成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

摘要

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。

摘要

通过成年皮肤成纤维细胞诱导生成 诱导性多能干细胞（iPSCs），并进一步将其分化为体细胞，为获得可规避组织相容性障碍的自体移植材料提供了广阔前景。然而，由于存在致瘤风险和基因组不稳定性，细胞经历多能性状态并完全分化为特定谱系的过程，仍是iPSC技术向临床应用转化的主要障碍。近期，我们及多个研究团队发现，体细胞不仅可被重编程为iPSCs，还可利用特定因子直接转化为多种多能性体细胞干细胞，从而绕过多能性状态。特别是将人成纤维细胞直接转化为诱导性神经前体细胞（iNPCs），为细胞替代治疗、疾病建模及药物筛选等应用提供了全新的自体细胞来源。本文中，我们描述了通过皮肤活检获取成人原代人成纤维细胞，并通过限时表达Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc等确定因子，高效实现其直接转化为iNPCs的方法。诱导17天后可观察到Sox2阳性神经上皮样克隆，通过单克隆分离与扩增可高效建立iNPC细胞系。在诱导阶段精确调控病毒感染复数（MOI）并添加白血病抑制因子（LIF），是实现高达0.2%转化效率的关键因素。迄今为止，患者特异性的iNPC细胞系已成功扩增超过12代，且均一地表现出神经干细胞/前体细胞的形态学与分子特征，例如表达Nestin和Sox2。这些iNPC细胞系可进一步分化为神经元和星形胶质细胞，分别通过TUJ1和GFAP染色予以验证。综上所述，我们报道了一种稳定、高效的方案，用于从人成纤维细胞直接转化获得可长期扩增的神经前体细胞，该方法有望为自体神经细胞替代治疗和疾病建模等生物医学应用提供细胞来源。

引言

2006年，山中伸弥及其同事首次证明了将体细胞重编程为多能状态的可能性¹。这种去分化过程通过在小鼠成纤维细胞中过表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc实现。所获得的所谓诱导性多能干细胞（iPSCs）在功能上与胚胎干细胞（ESCs）相当，因此可被分化为成体生物体的所有细胞类型。一年后，人类成纤维细胞也被成功重编程为iPSCs²。动物模型实验表明，iPSC来源的细胞通常可用于细胞替代治疗，例如帕金森病（PD）^3-5。然而，iPSCs的应用仍存在若干局限性，阻碍了其治疗潜力的充分发挥。首先，将细胞重编程为多能状态并进行后续质量控制通常是一个耗时且效率低下的过程，需要进行大量且成本高昂的细胞培养操作。其次，在生物医学应用前，iPSCs必须被重新分化为目标细胞类型，而分化细胞群体中残留的多能细胞具有显著的致瘤潜能，因此在细胞移植后存在较高风险⁶。第三，重编程过程通常通过慢病毒或逆转录病毒感染来诱导重编程因子的表达，这些病毒整合到宿主基因组中可能导致插入突变和/或转基因的非预期再激活^7,8。为此，已开发出非整合型系统，将重编程因子递送至靶细胞，从而最小化插入突变和转基因再激活的风险。这些无转基因方法的示例包括使用非整合型腺病毒或仙台病毒进行细胞重编程^9,10、基于DNA的载体¹¹，或无DNA的方法，如合成mRNA转染¹²或重组蛋白转导....

方案

本研究中使用的人成纤维细胞取自皮肤钻孔活检，获取样本前已获得受试者知情同意，并经德国维尔茨堡大学伦理委员会批准（伦理报告编号：96/11，日期：2011年6月10日）。

