应用长期培养的干扰素-γ酶联免疫斑点试验评估牛效应与记忆T细胞应答

摘要

长期培养的γ干扰素酶联免疫斑点试验用于评估中枢记忆反应，并与保护性抗分枝杆菌疫苗反应相关。在该试验中，外周血单个核细胞经分枝杆菌抗原和白细胞介素-2刺激培养14天，以促进中枢记忆T细胞的分化与扩增。

摘要

效应T细胞和记忆T细胞是在初始T细胞识别抗原后，通过发育编程产生的。如果感染得到控制，在扩增阶段产生的T细胞中高达95%将被清除。即，收缩期）后，记忆性T细胞会持续存在，有时可达终生。在人类中，根据淋巴结归巢受体的表达情况，已描述出两种功能不同的记忆性T细胞亚群。中央记忆性T细胞表达C-C趋化因子受体7（CCR7）和CD45RO，主要定位于次级淋巴器官的T细胞区域。效应记忆性T细胞表达CD45RO，但不表达CCR7，并具有促使淋巴细胞向外周或炎症组织归巢的受体。效应T细胞既不表达CCR7也不表达CD45RO，但在遇到抗原时可产生效应细胞因子，如干扰素-γ。干扰素-γ释放试验被用于牛结核和人类结核病的诊断，主要检测效应T细胞和效应记忆性T细胞的应答。CD4⁺中央记忆性T细胞的应答⁺ 另一方面，T细胞对疫苗的应答可用于预测疫苗效力，这一点已在非人灵长类动物的猴免疫缺陷病毒感染、小鼠的结核病以及人类的疟疾研究中得到证实。多项针对小鼠和人类的研究，以及有关牛的未发表数据均表明，干扰素-γ酶联免疫斑点（ELISPOT）检测可测量中枢记忆T细胞应答。在该检测中，外周血单个核细胞在抗原浓度递减的条件下培养10至14天（长期培养），使效应应答达到峰值并逐渐消退，从而促进中枢记忆T细胞在培养过程中分化与扩增。

引言

效应T细胞和记忆T细胞是在初始CD4+ T细胞识别抗原后，通过发育编程产生的。初始CD4+ T细胞分化为细胞因子产生细胞，需要天然免疫细胞识别病原体、抗原提呈给T细胞、共刺激信号以及转录水平的改变，从而导致极化性细胞因子的产生。例如：当细胞内病原体感染时，抗原提呈细胞产生白细胞介素（IL）-12，该因子与抗原识别共同作用，通过信号转导子和转录激活子4（STAT4）以及T细胞表达的T-box转录因子（T-bet）介导信号传导，促进T细胞向辅助性T细胞1（Th1）分化^1,2，进而引发细胞活化、IL-2产生、克隆扩增以及干扰素（IFN）-γ的分泌^3,4。如果感染得到控制，在扩增阶段产生的T细胞中高达95%将被清除（即，收缩阶段），而记忆T细胞则得以保留，有时可持续终生⁵。Sallusto et al.⁶ 根据淋巴结归巢受体的表达情况，在人类中鉴定出两种功能不同的记忆T细胞亚群。中央记忆T细胞（Tcm）表达C-C趋化因子受体（CCR）-7和CD45RO，主要定位于次级淋巴器官的T细胞区域。Tcm效应功能有限，活化阈值较低，并保持较强的IL-2产生能力和增殖潜能。效应记忆T细胞（Tem）表达CD45RO，但不表达CCR7，并具有向外周组织或炎症部位归巢的受体。效应T细胞既不表达CCR7也不表达CD45RO，但在识别抗原后可迅速产生效应细胞因子，如IFN-γ。

γ-干扰素释放试验（IFN-γ release assays, IGRA）用于牛结核病和人类结核病的诊断⁷。Mycobacterium bovis 是牛结核病（bTB）的主要病原体，而人类结核病主要由 Mycobacterium tuberculosis 引起。在这些检测中，全血或外周血单个核细胞（PBMC）用分枝杆菌抗原刺激16至24小时，然后通过ELISA检测上清液中的IFN-γ产生水平，或采用ELISPOT技术检测产生IFN-γ的细胞。由于刺激时间较短（即，16至24小时）且细胞因子迅速产生，ex vivo 检测主要反映效应T细胞和效应记忆T细胞（Tem）的应答。这一结论已通过流式细胞术对这些培养物中细胞群体的分析得到证实^8-10。

