制性，并可受益于下文所述的共定位分析方法。

本文介绍的方法通过共定位技术改进了对受体转运过程的追踪。利用免疫细胞化学（ICC）标记适当的标志物，可识别多种不同的细胞内区室。该方法还允许使用具有生理相关性的原代细胞培养体系，替代异源表达系统。该ICC实验方案要求在标记前先固定目标细胞，从而可在药物处理后的特定时间点进行标记，获得该时间点上受体与细胞器整体关联情况的“快照”。通过设置多个时间点，还可构建受体转运动态变化的时间序列。

简而言之，细胞经药物处理后，对目标受体和胞内区室进行标记，通过共聚焦显微镜成像，随后对显微图像进行分析，以数学方法定量评估受体与区室的共定位¹¹。在我们的应用中，检测了受体与Rab5、Rab11以及溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的共定位情况。这些标志物分别用于识别早期内体、再循环内体和溶酶体。这些共定位指标可作为内吞、再循环和降解等整体过程的替代参数¹²。

与所有技术一样，该方法也存在一些局限性。由于需要对每一个被分析的神经元进行成像，因此该技术的工作量可能相当大，具体取决于涉及的实验条件和时间点的数量。此外，所有免疫标记实验都必须考虑固定和通透处理对细胞超微结构、蛋白质定位以及抗原表位可及性所带来的影响¹³。

尽管该方法最初是针对初级感觉神经元的原代培养进行优化的，但它也广泛适用于其他单层培养的细胞模型。

使用数学量化方法来衡量共定位，相较于以往评估受体转运变化的技术，在方法学上显著更为严谨；此前的技术往往依赖于模糊且主观的判断方式，例如通过肉眼观察多通道叠加图像¹⁴。

该技术因其与多种系统的广泛兼容性而尤为实用 体内 干预（在原代培养建立之前）， 体外 干预措施（培养生长期间）及多种标记靶点¹⁵因此，该方法可适用于多种不同的研究问题。

方案

注意：本方案广泛适用于多种单层培养的细胞/组织培养模型、药物处理方案以及标记靶点。因此在实际应用中，许多具体参数将根据实验设计而有所不同。此处对这些用户自定义参数的描述均为通用性说明。用于获得代表性结果的示例条件以斜体标出。

1. 溶液

1. 通过混合0.1 M Tris缓冲高渗（300 mM）盐水和0.05%吐温20（Polysorbate 20），在室温下调节pH至7.4，制备洗涤缓冲液。
2. 制备封闭缓冲液：向0.05 M Tris缓冲高渗（300 mM）盐水中加入0.05%吐温20、3%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%冷鱼皮明胶，并在室温下调节pH至7.4。
3. 制备抗体稀释液：向0.05 M Tris缓冲高渗（300 mM）盐水中加入0.05%吐温20、1% BSA和0.1%冷鱼皮明胶，并在4 ^oC下调节pH至7.4。 
   注意：Tris缓冲液的pH值具有温度依赖性，即温度变化会导致溶液pH值改变。为保持一致性，这些缓冲液应在使用温度下进行pH调节。

2. 细胞培养

注意：适当的细胞培养方案会因所使用的细胞类型而异，必须单独优化。详细的细胞培养方法已有广泛资料可供参考，包括文献¹⁶。获得代表性结果时采用了类似方案，但存在以下显著差异：

1. 按照文献¹²所述方法，从成年动物中培养背根神经节神经元。使用成年神经元生长培养基进行细胞培养。通过预铺板法降低胶质细胞密度，而非使用谷氨酸处理。由此可获得混合的神经元-胶质细胞培养物，接种于24孔板中的12孔圆形玻璃盖玻片上，每孔至少含有30–60个神经元，胶质细胞生长至约40%融合度。需要注意的是，原代培养中的神经元不会增殖，若共培养的胶质细胞过度生长，会将神经元从培养板上挤出。为避免影响神经元，物理性减少胶质细胞数量优于化学或药理学方法。
   注意：本实验方案假设目标细胞已培养至所需的实验状态，并以单层形式接种。我们发现，在24孔板中使用12孔圆形玻璃盖玻片接种最为方便。下述所有体积和操作步骤均适用于24孔板中单个孔内的单个盖玻片。

