提高疟疾高分辨率熔解单核苷酸多态性分型灵敏度的方法

摘要

尽管高分辨率熔解分析能够区分异质群体中的单核苷酸多态性，但突变等位基因的扩增偏好性可增强其检测样本中相对低比例等位基因的能力。本方案描述了提高高分辨率熔解分析灵敏度的改进方法。

摘要

尽管数十年来一直在努力根除疟疾，但疟疾仍然是全球面临的重大负担。近年来，随着对区域消除和全球根除疟疾的兴趣重新兴起，关于引起疟疾的疟原虫（Plasmodium）物种的基因组信息也日益增多，包括不同地理种群的特征以及与抗疟药物敏感性降低相关的变异。

一种常见的遗传变异——单核苷酸多态性（SNPs）——为寄生虫基因分型提供了理想的靶标。这些标记不仅可用于追踪药物抗性标记，还可利用不受药物或其他选择性压力影响的标记来追踪寄生虫种群。

单核苷酸多态性（SNP）分型方法可用于追踪药物抗性，同时对个体寄生虫进行“指纹”鉴定，以开展种群监测，特别是在接近消除疟疾的地区应对疟疾防控工作时尤为重要。

尽管已鉴定出与特定基因分型技术无关的信息性SNP，但高分辨率熔解（HRM）分析特别适用于基于现场的研究。与标准的基于荧光探针的方法相比，后者需要每个SNP使用单独标记的探针，且在检测含有多个基因组（多基因组）样本中的SNP时灵敏度最多仅为10%，而HRM的灵敏度可达2-5%。通过对HRM进行改进，例如使用封闭探针、不对称引物浓度，以及优化扩增退火温度以使PCR偏向于扩增低频等位基因，可进一步提高HRM的灵敏度。虽然灵敏度的提升程度取决于具体的检测体系，但我们已将检测灵敏度提高至可检测低于1%的低频等位基因水平。

在接近消除疟疾的地区，及早发现新出现或输入性药物耐药性对于及时应对至关重要。同样，检测多基因组感染并区分输入性寄生虫类型与隐蔽的地方性传染源的能力，可为防控项目提供重要信息。

本文描述了对高分辨率熔解技术的改进，这些改进进一步提高了该技术检测患者样本中多基因组感染的灵敏度。

引言

尽管人们对疟疾防控和根除重新产生了兴趣，但疟疾仍然是全球性的负担，全球近一半人口面临感染风险，每年导致超过55万人死亡，尤其是撒哈拉以南非洲地区的儿童¹。

这些新的防控和根除计划得到了基因组学复兴的支持，大量疟原虫已被测序并分析，以寻找与药物敏感性降低、毒力增强以及群体特征相关的突变^2,3。单核苷酸多态性（SNPs）是最常被识别出的遗传变异类型之一^4-7。

便携式 SNP 分型方法可实现现场和实时的群体监测与追踪⁸。除了对单个寄生虫进行分子指纹鉴定外，“分子条形码”还可用于检测等位基因频率的显著时间变化，以及有效群体大小和感染复杂性的变化⁹。

尽管这一组信息性SNP可轻松适配多种基因分型平台，但高分辨率熔解（HRM）分析尤其适用于基于现场的研究，在资源有限的环境中，相较于测序及其他方法，HRM具有高灵敏度、操作简便、检测成本低等优势，适合用于新发突变的检测。

高分辨率熔解曲线分析（HRM）始于标准的聚合酶链式反应（PCR），该反应中加入荧光染料。PCR后的熔解分析可确定扩增产物的峰值熔解温度；在短扩增片段中，单个单核苷酸多态性（SNP）差异即可导致显著的峰值熔解温度（Tm）差异。

该方法的多项改进可提高基因分型分辨率，以区分包括IV类（A-T）在内的单核苷酸多态性（SNPs），并检测在存在多个等位基因（多基因组感染）样本中的低频突变等位基因。首先，检测体系中除正向和反向引物外，还引入了以SNP区域为中心的短探针，且引物浓度设置不同。这些封闭型探针在PCR过程中不会被扩增，但可与因引物浓度不对称而过量产生的DNA链结合，从而增加探针-模板产物的生成。由探针与过量模板链结合形成的独立双链扩增子长度约为20–30 bp，相较于完整的扩增子（80–150 bp）显著缩短，使得单个或多个碱基错配所导致的探针-模板Tm值差异更加明显¹⁰。