离体 IFN-γ反应通常被纳入结核病疫苗免疫反应谱的评估中，包括用于评估牛免疫反应的疫苗。大多数有效的牛结核病疫苗可诱导特异性的IFN-γ反应，但并非所有诱导IFN-γ反应的疫苗都具有保护作用。此外，接种疫苗后在感染前测得的IFN-γ水平并不一定与保护效果相关。例如，不同的BCG菌株在诱导IFN-γ反应的能力方面可能存在差异 离体 IFN-γ反应，尽管保护水平相似¹¹因此， 离体 IGRAs 在结核病诊断和评估疫苗免疫原性方面具有重要价值；然而，其作为疫苗效力预测指标的应用有限。相比之下，疫苗接种后诱导的中央记忆性T细胞（Tcm）应答或可用于预测疫苗效力，这一点已在非人灵长类动物感染猴免疫缺陷病毒（SIV）的研究中得到证实。^12,13小鼠结核病¹⁴ 以及人类疟疾^15,16.

在有效的免疫应答清除病原体后，中央记忆性T细胞（Tcm）得以维持，并对同一致病因子的再次感染提供保护。这一规律的一个显著例外是人类感染M. tuberculosis的情况，接受治愈性抗分枝杆菌治疗的患者仍易发生再感染^17,18。此外，对于慢性感染过程中免疫记忆形成的调控机制，尤其是抗原持续刺激条件下的情况，目前尚不明确¹⁹。在诸如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和结核病等慢性感染中，较强的Tcm应答通常与良好的临床结局相关（例如，结核病的潜伏状态和HIV感染的亚临床疾病状态）^20,21。多项针对小鼠和人类的研究表明，长期培养的IFN-γ ELISPOT检测可用于评估Tcm应答^16,20-22。在该检测中，外周血单个核细胞（PBMCs）在抗原浓度递减的条件下培养10至14天，使效应应答达到高峰并逐渐消退，从而促进Tcm在培养过程中分化和扩增。

长期培养的IFN-γ ELISPOT检测也已应用于兽医学研究，但由于缺乏关键试剂（尤其是CCR7抗体），难以评估应答细胞的表型。有效的牛结核病疫苗[例如单次剂量 M. bovis 卡介苗（BCG）、卡介苗联合病毒载体抗原85A亚单位疫苗，或减毒 M. bovisΔRD1] 在接种后可诱导长期培养的 IFN-γ ELISPOT 反应，该反应与保护效果相关即，降低分枝杆菌负荷并减轻结核病相关病理损伤）在随后的强毒株攻击下 M. bovis^23,24此外，新生小牛接种卡介苗后12个月时，长期PBMC培养物中抗原特异性分泌IFN-γ的细胞数量较高，但在24个月时下降，这与可检测到的保护程度相关 M. bovis 挑战²⁵在此情况下，培养型IFN-γ ELISPOT是预测疫苗效力的重要工具，可为高成本的效力试验筛选优先候选疫苗提供依据。此外，通过更换抗原或抗体，培养型ELISPOT技术可针对不同宿主、病原体和细胞因子进行优化，适用于多个研究领域的多种研究目的。

