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方法文章

一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

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DOI：

10.3791/52827

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2015年9月15日

 , 
1Department of Biology, Concordia University

本文内容

摘要

本方案用于从海水中收集的微生物生物量中提取和浓缩蛋白质及DNA，随后生成适用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。

摘要

宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学等宏组学技术有助于解析微生物群落的结构与代谢。尽管宏基因组学功能强大，但其单独使用仅能揭示功能潜力；而宏蛋白质组学则能够描述实际表达的蛋白质谱 原位 群落的代谢与功能。本文描述了一种从滤筒式滤器（如Sterivex滤器）上收集并保存于RNA稳定溶液（如RNAlater）中的海洋微生物细胞中进行细胞裂解、蛋白质和DNA提取，以及肽段消化与提取的实验方案。在基于质谱的蛋白质组学研究中，通过将肽段的串联质谱图与核苷酸序列翻译所得的数据库进行比对，实现对肽段和蛋白质的鉴定。将样品的宏基因组数据纳入搜索数据库，可提高从质谱数据中鉴定出的肽段和蛋白质数量。因此，本方案中从同一滤器中提取DNA，以用于后续的宏基因组分析。

引言

微生物无处不在，在地球的生物地球化学循环中发挥着至关重要的作用1。目前已有多种分子方法可用于表征微生物群落的结构与功能。最常用的方法是分析从环境DNA中通过PCR扩增得到的16S rRNA基因序列2–4。16S rRNA基因分析的一个缺点是，它仅能提供关于系统发育身份和群落结构的信息，而对代谢功能的信息较少。相比之下，宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学等方法则可同时提供群落结构与代谢方面的信息。宏基因组学，即对一组生物体基因内容的分析，能够揭示群落的结构及其功能潜力5–8。尽管该方法功能强大，但这种功能潜力可能并不对应于生物体的实际代谢活动。生物体的基因型由其基因体现，每个基因均可转录为RNA，并进一步翻译为蛋白质，从而产生表型。因此，为了更好地理解环境中微生物的功能活性，应进行基因组后分析9。宏转录组学，即对RNA转录本的分析，具有重要价值，因为它能够揭示在特定环境中哪些基因被转录。然而，由于翻译调控、RNA半衰期以及每个mRNA可产生多个蛋白质拷贝等因素，mRNA水平并不总是与其对应的蛋白质水平一致10。

由于这些原因，宏蛋白质组学现已被公认为环境微生物学中的重要工具。常见的宏蛋白质组学分析采用鸟枪法蛋白质组学方法，即对复杂样品中近乎完整的蛋白质组进行纯化并同时分析，通常通过酶解为肽段，并在质谱仪上进行分析。随后通过串联质谱（MS/MS）“肽指纹图谱”技术，结合蛋白质数据库搜索来确定肽段序列及其可能来源的蛋白质（综述见11）。在过去25年中，得益于基因组数据的日益丰富以及质谱仪灵敏度和准确性的提升，蛋白质组学研究取得了长足进展，使得高通量的蛋白质鉴定与定量成为可能11,12。由于蛋白质是基因表达的最终产物，宏蛋白质组学数据有助于确定在特定环境中哪些生物体具有活性，以及它们正在表达哪些蛋白质。这在研究特定环境变量如何影响生物体或群落表型时具有显著优势。早期基于MS/MS的海洋宏蛋白质组学研究主要用于鉴定特定微生物谱系中的具体蛋白质，其中首个研究聚焦于SAR11海洋细菌中的光驱动质子泵——视紫红质蛋白（proteorhodopsin）13。近年来，比较性宏蛋白质组学分析进一步揭示了复杂群落之间差异性的蛋白质表达模式。例如，在西北大西洋近海海域14或南极半岛5地区发现代谢活动随时间发生的变化。其他研究还描述了跨空间尺度的蛋白质表达模式差异，例如从贫营养的海洋环流区到高生产力的近岸上升流系统沿地理断面的变化15。有关宏蛋白质组学的更多综述，我们推荐Schneider et al.（2010）9 和 Williams et al.（2014）16。近年来，靶向蛋白质组学也被用于环境中特定代谢通路表达水平的定量分析17,18。