其次，突变等位基因扩增偏倚（MAAB）通过降低反应的退火温度，使反应偏向于多基因组感染中低比例存在的突变等位基因。退火温度设定在完全匹配（野生型）与不匹配（突变型）探针的 Tm 值之间。在此温度下，野生型等位基因的结合稳定性足以抑制其扩增，而相对于其不匹配的对应物，从而在同一样本中同时存在两种等位基因时，使扩增偏向于突变等位基因¹⁰。

通过这些高分辨率熔解曲线（HRM）技术的改进，该方法已能够追踪与南美洲流行性感染相关的寄生虫的来源和身份¹¹，并可检测新突变，区分序列中相邻位置的多个单核苷酸多态性（SNP），以及在多基因组样本中等位基因频率低于1%的突变¹⁰。

灵敏度的提高在接近消除疟疾状态的地区以及面临药物耐药性出现风险的地区尤为重要。在现场快速、简便地鉴定输入性寄生虫及与敏感性降低相关的单核苷酸多态性（SNP），有助于监测工作和防控项目评估其实施效果，并识别出需要加强疟疾根除和消除工作的重点区域。本方案描述了基于阻断探针和MAAB方法以提高高分辨率熔解（HRM）基因分型灵敏度的技术流程。

方案

注意：本方案包含适用于96孔板、8联管条和基于毛细管系统（10 µl 反应体积）的试剂体积和浓度；然而，通过相应调整所有试剂体积，HRM也可在384孔板系统中进行，反应体积为5 µl 。大多数系统的检测范围为10 pg至10 ng模板DNA。 

1. 准备模板

1. 从参与野外现场研究的患者血液中直接获取恶性疟原虫样本，样本可保存为全血、压积红细胞或滤纸片。
   注意：样本也可经培养适应以生长 体外；用于分析的一些标准实验室菌株可从疟疾研究与参考试剂资源中心（MR4）订购。样本可直接使用红细胞沉淀或培养物，或从全血、红细胞或滤纸中提取。
2. 从滤纸或培养适应菌株中提取的DNA
   注意：高分辨率熔解（HRM）对盐浓度敏感；由于提取方法不同导致的浓度差异会显著影响熔解温度。虽然特定的最终缓冲液对实验成功并非关键因素，但建议使用一种标准的常用洗脱或重悬缓冲液（即，水，1x Te [“低 Te”或“DNA 悬浮液缓冲液”：10 mM Tris-Cl，0.10 mM EDTA] 或 1x TE [10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA]，用于所有样品，以避免出现异常或不一致的熔解曲线。
   1. 制备每份10 pg–10 ng的模板稀释液 µl 在标准 Te、TE 或水中，每 10 µl 反应
3. 直接从红细胞沉淀中进行扩增
   1. 使用薄血涂片显微镜检查法测定红细胞寄生率
      注意：检测感染红细胞寄生虫血症的方法可参见美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的资料：http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html
   2. 将高于0.5%的寄生虫血症样本用PCR级水、TE或Te稀释400倍。使用3 µl 每5–10 µl 反应。
4. 对照组
   注意：高分辨率熔解曲线分析（HRM）可用于基因扫描，以检测群体中的序列变异¹²；然而，准确的基因分型需要使用经序列验证、含有目标SNP的标准品。可使用已知基因型的质粒构建体或疟原虫分离株。在大多数应用中，使用3D7（MR4 MRA-151）作为野生型对照。由于不同运行之间的变异性，每次实验均需包含阳性和阴性对照。
   1. 阳性对照：每1准备10 pg – 10 ng µl 具有序列验证的SNP基因型的质粒或标准品的稀释液。
   2. 阴性对照：在扩增反应中使用PCR级水作为无模板对照（NTC）。