方案

1. 准备以下溶液

1. 在 RPMI 1640 培养基中加入胎牛血清（FBS）至终浓度为 10 %（体积/体积），谷氨酰胺（2 µM），丙酮酸钠（1 µM），非必需氨基酸（0.1 µM），青霉素-链霉素（青霉素 100 单位/ml，链霉素 0.1 mg/ml）和 2-巯基乙醇（50 mM），配制完全 RPMI 培养基（cRPMI）。
2. 通过将柠檬酸钠（77 µM）、柠檬酸（38 µM）和右旋糖（122 µM）溶于蒸馏水中，配制 2 × 酸性柠檬酸葡萄糖溶液（acid citrate dextrose）。
3. 配制无钙镁磷酸盐缓冲液（Ca²⁺ Mg²⁺ free PBS），pH 7.2：将 NaCl（137 mM）、KCl（2.7 mM）、Na₂HPO₄（二碱，10 mM）、KH₂PO₄（单碱，2 mM）溶于蒸馏水中，调节 pH 至 7.2。
4. 将牛血清白蛋白（BSA）以 1 g / 100 ml PBS（体积/重量）的比例加入 PBS 中，配制含 1 % BSA 的 PBS 溶液（PBS 1 % BSA）。
5. 将 0.05 % Tween 20（体积/体积，500 μl Tween 20 / 1 L PBS）加入 PBS 中，配制含 0.05 % Tween 20 的 PBS 溶液（PBST）。
6. 将 Tris（100 mM）和 HCl（0.50 mM）溶于蒸馏水中，配制 100 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 8.2。
7. 将乙醇（纯度 ≥99.5%）与蒸馏水按 35 ml 乙醇 / 100 ml 蒸馏水（体积/体积）的比例稀释，配制 35 % 乙醇溶液。
8. 使用 0.22 μm 滤器对 cRPMI、2 × 酸性柠檬酸葡萄糖溶液、PBS 和 PBS 1 % BSA 进行过滤除菌。

2. 长期培养细胞（14天方案）

（第一天）

1. 用cRPMI将抗原溶液配制成最终浓度的两倍。抗原的选择至关重要，应根据研究目的进行优化。
2. 将重组结核分枝杆菌（M. tuberculosis）抗原TB10.4和Ag85A稀释至2 μg/ml（每种抗原的终浓度为1 μg/ml）。
3. 将牛分枝杆菌（M. bovis）纯化蛋白衍生物（PPD-B，Prionics Ag）稀释至10 μg/ml（终浓度为5 μg/ml）。
4. 将重组早期分泌抗原靶6（ESAT-6）与培养滤液蛋白10（CFP-10）融合蛋白（rESAT-6:CFP10）稀释至2 μg/ml（终浓度为1 μg/ml）。
   注意：这些抗原是结核分枝杆菌中诱导IFN-γ产生的免疫优势抗原，可用于刺激来自M. bovis感染动物的外周血单个核细胞（PBMC）。由于编码这些抗原的区域（即RD1）在BCG或M. bovis ΔRD1疫苗株中已被删除，因此接种过这些疫苗的动物不会对rESAT-6:CFP10产生反应。本研究中使用的rESAT-6:CFP10由爱荷华州立大学C. Minion博士惠赠。TB10.4和Ag85A是毒力株及疫苗株M. bovis中均存在的免疫优势抗原³⁷。PPD-B作为一种纯化蛋白衍生物，包含多种抗原成分，其中部分抗原也存在于非结核分枝杆菌中。感染动物可能对所有抗原（即TB10.4、Ag85A、rESAT-6:CFP10和PPD-B）均产生反应，而接种疫苗的动物则不应对rESAT-6:CFP10产生反应¹¹。
5. 在24孔板中，为每只动物以四复孔形式每孔加入500 μl抗原溶液。本方案中使用抗原混合物，因此所有孔均含有全部抗原，此步骤不设对照（如空白或有丝分裂原对照）。将培养板置于39 °C、5 % CO₂条件下孵育。牛的正常体温为39 °C，因此一些研究人员在培养牛源细胞时采用39 °C。此外，在某些人源细胞培养情况下，39 °C培养也可带来额外益处^26,30。
6. 用6 ml的2×酸-柠檬酸-葡萄糖溶液预装连接16或18 G 皮下注射针头的注射器；通过颈静脉穿刺采集60 ml牛血。
7. 按照Maue et al.²⁷所述方法，通过标准密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），并将细胞浓度调整至4 × 10⁶ 个细胞/ml。
8. 将细胞（每孔500 μl）加入已预置抗原的24孔板中，每只动物设四复孔（见步骤2.5）。将培养板置于39 °C、5 % CO₂条件下孵育。

（第三天和第七天）

9. 采用无菌操作技术，小心地从每个孔中移除500 μl上清液，避免扰动细胞层。
10. 通过每孔加入含有 IL-2（30 U/μl）的 cRPMI 500 μl 补充孔内液体体积， 即，15 U/孔；重组人IL-2 Sigma I7908）。将培养板置于39 °C、5% CO₂条件下孵育₂.