宏蛋白质组学分析主要包括三个阶段。第一阶段是样品制备，包括样品采集、细胞裂解和蛋白质浓缩。在海洋微生物学中，样品采集通常需要先通过预过滤膜过滤海水，以去除较大的真核细胞、颗粒物以及与颗粒结合的细菌，随后使用0.22 µm滤芯过滤装置进一步过滤，以捕获游离生活的微生物细胞19,20。这些滤膜被封装在塑料圆筒中，因此能够在滤器单元内直接进行细胞裂解和蛋白质提取的实验方案将是一种非常有价值的工具。获得生物量后，必须裂解细胞以释放蛋白质。可采用多种裂解方法，包括盐酸胍裂解法21和基于十二烷基硫酸钠（SDS）的裂解方法。尽管SDS等去垢剂在破坏细胞膜和溶解多种蛋白质方面效率很高，但低至0.1%的浓度也可能干扰后续的蛋白质消化及质谱分析22。尤其值得关注的是，SDS会对胰蛋白酶消化效率、反相液相色谱的分离能力以及离子源内的离子抑制或残留积累产生不利影响23。

第二阶段为分级分离与分析，其中蛋白质经过酶解消化后进行液相色谱-串联质谱（LC MS/MS）分析，产生可用于确定原始胰蛋白酶肽一级氨基酸序列的质荷比（m/z）碎片图谱。根据所使用的去垢剂类型以及下游质谱分析流程，可采用不同的消化方法。在本实验方案中，采用一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1-D PAGE）并随后从凝胶中去除十二烷基硫酸钠（SDS），以消除任何去垢剂污染。对于难以溶解的蛋白质（如膜蛋白）的分析，需要使用高浓度的SDS或其他去垢剂，这会导致与SDS-凝胶电泳的兼容性问题。如果研究目标需要溶解这些难溶蛋白质，则可采用管式凝胶系统22,24。管式凝胶法将蛋白质包埋于凝胶基质中，无需使用电泳。随后在蛋白质消化前去除用于溶解的任何去垢剂。

第三阶段是生物信息学分析。在此阶段，将质谱/质谱（MS/MS）肽段数据与翻译后的核苷酸序列数据库进行比对，以确定样品中存在哪些肽段和蛋白质。肽段的鉴定结果依赖于所比对的数据库。海洋宏蛋白质组学数据通常比对包含参考基因组、宏基因组数据（例如全球海洋采样数据集25）以及未培养谱系的单细胞扩增基因组26,27在内的数据库。此外，将与宏蛋白质组数据来源相同的样品的宏基因组序列纳入数据库，也可提高蛋白质的鉴定数量5。

本文提供了一种从通过滤膜收集并保存在RNA稳定溶液中的微生物生物量中制备适用于串联质谱（MS/MS）分析的肽段的实验方案。本方案允许从同一样本中同时分离DNA和蛋白质，因此在蛋白质和DNA沉淀之前的所有操作步骤完全相同。从实际操作角度看，由于只需使用一张滤膜即可同时进行蛋白质和DNA的提取，所需的过滤步骤更少。我们还需说明，本方案是在整合、调整并修改两种先前已发表的方案基础上建立的。细胞裂解步骤改编自Saito et al. (2011) 28，凝胶内胰蛋白酶消化部分则改编自Shevchenko et al. (2007) 29。