2. PCR 扩增

1. 准备反应混合物
   1. （可选）矿物油覆盖层。注意：某些高分辨率熔解（HRM）系统为独立的熔解平台，在扩增过程中无加热盖以防止冷凝和产物蒸发。
      1. 在加入反应混合物前，向每孔板中加入 20 µl 轻质矿物油。
   2. 制备所有检测的 10 倍工作储备液
      1. 参见表 1，了解基于封闭探针的 HRM 基因分型推荐的 10 倍工作储备液浓度以及最终浓度。
   3. 制备反应混合物
      1. 向板或管的每个孔中加入 1 µl 10 倍工作储备液的正向和反向引物及探针，4.0 – 5.0 µl 2.5 倍或 2.0 倍 HRM 预混液，1 µl 模板，以及 PCR 级水，使总反应体积为 10 µl。
   4. 覆盖板或管
      1. 对于基于板的扩增系统使用光学板封膜，对于基于条形管的系统使用光学帽，对于基于毛细管的系统使用塑料帽。确保完全覆盖，并将板和盖完全密封固定，以防止扩增过程中的蒸发。
   5. 离心样品
      1. 以 1,800 × g 离心 3 分钟，以去除气泡；若使用矿物油，可分离油相和水相。
2. 扩增程序
   1. 将反应板或管放入热循环仪中。运行标准的封闭探针或 MAAB 扩增程序（分别为表 2 和表 3）。注意这两种方法之间退火温度的差异。

3. HRM 分析

1. 熔化
   1. PCR扩增后，进行熔解分析。对于没有内置扩增功能的独立熔解系统（例如，BioFire Defense LightScanner 系统），从PCR仪中取出扩增后的反应板并放入高分辨率熔解曲线（HRM）分析仪中。通过系统软件界面，将反应板以40–80 ℃进行熔解分析 °C 以同时产生探针和扩增子的熔解峰。
      注意：为节省熔解和分析时间，可缩短熔解程序的温度范围，仅覆盖探针或扩增子的熔解区域。熔解完成后，必要时可对板和管进行再次熔解，并于-20℃保存。 °C 或 4 °C. 仅在 4℃ 下储存玻璃管 °C 以防止试管破裂。
2. 熔解分析
   1. 去除阴性样本 
      1. 在分析软件中，剔除未扩增或熔解峰呈锯齿状的样本，不再进行后续分析。注意：选择单个运行文件的分析模式后，仪器会自动将阳性与阴性样本分组。在对每个子集进行基因分型之前，用户可手动修改判读结果。 
         1. 在熔解曲线或熔解峰视图中，右键单击需删除的曲线以选中它们。选择分类错误的样本后，进入“新建分型”，选择适当的分组，然后点击“应用更改”。
   2. 标准化
      1. 从归一化荧光对温度的负导数（–dF/dT）（“差异曲线”）视图中，移动归一化条以包围探针熔解区域。
         注意：探针熔解区域是两个熔解区域中温度较低的一个。归一化基线应位于熔解峰的底部。
   3. 计算分组 
      1. 归一化后，选择“计算分组”以自动将样本分配至各组。
         如有必要，可手动将样本重新分配至特定组别。
         注意：某些分析软件具有无法更改的高灵敏度阈值；在这种情况下，软件可能会将样本划分到与其视觉归属不同的组别中。
   4. 分配基因型
      1. 根据标准（阳性对照）为每组分配基因型。
         1. 在用户确认计算出的分组正确后（若不正确，则需在“分组”选项卡中，通过选择分类错误的样本，并从“新调用”旁边的下拉框中选择正确的组别来完成修正），点击“分组”选项卡下的“编辑组名称”。
         2. 将标准品的基因型输入对应的彩色框中（例如，若标准品3d7已知为A基因型且位于红色组，则在红色组中输入基因型A）。点击“OK”并保存结果。
   5. 导出结果
      1. 将基因型分型结果导出为电子表格，用于进一步的样本群体分析。

结果

数据可以通过多种方式可视化，具体取决于分析软件和仪器。通常，以温度为横坐标，绘制归一化荧光强度对温度的负导数（–dF/dT）曲线，是观察熔解峰和确定基因型的最直接方法。

完整的熔解曲线窗口（40°C–80°C）将同时显示扩增子和探针的熔解区域。图1展示了这两个区域归一化熔解峰的示例。将分析窗口仅设置为探针区域时，可清晰区分对应于特定SNP的峰（图2）。

基于探针的分析明确显示两个等位基因均存在，表现为独立的熔解峰，其熔解温度与纯合SNP峰相匹配（图3）。

图4显示，在扩增过程中逐步降低退火温度（MAAB）会导致对突变等位基因（左侧峰）的偏好（图4A），从而在混合等位基因群体中提高对突变等位基因的检测灵敏度（图4B）。