1. 穿孔活检

1. 消毒患者皮肤。使用0.5至1 ml盐酸甲哌卡因在将取活检的皮肤部位（优先选择较少日晒的区域）进行皮内麻醉，用无菌3 mm活检打孔器制备皮肤活检样本，用含1 µl/1 ml庆大霉素的DPBS冲洗活检组织，并去除脂肪组织。用含庆大霉素的DPBS冲洗活检组织两次，彻底吸除DPBS，覆盖Dispase II（2.4 U/ml），于16–18小时孵育 在 4 °C。
2. 吸弃Dispase溶液，用DPBS洗涤两次，并用镊子去除表皮。将活检组织用DPBS洗涤两次，加入2 ml胶原酶II型（500 U/ml CDU），转移至15 ml离心管中，并补加胶原酶至总体积5 ml。于37 °C、5% CO₂条件下孵育45分钟。₂.
3. 离心5分钟（180 × g），弃上清。将沉淀重悬于10 ml DMEM-FCS-庆大霉素培养基（含10% FCS，1 µl/ml 庆大霉素）中，再次以180 × g离心5分钟。弃上清，将沉淀重悬于1.5 ml DMEM-FCS-庆大霉素培养基中，转移至T25贴壁细胞培养瓶，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂.
4. 每3天更换一次培养基。

结果

本文介绍了一种整合性流程，可在不到8周的时间内，从皮肤穿刺活检获得的人类成纤维细胞诱导生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）（图1）。患者特异性的iNPCs可进一步分化为神经元和胶质细胞谱系，在细胞替代治疗和疾病建模方面具有巨大潜力。

用 Oct4-、Klf4-、Sox2- 和 c-myc-仙台病毒²³感染成纤维细胞，并在神经诱导培养基条件下培养^22,31，感染后17天成纤维细胞形态发生改变，并相继出现细胞克隆（图2）。所获得的单克隆细胞系可被扩增，并表达神经干细胞标志物，如 Sox2、Sox1、Nestin、Vimentin、Otx2 和 Pax6，同时也表达增殖标志物 Ki67，但不表达多能性相关标志物 Oct4（图3）。

此外，通过在细胞培养基中添加神经生长因子，可将神经前体细胞诱导分化为神经元。根据 Izrael et al.⁴² 的分化.......

讨论

本文展示了人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的无外源基因神经前体细胞及其分化后代细胞的方法，该方法可作为细胞替代疗法或药物筛选分析的潜在基础。通过强制表达谱系特异性转录因子，已实现体细胞向神经前体细胞（NPCs）的直接谱系转化^26,33,34。然而，在许多情况下，转分化实验使用的是胎儿成纤维细胞^33,34。对于生物医学应用而言，使用这类细胞并不适宜，因为该细胞来源限制了其在自体细胞替代疗法中的临床应用。最近有研究报道，可从更容易获取的组织（如造血细胞）中生成神经前体细胞^43,44。通过可诱导过表达八个外源基因，已成功从鼠源血液来源的B细胞中建立三向分化潜能的神经干细胞系⁴³。此外，Castano 等报道了一种利用Sox2和c-myc-Sendai病毒诱导人造血细胞生成神经前体细胞的方法⁴⁴。该方案可实现从CD133⁺脐血细胞快速高效地生成神经细胞。然而，当将其应用于成人外周血单个核细胞转化时，转化效率较低，且所获得细胞系的扩增能力极为有限⁴⁴。因此，迄今为止在人类.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
星形胶质细胞培养基	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
活检打孔器	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
胶原酶 II 型	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
庆大霉素	Sigma	G1397
GFAP 抗体	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
人白血病抑制因子（hLIF）	Peprotech	300-05
胰岛素	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67 抗体	NeoMarkers	RM-9106-S
L-谷氨酰胺	LifeTechnologies	25030-024
层粘连蛋白	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin 抗体	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal 培养基	LifeTechnologies	21103-049
非必需氨基酸	LifeTechnologies	11140-050
神经干细胞冻存培养基	Sigma	C6295
Oct4 抗体	Santa Cruz	sc9081
Pax6 抗体	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
仙台病毒：CytoTune 仙台重编程试剂盒	LifeTechnologies	A1378001
丙酮酸钠	Life Technologies	11360-039
Sox1 抗体	R&D Systems	AF3369
Sox2 抗体	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1 抗体	Covance	MMS-435P-250
维生素 C	Sigma	A4544
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
β-巯基乙醇	LifeTechnologies	21985023