（第10天和第12天）

11. 采用无菌操作技术，从每个孔中移除 750 μl 上清液。每孔补充 750 μl cRPMI（不含 IL-2）。将培养板置于 39 °C、5 % CO₂ 条件下孵育。

3. ELISPOT 实验（三天方案）

（第一天（12 ^th 长期培养方案的第几天

1. 正确标记ELISPOT板上的每组样本，以避免加样时出错：长期培养细胞加抗原呈递细胞（APCs）、长期培养细胞不加APCs，以及ex vivo/短期培养细胞（图1）。每种处理条件（即抗原刺激）应至少设置复孔。
2. 用PBS稀释小鼠抗牛IFN-γ抗体（MCA2112，克隆号CC330），配制捕获抗体溶液（8 μg / ml）。
3. 使用多通道移液器，每孔加入15 μl 35%乙醇，预润湿ELISPOT板孔1分钟。为防止膜损伤，在整个实验过程中切勿让移液器吸头接触孔底。
4. 用PBS每孔300 μl洗涤板6次。通过翻转板弃去洗涤液。洗涤过程应迅速进行，避免板孔干燥。
5. 每孔加入100 μl捕获用抗IFN-γ抗体（来自上述步骤1）。于4 °C过夜孵育（将板置于带密封拉链的储存袋中）。

（第二天（13 ^th 长期培养方案的当天

6. 制备抗原溶液，浓度为最终浓度的两倍。处理方式包括：无刺激（cRPMI）、PPD-B（20 μg / ml，最终浓度：10 μg / ml）、TB10.4 和 Ag85A 蛋白混合物（每种蛋白 2 μg / ml，最终浓度：每种蛋白 1 μg / ml）、rESAT-6:CFP10（用于 M. bovis 感染，2 µg / ml，最终浓度：1 μg / ml），以及阳性对照（如商陆有丝分裂原 PWM，20 μg / ml，最终浓度：10 μg / ml）。可使用其他有丝分裂原替代 PWM（例如，刀豆蛋白 A）。
   注意：此步骤中抗原分为四种不同的处理，不作为混合物使用（与步骤 2.5 不同）。四种处理分别为：无刺激（NS）、PPDb、蛋白混合物（TB10.4 和 Ag85A 作为一个处理）和 PWM。

4. 短期细胞培养与贴壁细胞（APCs）分离

1. 从第1天采血的同一批动物（属于长期培养，14天方案）采集60 ml血液，并如前所述分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 将细胞浓度调整至2 × 10⁶ 个细胞 / ml。清晰标记试管，以防止加样时混淆。这些细胞将用于抗原呈递细胞（APCs）的分离，同时也用于短期细胞培养（步骤6.5）。试管上需同时标注动物编号和培养类型（本例中为：ex vivo、短期或新鲜细胞）。
3. 通过倒置板去除ELISPOT板中多余的捕获抗体。用300 μl PBST洗涤板6次。
4. 尽可能吸除PBST。将50 μl细胞悬液加入标记为“长期培养细胞加APCs”的孔中。其余孔每孔加入200 μl cRPMI进行封闭。在39 ^°C孵育90分钟。将cRPMI预热至39 ^°C（后续步骤需要）。未用于贴壁细胞（APCs）分离的新鲜PBMCs将在后续步骤中使用，应妥善保存。

5. 培养细胞

1. 在90分钟孵育期间（步骤4.4，短期培养和贴壁细胞分离步骤），收获长期培养的细胞。
2. 使用5或10 μl移液器，将含有细胞的培养基反复吹打以使细胞脱落，将每只动物的四份重复样本合并至一个15 ml离心管中。在400 g条件下离心5分钟。
3. 离心后，通过倒置离心管弃去上清液，轻轻敲击使细胞沉淀松动。加入5 ml PBS，必要时轻柔重悬细胞沉淀。重复离心一次，再重复洗涤步骤两次。每次均通过倒置离心管弃去上清液，最后在1 ml cRPMI中轻柔重悬细胞。将细胞浓度调整至2 × 10⁵ 个细胞 / ml。

