一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

摘要

本方案用于从海水中收集的微生物生物量中提取和浓缩蛋白质及DNA，随后生成适用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。

摘要

宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学等宏组学技术有助于解析微生物群落的结构与代谢。尽管宏基因组学功能强大，但其单独使用仅能揭示功能潜力；而宏蛋白质组学则能够描述实际表达的蛋白质谱 原位 群落的代谢与功能。本文描述了一种从滤筒式滤器（如Sterivex滤器）上收集并保存于RNA稳定溶液（如RNAlater）中的海洋微生物细胞中进行细胞裂解、蛋白质和DNA提取，以及肽段消化与提取的实验方案。在基于质谱的蛋白质组学研究中，通过将肽段的串联质谱图与核苷酸序列翻译所得的数据库进行比对，实现对肽段和蛋白质的鉴定。将样品的宏基因组数据纳入搜索数据库，可提高从质谱数据中鉴定出的肽段和蛋白质数量。因此，本方案中从同一滤器中提取DNA，以用于后续的宏基因组分析。

引言

微生物无处不在，在地球的生物地球化学循环中发挥着至关重要的作用¹。目前已有多种分子方法可用于表征微生物群落的结构与功能。最常用的方法是分析从环境DNA中通过PCR扩增得到的16S rRNA基因序列^2–4。16S rRNA基因分析的一个缺点是，它仅能提供关于系统发育身份和群落结构的信息，而对代谢功能的信息较少。相比之下，宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学等方法则可同时提供群落结构与代谢方面的信息。宏基因组学，即对一组生物体基因内容的分析，能够揭示群落的结构及其功能潜力^5–8。尽管该方法功能强大，但这种功能潜力可能并不对应于生物体的实际代谢活动。生物体的基因型由其基因体现，每个基因均可转录为RNA，并进一步翻译为蛋白质，从而产生表型。因此，为了更好地理解环境中微生物的功能活性，应进行基因组后分析⁹。宏转录组学，即对RNA转录本的分析，具有重要价值，因为它能够揭示在特定环境中哪些基因被转录。然而，由于翻译调控、RNA半衰期以及每个mRNA可产生多个蛋白质拷贝等因素，mRNA水平并不总是与其对应的蛋白质水平一致¹⁰。

由于这些原因，宏蛋白质组学现已被公认为环境微生物学中的重要工具。常见的宏蛋白质组学分析采用鸟枪法蛋白质组学方法，即对复杂样品中近乎完整的蛋白质组进行纯化并同时分析，通常通过....

方案

1. 准备试剂

1. 配制 SDS 提取液：0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）、5% 甘油、10 mM EDTA 和 1% SDS。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
2. 配制聚丙烯酰胺凝胶所需储备试剂。
   1. 配制 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
   2. 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
   3. 配制 10% SDS。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。
3. 配制凝胶内胰蛋白酶消化和肽段提取所需溶液。
   1. 配制 100 mM 碳酸氢铵溶液。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
   2. 配制 1 M DTT 储备液。溶于 100 mM 碳酸氢铵中，-80 °C 保存。
   3. 配制 550 mM 碘乙酰胺储备液。溶于 100 mM 碳酸氢铵中，-80 °C 保存。
   4. 配制 100 ng/µl 胰蛋白酶储备液。将 60 µl 分装至 1.5 ml 微量离心管中，-80 °C 保存。
   5. 配制提取溶液：1% 甲酸，2% 乙腈。
   6. 配制重悬溶液：5% 乙腈，0.1% 甲酸。

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结果

作为示例，我们对采自加拿大北部近海表层和叶绿素最大层的两份海水样品进行了本实验方案的操作。在海上作业期间，将6-7 L海水先通过3 µm的GF/D预滤膜，随后按照Walsh et al. ²⁰的方案，使用0.22 µm滤芯过滤装置收集微生物细胞。细胞收集后立即保存于RNA稳定溶液中，待后续处理。返回实验室后，我们按照本文所述方案进行操作。将浓缩的细胞裂解液分两部分：其中90%体积用于沉淀蛋白质，剩余10%体积用于沉淀DNA。从这些样品中，我们获得了24-26 µg蛋白质和250-308 ng高质量DNA（图1）。经过凝胶内胰蛋白酶消化和肽段提取后，将肽段通过纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC）联用Orbitrap Elite质谱仪（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行MS/MS分析。每份样品产生了超过23,000个MS/MS谱图。随后使用PEAKS生物信息学工具（BSI, Waterloo, ON, Canada）将这些谱图比对至自建的内部序列数据库，以鉴定肽段和蛋白质。该数据库包含来自海洋参考基因组和宏基.......

