追踪药物诱导Colocalizational变化分析受体后内部贩运

Summary

受体运输调节信号传导和细胞反应的配体和是，本身，响应于细胞的条件，包括配体诱导的信号传导。在这里，我们描述了一个强大而灵活的技术评估定量使用免疫标记和colocalizational分析药物诱导的受体贩卖。

Abstract

受体的细胞内运输是复杂且高度受控的过程的集合。受体运输调节信号传导和整体细胞对配体的反应性，并且本身受细胞内和细胞外条件的影响，包括配体诱导的信号传导。该方案针对单层铺板培养细胞进行了优化，但可扩展到自由漂浮的组织切片，该方案使用免疫标记和共定位分析来跟踪慢性/长期和急性干预（包括外源性药物治疗）后细胞内受体运输的变化。药物治疗后，细胞对受体和感兴趣的细胞内区室的标志物进行双重免疫标记。然后使用顺序共聚焦显微镜捕获单个细胞的双通道显微照片，这些照片经过计算机化共定位分析以产生定量共定位评分。这些分数被标准化，以便在统计分析之前合并独立重复。也可以处理具有代表性的显微照片以生成说明性图表。在这里，我们描述了一种强大而灵活的技术，用于定量评估诱导受体运输。

Introduction

受体，尤其是G蛋白偶联受体（GPCR），例行贩卖细胞内，并从细胞表面^1。这些复杂地策划和严格控制的流程决定细胞的受体提供补充和调节受体活性的时间，脱敏和复敏^{2 - 4。}重要的是，这些方法是响应于蜂窝环境中，包括药物诱导的受体活性或不活动。也就是说，配体在受体的行动可以改变这些受体的细胞内转运，从而改变细胞的反应。以这种方式，外部的配体在细胞功能的更多的效果发挥的是，甚至超出古典信使到效应器级联^5,6。

审视这种变化引起的受体运输是困难的。所有可用的技术包括限制。生物素保护测定法已被用于MONI器表面受体的人群。这些受体的生物素化和免疫沉淀的时间过程被执行以量化在一段时间内的生物素化的受体的减少。这种技术基本上是监视一个初始的，标记的人口受体⁷的逐渐退化，并且是在构建这个过程的时间进程非常有用的。不幸的是，该测定是无法监测任何比受体如内化，回收或新受体的原始池的劣化等过程。此外，除了在150kDa范围在的50kDa范围内的受体的抗体的可改变该受体的贩卖^8,9，并且该技术可能难以与低表达级别受体使用。

其他程序使用各种方法来确定细胞内运输隔室（ 例如，内体等），并且评估其共定位与感兴趣的受体。这包括了我们Ë异源表达系统的荧光蛋白标记的受体和隔间的标记（ 如 RAB-GTP酶家族）的....

Protocol

注:此协议是与各种单层镀细胞/组织培养模型，药物治疗方案，并标注大致目标兼容。因此，在实际使用中，许多具体的参数将根据实验设计而有所不同。这里，引用这些用户定义的参数都是通用的。实施例的条件下，作为用于获得代表性的结果，被包括在斜体。

1.解决方案

1. 制备洗涤缓冲液通过混合0.1M Tris缓冲高渗（300毫摩尔）盐水和0.05％的吐温20; pH为7.4，在室温。
2. 准备封闭液。到的0.05M Tris缓冲高渗（300毫）盐水加0.05％的吐温20,3％牛血清白蛋白（BSA）和0.1％冷的鱼明胶的皮肤和将pH调节至7.4，在室温。
3. 制备抗体稀释液中加入0.05％的吐温20,1％BSA，0.1％冷的鱼明胶的皮肤到0.05M的Tris缓冲高渗（300毫摩尔）盐水和将pH调节至7.4，在^4℃。
   注意:Tris缓冲液的pH值是温度依赖性的。即，在温度变化将改变溶液的pH。为了保持一致性，这些缓冲器应该总是pH调节在它们将被用在其中温度。

2.细胞培养

注意:根据所用细胞类型合适的细胞培养协议将变化。这些程序必须单独优化。详细的细胞培养方法都一应俱全，其中包括^16个 。类似的方法用于获得代表性的结果，与显着的差异:

1. 从成年动物文化背根神....