6. 新鲜及培养后外周血单个核细胞的铺板

1. 孵育90分钟后，将培养板在板式振荡器上振荡30秒。通过倒置培养板去除未贴壁细胞。每孔加入150 μl预热的cRPMI（来自步骤4，短期细胞及贴壁细胞（抗原呈递细胞）分离步骤）。
2. 震荡培养板并弃去洗涤液，重复洗涤3次。将每种抗原各100 μl加入相应孔中（预先标记）。
3. 接种细胞时，用移液器将长期培养的细胞悬液以每孔100 μl（2 × 10⁶ cells/ml）加入培养板中⁵ 细胞/ml）加入标记为“长期培养细胞加抗原呈递细胞”的孔中。确保此步骤中加入的长期培养细胞与孔中已有的抗原呈递细胞来自同一动物。切勿混合不同动物来源的抗原呈递细胞与长期培养细胞。
4. 用移液器向每孔加入100 μl长期培养的细胞悬液（2 × 10⁶ cells/ml）⁵ 细胞/毫升）加入无抗原呈递细胞（APCs）的孔中，以评估长期培养反应对抗原呈递细胞的需求。
5. 每孔加入 100 μl 短期培养细胞（ freshly isolated 并调整至 2 x 10⁶⁶ 细胞/毫升）用于 离体 反应评估。将培养板在39℃下过夜孵育 ^°C / 5% CO₂₂ 培养箱。确保培养皿平放，切勿叠放。
   注意：如果需要分析细胞表型，可将流式细胞术作为辅助检测方法。细胞按ELISPOT实验所述方法接种于96孔U型底培养板（而非ELISPOT板）中。应跳过包被抗体吸附步骤（步骤3.4至3.5）。随后将细胞在39 °C、5 % CO2条件下过夜孵育，并按照标准细胞染色流程进行操作。细胞染色试剂见试剂表。

第三天（14 ^th 长期培养方案的第几天

6. 将检测抗体（小鼠抗牛 IFN-γ，克隆号 CC302）用含 1% BSA 的 PBS 稀释至 5 μg / ml。弃去孔中液体，并洗涤板：先用 PBST（每孔 300 μl）洗 6 次，每次洗涤前及洗涤间隔均在摇床上震荡 10 秒，再用 dH₂O（每孔 300 μl）洗 1 次，接着再用 PBST（每孔 300 μl）洗 6 次，最后用 PBS（每孔 300 μl）洗 2 次。在细胞已从板上移除且无生物安全风险的情况下，后续操作可在生物安全柜外进行。
7. 弃去洗涤液。通过将板轻拍在纸巾上尽可能去除残留洗涤液。每孔加入 100 μl 检测抗体。
8. 在 39 ^°C 下孵育 120 分钟。在此孵育期间，按照制造商说明书配制碱性磷酸酶溶液。在使用前 30 分钟（即加入检测抗体后 90 分钟），将试剂用 PBST 稀释。轻轻颠倒混匀试剂，并在室温下孵育。
9. 120 分钟孵育结束后，通过倒置板弃去多余的检测抗体。用 PBST（每孔 300 μl）洗板 6 次。通过将板轻拍在纸巾上尽可能去除残留洗涤液。
10. 每孔加入 100 μl 碱性磷酸酶溶液（来自上述第 3 步）。在室温下孵育 45 分钟。弃去液体，并用 PBST（每孔 300 μl）洗板 6 次。
11. 按照制造商说明书配制底物溶液（Vector Blue AP substrate III）：将试剂稀释于 100 mM Tris HCl pH 8.2 缓冲液中。每孔加入 50 μl 底物溶液。
12. 在室温下孵育，直至蓝色开始显现（约 30 分钟）。弃去液体，并用大量 dH₂O 洗涤板。取下底部板以暴露膜，冲洗孔背面，并使板自然晾干。
13. 使用免疫斑点图像分析仪或 ELISPOT 读板仪（表 1）读取结果，或使用体视显微镜人工读取。也可将板置于室温避光保存，待后续读取。由于反应底物具有高度稳定性，结果质量可保持数年。
    注意：细胞和抗原浓度已优化，以避免出现无法计数的斑点^23,24,27,37。但在不同实验条件下或因生物学变异，仍可能出现无法计数的斑点。若发生此情况，应优化细胞浓度，以获得可读的斑点计数结果。