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方案

1. 准备试剂

  1. 配制 SDS 提取液：0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）、5% 甘油、10 mM EDTA 和 1% SDS。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
  2. 配制聚丙烯酰胺凝胶所需储备试剂。
    1. 配制 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
    2. 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
    3. 配制 10% SDS。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
  3. 配制凝胶内胰蛋白酶消化和肽段提取所需溶液。
    1. 配制 100 mM 碳酸氢铵溶液。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
    2. 配制 1 M DTT 储备液。溶于 100 mM 碳酸氢铵中，-80 °C 保存。
    3. 配制 550 mM 碘乙酰胺储备液。溶于 100 mM 碳酸氢铵中，-80 °C 保存。
    4. 配制 100 ng/µl 胰蛋白酶储备液。将 60 µl 分装至 1.5 ml 微量离心管中，-80 °C 保存。
    5. 配制提取溶液：1% 甲酸，2% 乙腈。
    6. 配制重悬溶液：5% 乙腈，0.1% 甲酸。

2. 在含有RNA稳定溶液保存细胞的滤 cartridge 单元中进行细胞裂解

  1. 使用连接在滤器鲁尔锁端的 60 ml 注射器，将 RNA 稳定溶液从滤器单元（1.5 ml）中推出，并收集至 2 ml 微量离心管中。
  2. 将 2 ml 微量离心管在 17,000 × g 条件下离心 10 分钟 ，以沉淀任何细胞碎片。此步骤可防止步骤 2.3 中的滤器发生堵塞。
  3. 将上清液转移至 10 K 超滤离心滤器单元，以截留因样品冻融裂解细胞所释放的蛋白质。请勿丢弃沉淀物，它将在步骤 2.5 中使用。对超滤离心滤器单元在 3,270 × g 条件下离心 30 分钟 ，或直至体积减少至约 600 µl。
  4. 熔化 p10 吸头的尖端，并用其开口端封堵滤器单元非鲁尔锁的一侧。这将确保在步骤 2.5–2.7 期间提取缓冲液和生物样本不会泄漏。
  5. 将沉淀物重悬于 1 ml SDS 提取液中，并用移液器将其转移至原始的滤器单元中。将液体移入滤器单元最简便的方法是将一个 p200 吸头套在 p1000 吸头上，使用这种双层吸头进行移液。
  6. 向滤器单元中加入 1 ml SDS 提取液，使总体积约为 2 ml，在杂交炉中室温旋转孵育 10 分钟 。在 50 ml 锥形管底部放置 3 团揉皱的实验擦拭纸，用封口膜封闭滤器单元的两端，然后将滤器单元放入 50 ml 管中。盖紧管盖，并将管子放入杂交炉中。
  7. 10 分钟后 ，将 Sterivex 滤器置于泡沫浮板上，并用 5 ml 注射器固定在滤器的鲁尔锁端。将装置漂浮于 95 °C 水浴中孵育 15 分钟。
  8. 让滤器单元冷却，并在室温下旋转 1 小时（操作同步骤 2.6）。
  9. 使用 60 ml 注射器将滤器中的 SDS 提取液/细胞裂解液推出，收集至之前使用的同一超滤离心滤器单元（步骤 2.3）。向滤器单元中加入 1 ml 新鲜的 SDS 提取液，手动混合 30 秒 ，然后用 60 ml 注射器将其推出至超滤离心滤器单元中。此步骤用于冲洗滤器单元，以确保所有蛋白质均已被去除。
  10. 对超滤离心滤器单元在 3,270 × g 条件下离心 45 分钟 ，或直至滤器单元内体积低于 600 µl。
  11. 弃去滤过液，并用新鲜的 SDS 提取液补足超滤离心滤器单元的体积。
  12. 以 3,270 × g 再次离心滤器单元 45 分钟 。
  13. 重复步骤 2.11 和 2.12 两次。确保最终离心结束后，超滤离心滤器单元中的最终体积最多为 600 µl。
  14. 此时，将浓缩液分为两份。其中一份用于 DNA 沉淀，另一份用于蛋白质沉淀。
    注意：分样比例取决于过滤所得生物量的多少以及产物的预期用途。在本实验中，我们将浓缩液按 10% 用于 DNA 沉淀、90% 用于蛋白质沉淀的比例进行分配。