3. 培养细胞的药物处理

注意：可进行多种连续或重叠的药物处理。所使用的药物种类、剂量/浓度及暴露时间取决于具体实验设计。

1. 移除原始的培养基¹⁶，并替换为含有目标药物的培养基，药物浓度选择为所需浓度。本实验中，使用生理盐水溶解的10 µM吗啡，或仅使用生理盐水作为对照。
   注意：每个独立重复实验（通常为单个24孔板培养）均应包含相同的共同对照条件。这将允许对不同重复实验之间的数据进行归一化处理，从而校正不同实验批次间的变异性。
2. 在原始培养条件¹⁶ 下孵育细胞48小时。
3. 对于后续的药物处理，使用1 µM的Deltorphin、1 µM的SNC80或溶剂对照重复步骤3.1和3.2，并孵育60分钟¹²。将deltorphin II溶于水中，将SNC80以10 mM浓度溶于40 µM HCl中，超声处理后用纯水稀释至1 mM。
   注意：本方案假设药物已适当溶解，能够以所需浓度溶解于选定的培养基中。不同药物的溶解方法可能不同，需单独优化相应的溶解条件。
4. 用约1 ml洗涤缓冲液轻柔地洗涤细胞，共洗涤三次。每次洗涤时，轻柔地吸出孔内液体，然后立即并轻柔地用新鲜溶液（本实验中为洗涤缓冲液）重新填充孔内液体。

4. 固定与免疫细胞化学

注意：具体的标记靶点将根据实验而异。 在我们的实验中，如文中所述，我们对标记了δ型阿片受体（DOR）以及Rab5、Rab11和LAMP1。所使用的特异性抗体取决于具体的实验。最佳标记条件取决于所用的特异性抗体。下文将对此主题进行更全面的讨论。

1. 将细胞浸入约 300 µl 的 4% 多聚甲醛（溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液）中，在 37 ºC 下固定 10 分钟。
   注意：由于先前冷冻的多聚甲醛会产生自发荧光，因此必须使用新鲜配制的 4% 多聚甲醛。
2. 按照 3.3 节所述方法，用约 1 ml 洗涤缓冲液轻柔洗涤细胞，共洗涤 3 次。
3. 在室温下，用 300 µl 封闭缓冲液孵育细胞 2 小时。
4. 在 4 ºC 下，用 300 µl 抗体稀释液中的初级抗体孵育细胞 48 小时。在本实验中，使用针对 DOR（兔抗-DOR）的初级抗体，以及以下抗体之一：Rab5（鼠抗-Rab5）、Rab11（鼠抗-Rab11）或 LAMP1（山羊抗-LAMP1）。
5. 按照 3.3 节所述方法，用约 1 ml 洗涤缓冲液轻柔洗涤细胞，共洗涤 3 次。
6. 在室温下，用 300 µl 抗体稀释液中的不同荧光染料标记的二抗孵育细胞 1 小时。在此步骤及后续所有步骤中，需避免光照。为获得代表性结果，应使用绿色荧光染料标记的抗兔二抗，以及红色荧光染料标记的抗鼠二抗或红色荧光染料标记的抗山羊二抗。
7. 按照 3.3 节所述方法，用约 1 ml 洗涤缓冲液轻柔洗涤细胞，共洗涤 3 次。
8. 从 24 孔板中取出 12 mm 圆形盖玻片时，先在每个孔中保留  约 1 ml 洗涤缓冲液，将板倾斜约 45º，用精细镊子将盖玻片从孔底撬起。盖玻片将贴靠在孔壁上，此时可用镊子轻松取出。
9. 将盖玻片细胞面朝下，用抗荧光淬灭封片剂封固于显微镜载玻片上。

5. 显微镜设置

1. 使用高倍物镜（100X），首先在落射荧光下找到一个具有代表性的待成像细胞。
2. 配置图像采集参数，以记录每个标记通道的8位无压缩TIFF图像（用于检测所用的每种荧光染料） 例如，488 nm 和 594 nm）对每个通道进行顺序成像（按线或按帧），并对 4 到 6 次扫描进行平均以获得最终图像。最佳图像分辨率取决于显微镜型号，但通常 1024 × 1024 可获得良好结果。
3. 切换至共聚焦成像光路，并聚焦到穿过细胞中心的z平面。
4. 优化每个通道的针孔大小（通常为1个艾里单位）、激光功率以及光电倍增管电压（增益）和偏移量。保存或记录这些设置。在同一重复实验中，对所有标记相同目标组合的细胞成像时，使用相同的显微镜设置。
   注意：此过程通常会导致足够的光漂白，因此该细胞不应再用于成像分析。

6. 成像

1. 使用高倍物镜（例如，100X），首先通过落射荧光法找到待成像的细胞。
2. 切换至共聚焦成像光路，并聚焦到穿过细胞中心的 z 平面。如果具备条件，使用软件缩放/裁剪功能将扫描区域限制在目标细胞范围内。
3. 使用先前设定的参数采集每个标记通道的图像。重复步骤 6.1 至 6.3，每组实验条件下每重复采集至少 15 个或更多细胞的图像，以确保足够的样本量。