7. 平板读取与数据分析

1. 根据 Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT 酶标仪使用指南（表 1）进行分析。在获得每个孔的斑点计数后，计算复孔之间的平均值。每种抗原刺激物的特异性免疫应答通过从抗原刺激孔的平均斑点数中减去未刺激孔的平均斑点数来计算。

结果

气溶胶感染约一个月后 M. bovis (10⁴ 菌落形成单位），感染组（n=8）和对照组动物（n=8）的外周血单个核细胞（PBMCs）在抗原和IL-2存在的条件下培养13天。通过IFN-γ ELISPOT实验检测感染后中央记忆性T细胞（Tcm）应答的发育情况。代表性Tcm反应（在有或无抗原呈递细胞[APCs]的条件下）及 ex体内 感染动物（三只）和非感染动物（一只）的IFN-γ ELISPOT反应结果如图所示 图1成功的长期干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）实验结果应表现为：在刺激条件下，细胞产生IFN-γ（即斑点形成细胞，SFC）；而在非感染动物样本及非刺激条件下，几乎无反应。此外，应对PWM产生强烈的T细胞反应。针对特定抗原的反应应 M. bovis 通过PPD-B或rESAT-6:CFP10抗原刺激进行评估。如图所示 图1，稳健的Tcm和 离体 PPD-B 和 rESAT-6:CFP10 的反应在全部三个样本中均被检测到 M. bovis-感染动物。Tcm 极少或没有 离体 对照动物中检测到反应。此外，感染动物产生最佳记忆性T细胞（Tcm）反应需要抗原呈递细胞（APCs）的存在，这一点通过在缺乏同源APCs的条件下长期培养细胞导致反应显著降低得以证实。来自PBMCs的IFN-γ反应 M. bovis 感染与非感染动物的结果如下所示 图2每只动物的SFC数量通过PPD-B刺激下双份样本中SFC的平均数减去相应培养基对照组的反应值来计算。对10个样本进行了反应估计。⁶ 细胞。反应存在差异（P < 0.05），依据感染状态、APC 的有无以及培养时间（即长期培养与 离体 培养）。

获取培养板图像
1.	打开仪器电源
2.	启动“Immuno Capture” Version 6.3 软件
3.	步骤1：选择培养板类型
4.	步骤2：加载培养板
5.	步骤3：选择扫描选项
6.	步骤4：开始扫描
7.	获取培养板的概览图像
8.	弹出培养板
9.	退出“Immuno Capture”软件
斑点形成单位计数
1.	启动“Immuno Spot Capture” Version 5.0 软件
2.	选择对象类型：常规
3.	选择计数模块：智能计数
4.	步骤1：加载培养板
5.	步骤2：定义计数参数：在不同斑点数量的孔中测试斑点识别的准确性
6.	开始自动计数
质量控制
1.	启动“Immunospot Capture” Version 5.0 软件
2.	选择计数模块：质量控制
3.	步骤1：加载培养板
4.	步骤2：单独分析高亮显示的孔
5.	完成质量控制

表1 - AutoImmun Diagnostika ELISPOT 读板仪图像采集与细胞计数步骤。

图1. 长期培养的IFN-γ ELISPOT 实验 约在强毒株攻击后一个月进行培养的IFN-γ ELISPOT检测 M. bovis （三只动物）。未感染动物作为对照组（一只动物）. 通过使用重组Ag85A（1 µg/ml）、TB10.4（1 µg/ml）、rESAT-6:CFP10（1 µg/ml）和PPD-B（5 µg/ml）的混合物刺激外周血单个核细胞（PBMC）13天，建立长期细胞系，随后将细胞转移至ELISPOT板中，有或无自体抗原呈递细胞（APC）存在。短期细胞则由第13天分离的PBMC直接接种至ELISPOT板中。长期和短期细胞均用PPD-B（10 µg/ml）、rESAT-6:CFP10（1 µg/ml）、单独培养基或商陆有丝分裂原（5 μg/ml）刺激24小时。