3. 蛋白质沉淀

  1. 向一份浓缩液中加入四份甲醇:丙酮（50:50），涡旋振荡10秒，于-20 °C孵育过夜。
  2. 在17,000 × g离心30分钟，弃去上清液，将沉淀（可能不可见）在真空浓缩仪中干燥1小时（或直至干燥）。
    注意：切勿过度干燥沉淀，以免难以重悬。
  3. 将沉淀重悬于25 µl SDS提取液中，静置1小时，然后通过反复吹打混匀重悬。
  4. 使用蛋白定量试剂盒及厂商提供的说明书进行蛋白定量。

4. DNA 沉淀

  1. 向浓缩组分中加入SDS提取液，用于DNA沉淀，直至总体积达到500 µl。此步骤仅用于增加溶液体积，便于后续操作。
  2. 加入0.583倍体积的蛋白质沉淀试剂（例如MPC蛋白质沉淀试剂），涡旋振荡10秒。此时应可见白色沉淀形成。
    注意：我们亦曾使用苯酚:氯仿法进行DNA提取，但由于样品体积较小，操作较为困难。使用MPC蛋白质沉淀试剂可获得更高的DNA得率。
  3. 在4 °C、17,000 x g条件下离心10分钟。
  4. 将上清液转移至另一支1.5 ml微量离心管中，加入0.95倍体积的异丙醇，倒置混匀30–40次。
  5. 在4 °C条件下以最大转速离心10分钟。
  6. 小心倾去并弃除上清液。
  7. 用750 µl的70%乙醇洗涤两次。
  8. 用移液器尽可能吸除乙醇，然后室温晾干。
    注意：切勿过度干燥DNA，以免难以重悬。
  9. 用25 µl低TE缓冲液 pH 8 （10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA）重悬DNA。
  10. 使用双链DNA定量检测试剂盒及厂商提供的说明书对DNA进行定量。取3 µl DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检测其质量。

5. 蛋白质的 SDS-PAGE 凝胶电泳

  1. 配制样品缓冲液（950 µl Laemmli 样品缓冲液和 50 µl β-巯基乙醇）。
  2. 向样品中加入相应体积的蛋白样品（含 15 µg 蛋白），或最多 20 µl 样品，与等体积样品缓冲液混合，煮沸 4 分钟。样品可保存在 -80 °C，直至进行 SDS-PAGE。
  3. 制备含 10% 丙烯酰胺分离胶和 5% 丙烯酰胺浓缩胶的凝胶。
  4. 上样，每孔加入样品和 4 µl 蛋白质分子量标记物。以恒定 120 V 电泳，直至 250 kDa 的蛋白标记物刚好进入分离胶。
  5. 根据生产商说明书，使用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色。