7. 共定位分析

1. 打开这组图像（例如，ImageJ 中细胞的“绿色”和“红色”通道）。“使用图像” > 颜色 > 合并通道…命令以生成 RGB 图像。
2. 在目标细胞周围绘制选区。使用 ImageJ 插件“PSC Colocalization”（¹¹；可从以下来源获取 https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) 来量化所选细胞中靶标的共定位。
3. 记录所需的共定位指标（通常为 Pearson 相关系数 r） ¹⁷）对每张成像的细胞重复步骤 7.1 至 7.3。

8. 数据标准化

1. 计算每种标记条件下各重复实验中共同对照条件的共定位值记录的平均值。 
   注意：例如，在3种独立重复实验中，每种标记条件（受体与3个区室中的每一个）下“48小时溶剂对照、60分钟溶剂对照”药物条件的神经元共定位值的平均值。
2. 将上述平均值乘以(-1)，得到每种标记条件下各重复实验的偏移量。将每种标记条件下各重复实验的偏移量加到该重复实验中的每一个共定位值上。
   注意：此操作将使数据标准化，使得每种标记条件的各重复实验中，共同对照条件的平均共定位测量值为0。
3. 汇总每种标记条件下所有重复实验的数据。
   注意：现在可以跨重复实验分析共定位的变化。统计分析 取决于实验设计，但通常包括方差分析（ANOVA），随后进行适当的事后检验（e.g.，Tukey检验）。有关统计资源，参见e.g.， ¹⁸。

结果

利用该技术，可以定量分析受体在内化后运输过程中，经慢性/长期或急性药物处理后的变化。药物处理后，对细胞进行固定和标记，针对每个目标细胞采集高分辨率的双通道显微图像。代表性图像可与伪彩共定位图结合，以生成示意图（图1）。随后按照所述方法进行共定位分析，可获得目标分子之间的共定位定量评分（例如，受体-细胞器标志物）。这些数据可用于比较药物处理（一种或多种）所诱导的受体运输变化情况（图2）。

图1. 受体与区室标志物标记及伪彩共定位图的代表性显微照片。背根神经节感觉神经元的原代培养细胞接受了长期（48小时）和急性（...

讨论

我们已优化本方案，用于成年背根神经节神经元（初级感觉神经元）原代培养物的分析。该方案也可广泛用于单层培养的细胞，通常无需或仅需少量修改。共定位分析也可在组织切片及其他类似样本中进行¹¹，但药物处理以及组织固定/制备步骤将不适用。

值得注意的是，本文介绍的ICC方法在经过适当的固定和组织处理后，也可用于组织切片的双标免疫组织化学染色，而无论后续采用何种分析方法（例如， ¹⁹）。

该方案适用于多种不同的标记靶点。每张细胞爬片将进行双重标记，通常针对感兴趣的受体以及某一感兴趣区室的标志物。通常需要设置多种标记条件，以检测受体与多个不同区室之间的共定位情况。

抗体本身具有变异性。不同的抗体需要采用适当的标记方案，包括合适的抗体浓度、缓冲液配方和时间点。还应注意，同一抗体的不同批次最好被视为不同的抗体。因此，针对每种抗体与靶组织的组合，都应验证并根据需要优化标记方法和抗体特异性。本文所使用的方法可作为有用的起点...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Trizma 碱	Sigma Aldrich	T1503-500G
氯化钠	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
盐酸	Sigma Aldrich	258148
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906-100G
冷水鱼皮明胶	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar 细胞培养板：24 孔	Fisher Scientific	720084
12 圆显微镜盖玻片	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S9638-500G
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S9763-500G
多聚甲醛	Polysciences	00380-1
Dumont #5 镊子 - 标准型/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
兔抗 DOR 抗体	MyBioSource	MBS316175	使用稀释比例为 1:1,500
小鼠抗 Rab5 抗体	Sigma Aldrich	R7904	使用稀释比例为 1:750
小鼠抗 Rab11 抗体	Millipore	05-853	使用稀释比例为 1:500
山羊抗 LAMP1 抗体	Santa Cruz	SC8098	使用稀释比例为 1:750
驴抗兔 Alexa 488 标记抗体	Life Technologies	A-21206	使用稀释比例为 1:200 至 1:2,000
山羊抗小鼠 Alexa 594 标记抗体	Life Technologies	A-11005	使用稀释比例为 1:200 至 1:2,000
驴抗山羊 Alexa 594 标记抗体	Life Technologies	A-11058	使用稀释比例为 1:200 至 1:2,000