图2. 长期培养的IFN-γ ELISPOT对M. bovis纯化蛋白衍生物（PPD-B）反应的代表性结果。在强毒株M. bovis攻毒约一个月后进行长期培养的IFN-γ ELISPOT检测（共8只动物）。未感染动物作为对照组（8只动物）。长期培养细胞通过用重组Ag85A（1 µg/ml）、TB10.4（1 µg/ml）、rESAT-6:CFP10（1 µg/ml）和PPD-B（5 µg/ml）混合物刺激PBMC持续13天，随后转移至ELISPOT板中，并在有或无自体抗原呈递细胞（APC）的条件下进行培养。短期细胞则指在第13天直接分离的PBMC，并立即接种至ELISPOT板中。长期与短期细胞均用PPD-B（10 μg/ml）或仅培养基刺激24小时。每只动物的特异性反应（SFC/10⁶细胞）以PPD-B刺激孔反应值（双复孔均值）减去仅培养基孔反应值得出。

讨论

长期培养的ELISPOT实验中IFN-γ的产生通常源于人类的中央记忆性T细胞（Tcm），但该反应在培养过程中如何形成尚不明确。循环中是否存在Tcm并发生扩增 体外，或Tcm应答是否由效应细胞和Tem细胞在培养过程中分化为Tcm所致，目前尚不清楚。然而，利用人类样本的研究发现，CD4⁺ T细胞来自 离体 长期培养的IFN-γ ELISPOT实验显示其表位特异性彼此无关，表明中央记忆性T细胞（Tcm）反应并非由效应细胞发育而来²⁸。显然，免疫应答的持续时间可能有所不同，但如果实现了病原体清除，最终两者都将 离体 且Tcm应答下降。此外，长期培养的应答在抗原初次致敏早期和晚期（当效应应答较低时）的测量结果显示出相关性，表明在抗原初次致敏早期和晚期循环中的Tcm群体仍具有关联性 体内 另一方面，其幅度的 离体 反应似乎与记忆反应的强度无关²⁹这些结果表明，长期培养的 IFN-γ ELISPOT 反应源于 体外 Tcm 的扩增以及样本中效应反应的相应减弱，而非效应细胞向 Tcm 表型的分化。

对于牛而言，效应细胞和记忆细胞亚群对长期干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）检测所测得的免疫应答的相对贡献尚不明确。近期研究表明，疫苗诱导的长期培养IFN-γ ELISPOT应答与后续针对牛分枝杆菌（M. bovis）实验性感染的保护作用之间存在相关性^23-24。已有报道指出，疫苗接种后较弱的长期IFN-γ ELISPOT应答与缺乏保护作用相关³⁰。活疫苗和灭活疫苗均可诱导相似的体外（ex vivo）IFN-γ ELISPOT应答，但接种活卡介苗（BCG）所诱导的长期培养IFN-γ ELISPOT应答强于灭活疫苗制剂。有趣的是，活疫苗具有保护作用，而灭活疫苗制剂在抵抗强毒结核分枝杆菌攻击时无法提供保护作用^{31-32, 33}。

通过从外周血单个核细胞（PBMC）中分选中央记忆性T细胞（Tcm），也可对其应答进行评估。然而，直接从PBMC中富集Tcm需要昂贵的设备和高度专业化的人员，且操作困难，因为这类细胞在血液中数量较少。长期培养PBMC可在无需昂贵设备的情况下实现Tcm相对于效应记忆性T细胞（Tem）和效应T细胞的选择性富集；然而，由于这些T细胞亚群在培养过程中会发生扩增 体外 它们可能不太具有代表性 体内 记忆反应。除了ELISPOT之外，还可通过其他检测方法获取IFN-γ记忆反应（使用长期培养或Tcm分选策略），例如：细胞因子ELISA³⁴，细胞因子微球阵列（CBA）、胞内染色（ICS）或细胞因子蛋白阵列（CPA）。然而，这些方法的灵敏度通常低于ELISPOT实验³⁵.