6. 胶内胰蛋白酶消化与肽段提取

注意：从本步骤至6.10的所有步骤 在生物安全柜中进行操作，以尽量减少污染。

  1. 在每个泳道的10 kDa蛋白分子量标记下方切去多余的凝胶。每个泳道将单独进行质谱/质谱（MS/MS）分析。将每个泳道切成1 mm × 1 mm的小块以增加表面积，并将该泳道的所有小块转移至低吸附性微量离心管中。对所有泳道重复此操作。（可使用1%乙酸防止凝胶干燥，从而便于切割）。
    注意：此步骤中需尽量减少污染，因此凝胶切取操作应在生物安全柜中进行，并使用制备凝胶所用的玻璃SDS-PAGE凝胶模具。
  2. 脱色
    1. 向每个低吸附性离心管中加入50 µl 100 mM碳酸氢铵，盖紧管盖，在37 °C孵育10分钟。
    2. 向管中加入50 µl乙腈，盖紧管盖，在37 °C孵育5分钟。
    3. 吸除并弃去150 µl液体。
    4. 重复步骤6.2.1和6.2.2。
    5. 吸除并弃去95 µl液体。
  3. 脱水
    1. 向管中加入50 µl乙腈，盖紧管盖，静置5分钟。吸除并弃去45 µl液体，再静置10分钟。
  4. 还原
    1. 向管中加入50 µl DTT（10 mM，溶于100 mM碳酸氢铵），盖紧管盖，在37 °C静置30分钟 。
  5. 烷基化
    1. 向管中加入50 µl碘乙酰胺（55 mM，溶于100 mM碳酸氢铵），盖紧管盖，在37 °C静置20分钟 。
    2. 向管中加入100 µl乙腈，盖紧管盖，在37 °C孵育5分钟 。吸除并弃去195 µl液体。
  6. 洗涤
    1. 向管中加入50 µl碳酸氢铵，盖紧管盖，在37 °C孵育10分钟 。
    2. 向管中加入50 µl乙腈，盖紧管盖，在37 °C孵育5分钟。吸除并弃去120 µl液体。
  7. 脱水
    1. 向管中加入50 µl乙腈，盖紧管盖，静置5分钟。吸除并弃去45 µl液体。
    2. 向管中加入50 µl乙腈，静置5分钟。
    3. 吸除并弃去75 µl液体，再静置5分钟。
  8. 酶解
    1. 加入25–30 µl 6 ng/µl胰蛋白酶溶液（加至完全覆盖所有凝胶碎片）。盖紧管盖，在室温下静置30分钟 。
    2. 在37 °C孵育过夜（至少4.5小时 ）。
    3. 在室温下静置30分钟。
  9. 肽段提取与转移
    1. 向管中加入30 µl提取液，盖上盖子，在冰上放置30分钟 。
    2. 吸取30 µl液体，转移至一个新的已标记的低吸附性离心管中。
    3. 向原管（含凝胶）中加入12 µl提取液和12 µl乙腈。盖紧管盖，在冰上孵育30分钟 。
    4. 吸取15 µl液体，加入至新管中。
    5. 重复步骤6.9.3和6.9.4。
  10. 将新管置于真空浓缩仪（SpeedVac）中至完全干燥。
  11. 用50 µl重悬溶液重悬肽段。在中等转速下涡旋振荡10分钟 以充分重悬。
  12. 用移液器将肽段溶液转移至适用于纳米液相色谱-质谱/质谱（nano/LC MS/MS）分析的纳米液相小瓶或96孔板中。

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结果

作为示例，我们对采自加拿大北部近海表层和叶绿素最大层的两份海水样品进行了本实验方案的操作。在海上作业期间，将6-7 L海水先通过3 µm的GF/D预滤膜，随后按照Walsh et al. 20的方案，使用0.22 µm滤芯过滤装置收集微生物细胞。细胞收集后立即保存于RNA稳定溶液中，待后续处理。返回实验室后，我们按照本文所述方案进行操作。将浓缩的细胞裂解液分两部分：其中90%体积用于沉淀蛋白质，剩余10%体积用于沉淀DNA。从这些样品中，我们获得了24-26 µg蛋白质和250-308 ng高质量DNA（图1）。经过凝胶内胰蛋白酶消化和肽段提取后，将肽段通过纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC）联用Orbitrap Elite质谱仪（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行MS/MS分析。每份样品产生了超过23,000个MS/MS谱图。随后使用PEAKS生物信息学工具（BSI, Waterloo, ON, Canada）将这些谱图比对至自建的内部序列数据库，以鉴定肽段和蛋白质。该数据库包含来自海洋参考基因组和宏基...