Results

使用这种技术，有可能对量化以下二者慢性/长期和急性药物治疗在受体后的内化贩卖的变化。后的药物治疗，固定，和标签，高分辨率双通道显微照片被捕获的每个感兴趣细胞。代表图像可与假色共定位组合以生成所说明的图（ 图1）。随后colocalizational分析，如上所述，得到目标靶共定位（ 例如，受体隔室标志物）的定量分数。这些数据然后可用于比较的变化，在这种情况下，受体运输引起的药物治疗（多个）（ 图2）。

与FAL受体和车厢，标志标签图1.代表性显微照片SE-色共定位地图。背根神经节的感觉神经元的原代培养物暴露于长期（48小时）和急性（1小时）药物治疗（左轴标记）。只有一个延长的条件被示为代表性结果。然后将细胞免疫标记为增量阿片受体（DOR）和回收内涵体标志物（饶11）.......

Discussion

我们已经优化了这个协议，成人背根神经节神经元（初级感觉神经元）的原代培养的分析。它也可以使用，很少或根本没有修改，为单层镀培养细胞广泛。该colocalizational分析也有可能在组织切片和其他此类制剂^11，但药物治疗和组织固定/制备组分是不恰当的。

有趣的是，这里介绍的IC卡的方法也可以使用，以适当的固定和组织准备，以便在组织切片进行双标记免疫组织化学，不论随后的分析（ 例如^，19）。

此协议是与不同的标注大致目标兼容。铺板的细胞的每个盖玻片将双标。通常情况下，这将是感兴趣的受体和感兴趣的隔室之一的一个标志。那里通常将为了检查受体共定位与多个不同区室的多个标记条件。

抗体本身是可变的。适当的标签协议将不同抗体之间变化。这包括合适的抗体浓度，缓冲的食谱，以及时间点。还应当指出的是，不同批次的相同抗体最好被认为是不同的抗体。这样，标记方法和抗体特异性应验证，并在必要时进行了优化，用于抗体和靶组织的每个组合。这.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma 碱	Sigma Aldrich	T1503-500G
氯化钠	Sigma Aldrich	S9888-500G
吐温 20	Fisher Scientific	BP337-500
盐酸	Sigma Aldrich	258148
来自牛血清的白蛋白	Sigma Aldrich	A7906-100G
来自冷水鱼的明胶皮肤	Sigma Aldrich	G7041-100G
康宁 Costar 细胞培养板：24 孔	Fisher Scientific	720084
12 圈显微镜盖板	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount Polysciences		18606-20
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S9638-500G
钠磷酸氢二酯	Sigma Aldrich	S9763-500G
多聚甲醛	Polysciences	00380-1
Dumont #5 镊子 - 标准/Dumoxel	精细科学工具	11251-30
兔抗 DOR 抗体	MyBioSource	MBS316175	用于 1：1,500
小鼠抗 Rab5 抗体	Sigma Aldrich	R7904	用于 1：750
小鼠抗 Rab11 抗体	Millipore	05-853	以 1：500 的比例使用
羊抗 LAMP1 抗体	Santa Cruz	SC8098	以 1：750 的比例使用
驴抗兔 Alexa 488 偶联抗体	Life Technologies	A-21206	以 1：200 至 1：2,000 的比例使用
羊抗小鼠 Alexa 594 偶联抗体	Life Technologies	A-11005	1：200 至 1：2,000 的比例使用
驴抗山羊 Alexa 594 偶联抗体	Life Technologies	A-11058	以 1：200 至 1：2,000 的比例使用