ELISPOT 的一个优势在于能够在其释放后立即捕获细胞因子，防止其在上清液中被稀释，或被酶解降解，或其他细胞对细胞因子的摄取。ELISPOT 检测可识别单个分泌细胞因子的细胞，即使在信噪比较低的情况下也能提供精确的结果。即， 低特异性反应³⁵此外，使用胞内细胞因子染色（ICS）时，在细胞因子释放前进行检测可能导致对细胞因子产生细胞的错误鉴定（例如，由于分泌过程之前或期间的翻译后修饰）³⁴在ICS检测中使用的转运抑制剂（即高尔基体阻断蛋白）会因这些蛋白的细胞毒性而限制细胞刺激的持续时间，从而最终影响细胞因子的产生。³⁵.

尽管如此，CBA、CPA 和 ICS 是用于同时检测多种细胞因子和/或确定细胞表面标志物表达的有用技术即因此，这些方法可与IFN-γ ELISPOT检测联合使用³⁶虽然以往的牛结核病疫苗效力研究通过ELISPOT实验检测Tcm应答，但采用其他技术检测Tcm应答也可能获得可比的结果。重要的是，与CBA、CPA和ICS分析技术相比，ELISPOT实验成本更低且操作更简便。³⁴手动计数SFC是自动计数的一种替代方法，ELISPOT板在计数前或计数后均可在室温下长期保存，且质量损失极小。³⁷.

长期培养的干扰素-γ酶联免疫斑点（ELISPOT）反应已被用于评估人类和牛在结核病疫苗应答中的记忆性免疫反应^{14-16,31-32,33}。中枢记忆性T细胞（Tcm）应答也被认为在牛对其他多种病原体的宿主免疫应答中发挥重要作用，例如：Mycoplasma mycoides 亚种 mycoides⁴²、Anaplasma marginale³⁸ 以及牛呼吸道合胞病毒³⁹。理论上，长期ELISPOT检测方法还可适用于其他动物种类、细胞因子及感染模型。这些更广泛的应用前景在兽医免疫学领域尤为有价值，因为目前特异性试剂的可及性仍十分有限。

中央记忆性T细胞（Tcm）应答对于抵抗多种感染至关重要，但在感染或免疫接种后早期（用于疾病结局预测或疫苗效力评估）检测Tcm应答可能较为困难。在体外（ex vivo）条件下进行短期抗原刺激的免疫应答分析，通常更多反映的是效应应答，这是由于记忆应答与效应应答存在重叠，尤其是在免疫记忆形成的初期阶段。在抗原负荷持续存在的慢性疾病背景下，体外（ex vivo）应答所检测到的往往是效应细胞应答，或记忆细胞与效应细胞应答的混合。本文所述的长期培养干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，更有可能特异性地检测到Tcm应答，而非效应T细胞或总的CD4⁺ T细胞的联合应答。总之，长期培养IFN-γ ELISPOT检测为评估T细胞记忆应答提供了一种有价值的方法，已成功用于评估多种物种对多种病原体感染所产生记忆应答的研究^{12-16, 20-25,29,31,33,34,38,39}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸钠（二水合物）	多种
柠檬酸（一水合物）	多种
右旋葡萄糖	多种
ELISPOT PVDF 板	多种
Vectastain ABC – AP KIT 标准试剂盒	Vector Laboratories	AK-5000
Vector Blue 碱性磷酸酶底物试剂盒	Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6:CFP10	Iastate 的 Minion 博士惠赠		23, 24, 25, 27,  37
小鼠抗牛 IFN-γ 克隆 CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
生物素标记的小鼠抗牛 IFN-γ 克隆 CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
小鼠抗牛 CD4 克隆 CC8	Serotec	MCA1653GA
小鼠抗牛 CD45RO 克隆 IL116A	Serotec	MCA2434GA
大鼠抗人 CCR7 克隆 3D12	Abcam	ab95665
PE 标记的小鼠抗牛 IFN-γ 克隆 CC302	Serotec	MCA1783PE
羊抗小鼠 IgG2a-Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
羊抗小鼠 IgG3-APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
羊抗大鼠 IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD Cytofix/Cytoperm™	BD Biosciences	554714
布雷菲德菌素 A	Sigma-Aldrich	B7651
商陆有丝分裂原	Sigma-Aldrich	L8777
重组人白细胞介素 2	Sigma-Aldrich	I7908