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讨论

样本保存是宏蛋白质组学研究的关键，先前的研究表明，RNA稳定溶液可作为细胞在蛋白质提取前储存的有用保存缓冲液 28理想情况下，样品应被保存 原位 以消除操作过程中蛋白质表达的变化 33,34事实上， 原位 已开发出采样与固定技术，可实现由船舶部署的仪器自主采集并保存样品。然而，这些技术并非总能获得。在无法获取这些技术的常见情况下，样品应在采集后尽快予以保存。

本文介绍了一种从使用滤筒过滤单元收集并保存于RNA稳定溶液中的细胞中提取蛋白质的实验方案，该方法在水生微生物学研究中较为常用。本方案包括采用SDS裂解液进行细胞裂解并加热，随后利用超滤离心管进行蛋白浓缩，此步骤同时实现了必要的脱盐效果。需要注意的是，浓缩和脱盐步骤不可忽略。我们发现至少需要进行三次缓冲液置换才能充分脱盐。由于RNA稳定溶液盐浓度较高，若脱盐不充分，在过夜蛋白沉淀步骤中将产生过多盐结晶，导致脱盐和沉淀步骤必须重复进行。此外，若脱盐不彻底，将无法成功进行一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE），最终导致样品丢失。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢Marcos Di Falco在纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC MS/MS）样品制备过程中提供的专业知识和建议，同时感谢里贾纳大学的Zoran Minic博士进行液相色谱-串联质谱（LC MS/MS）分析。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC，项目号DG402214-2011）和加拿大研究主席计划（CRC，项目号950-221184）的资助。D.C. 受康考迪亚大学水、能源与可持续系统研究所及魁北克自然科学与技术基金会（FQRNT）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sterivex -GP 0.22 μm 滤膜装置MilliporeSVGP01050采样
RNA later 稳定溶液AmbionAM7021采样
Tris Bio Basic77-86-1 或 TB0196-500G蛋白质提取/SDS-PAGE 胶
DTTSigma-AldrichD0632-1G蛋白质提取
SDSBio Basic15-21-3蛋白质提取/SDS-PAGE 胶
EDTABio Basic6381-92-6蛋白质提取
甘油Fisher Scientific56-81-5蛋白质提取
10K Amicon 滤膜MilliporeUFC801024蛋白质提取
甲醇Sigma-Aldrich179337-4L蛋白质沉淀
丙酮Fisher Scientific67-64-1蛋白质沉淀
MPC 蛋白质沉淀试剂EpicentermmP03750DNA 沉淀
2-丙醇Fisher Scientific67-63-0DNA 沉淀
Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒Life TechnologiesQ32850DNA 定量
Qubit 蛋白质定量检测试剂盒Life TechnologiesQ33211蛋白质定量
蔗糖Bio Basic57-50-1SDS-PAGE 胶
TEMEDBio Rad161-0800SDS-PAGE 胶
APSBio Rad161-0700SDS-PAGE 胶
30% 丙烯酰胺Bio Rad161-0158SDS-PAGE 胶
SimplyBlue SafeStain 染色液InvitrogenLC6060SDS-PAGE 胶
甘氨酸Bio Rad161-0718SDS-PAGE 胶
β-巯基乙醇Bio Basic60-24-2SDS-PAGE 胶
Laemmli 样品缓冲液Bio Rad161-0737SDS-PAGE 胶
Precision Plus Protein Kaleidoscope 蛋白质分子量标准Bio Rad161-0375EDUSDS-PAGE 胶
乙腈VWRCABDH6044-4胶内胰蛋白酶消化
NH4HCO3Bio Basic1066-33-7胶内胰蛋白酶消化
DTTSigma-AldrichD0632-1G胶内胰蛋白酶消化
甲酸Sigma-AldrichF0507-500ML胶内胰蛋白酶消化
HPLC 级 H2OSigma-Aldrich270733-4L胶内胰蛋白酶消化
碘乙酰胺Bio Basic144-48-9胶内胰蛋白酶消化
胰蛋白酶PromegaV5111胶内胰蛋白酶消化
蛋白质 LoBind 管（1.5 ml）Eppendorf22431081胶内胰蛋白酶消化
2 ml ROBO 小瓶（9 mm）Canadian Life ScienceVT009/C395SB胶内胰蛋白酶消化
PP BM 插件，无弹簧Canadian Life Science4025P-631胶内胰蛋白酶消化

参考文献

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一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段
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