讨论

样本保存是宏蛋白质组学研究的关键，先前的研究表明，RNA稳定溶液可作为细胞在蛋白质提取前储存的有用保存缓冲液 ²⁸理想情况下，样品应被保存 原位 以消除操作过程中蛋白质表达的变化 ^33,34事实上， 原位 已开发出采样与固定技术，可实现由船舶部署的仪器自主采集并保存样品。然而，这些技术并非总能获得。在无法获取这些技术的常见情况下，样品应在采集后尽快予以保存。

本文介绍了一种从使用滤筒过滤单元收集并保存于RNA稳定溶液中的细胞中提取蛋白质的实验方案，该方法在水生微生物学研究中较为常用。本方案包括采用SDS裂解液进行细胞裂解并加热，随后利用超滤离心管进行蛋白浓缩，此步骤同时实现了必要的脱盐效果。需要注意的是，浓缩和脱盐步骤不可忽略。我们发现至少需要进行三次缓冲液置换才能充分脱盐。由于RNA稳定溶液盐浓度较高，若脱盐不充分，在过夜蛋白沉淀步骤中将产生过多盐结晶，导致脱盐和沉淀步骤必须重复进行。此外，若脱盐不彻底，将无法成功进行一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE），最终导致样品丢失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sterivex -GP 0.22 μm 滤膜装置	Millipore	SVGP01050	采样
RNA later 稳定溶液	Ambion	AM7021	采样
Tris	Bio Basic	77-86-1 或 TB0196-500G	蛋白质提取/SDS-PAGE 胶
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	蛋白质提取
SDS	Bio Basic	15-21-3	蛋白质提取/SDS-PAGE 胶
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	蛋白质提取
甘油	Fisher Scientific	56-81-5	蛋白质提取
10K Amicon 滤膜	Millipore	UFC801024	蛋白质提取
甲醇	Sigma-Aldrich	179337-4L	蛋白质沉淀
丙酮	Fisher Scientific	67-64-1	蛋白质沉淀
MPC 蛋白质沉淀试剂	Epicenter	mmP03750	DNA 沉淀
2-丙醇	Fisher Scientific	67-63-0	DNA 沉淀
Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒	Life Technologies	Q32850	DNA 定量
Qubit 蛋白质定量检测试剂盒	Life Technologies	Q33211	蛋白质定量
蔗糖	Bio Basic	57-50-1	SDS-PAGE 胶
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS-PAGE 胶
APS	Bio Rad	161-0700	SDS-PAGE 胶
30% 丙烯酰胺	Bio Rad	161-0158	SDS-PAGE 胶
SimplyBlue SafeStain 染色液	Invitrogen	LC6060	SDS-PAGE 胶
甘氨酸	Bio Rad	161-0718	SDS-PAGE 胶
β-巯基乙醇	Bio Basic	60-24-2	SDS-PAGE 胶
Laemmli 样品缓冲液	Bio Rad	161-0737	SDS-PAGE 胶
Precision Plus Protein Kaleidoscope 蛋白质分子量标准	Bio Rad	161-0375EDU	SDS-PAGE 胶
乙腈	VWR	CABDH6044-4	胶内胰蛋白酶消化
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	胶内胰蛋白酶消化
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	胶内胰蛋白酶消化
甲酸	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	胶内胰蛋白酶消化
HPLC 级 H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	胶内胰蛋白酶消化
碘乙酰胺	Bio Basic	144-48-9	胶内胰蛋白酶消化
胰蛋白酶	Promega	V5111	胶内胰蛋白酶消化
蛋白质 LoBind 管（1.5 ml）	Eppendorf	22431081	胶内胰蛋白酶消化
2 ml ROBO 小瓶（9 mm）	Canadian Life Science	VT009/C395SB	胶内胰蛋白酶消化
PP BM 插件，无弹簧	Canadian Life Science	4025P-631	胶内胰蛋白酶消化