图1. 探针和扩增子的熔解区域。 在较宽的熔解温度范围内，绘制归一化荧光强度对温度的负导数曲线，可同时获得探针（较低温度）和扩增子的熔解峰，可用于后续分析。（改编自 Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11）请点击此处查看该图的高清版本。

图 2. 探针熔解峰。 完全匹配（通常为野生型等位基因）产生较高的熔解峰（红色），而单核苷酸多态性（SNP）错配的熔解温度较低（灰色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 多基因组熔解峰。 当样本中同时存在两个等位基因时，基于探针的高分辨率熔解（HRM）分析会呈现双峰曲线（橙色），其峰形分别与单等位基因样本（红色和灰色）相匹配。（改编自 Daniels 等，DOI: 10.1128/AAC.05737-11）请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 突变等位基因扩增偏倚（MAAB）。 A. 在多基因组或多等位基因样本中，逐步降低扩增退火温度会使熔解峰反应偏向对应于突变型（较低温度）等位基因的峰。B. MAAB使得高分辨率熔解曲线分析（HRM）能够灵敏地检测多基因组或多等位基因样本中低于1%的低频等位基因。（B部分改编自Daniels等，DOI: 10.1128/AAC.05737-11） 请点击此处查看该图的放大版本。

表1. 基于探针的高分辨率熔解扩增反应的设置。

组分	每反应体积（96孔板和毛细管）	每反应体积（384孔板）	终浓度
HRM Master Mix	4–5 µl	2-2.5 µl	1 x
10 x 过量引物	1 µl	0.5 µl	0.50 µM
10 x 另一引物	1 µl	0.5µl	0.1 µM
10x 探针	1 µl	0.5 µl	0.40 µM
PCR级水	1–2 µl	0.5-1 µl
模板DNA	1 µl	0.5 µl	0.01-10 ng/µl
	10 µl	5 µl

表2. 标准高分辨率熔解扩增条件。

温度	时间
预变性	95 °C	120 秒
45 个循环	95 °C	30 秒
	68 °C*	30 秒
1 个循环	95 °C	30 秒
	28 °C	30 秒

* 此温度取决于扩增子

表3. 突变等位基因扩增偏倚的扩增条件。

温度	时间	循环数	升温速率	采集模式	分析模式
变性	95 °C	30 sec	1	20	无	无
循环	95 °C	2 sec	55	20	无	定量分析
	56 °C*	15 sec		20	单点
熔解	40 °C	0 sec		0.3	无	无
	45 °C*	0 sec			连续	熔解曲线分析
	90 °C*	0 sec

* 此温度取决于扩增子，在进行 MAAB 时会降低

讨论

连续 HRM 是一种 PCR 后分析步骤；因此，样品和实验体系的设置与标准 PCR 方案类似，但需额外加入一种荧光嵌 intercalating 染料，用于在高分辨率熔解步骤中追踪双链 DNA 向单链 DNA 的转变。成功进行 HRM 分析最关键的要素是获得稳定的 PCR 产物。引物探针设计至关重要，目前已有多种专为 HRM 实验设计优化的工具可供商业化购买或在线使用¹³。扩增子长度为 80–150 个碱基对，并配合使用约 20 个碱基对、覆盖目标 SNP 或多个 SNP 位点的封闭探针，最有利于区分单个 SNP 以及探针区域内的多个 SNP 单倍型。探针可通过在 3’端添加 C3 间隔基团或引入 2 个碱基对的错配来实现封闭，从而防止在扩增过程中发生延伸。探针可设计为与 Watson 链或 Crick 链模板互补；具体选择需通过实验验证，以确定哪种探针设计可产生理想的熔解峰。使用过量的正向或反向引物可生成单链扩增产物，使其与封闭探针退火结合。若探针序列与正向链一致，则使用过量的反向引物，通常比例为 1:5；反之，若探针匹配反向链，则使用过量的正向引物。

同样，高分辨率熔解曲线分析（HRM）在具有足够且强健的PCR产物时效果最佳。PCR反应的优化需要通过梯度PCR以及琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer分析，以确定最佳退火温度。模板浓度可通过预扩增等方法提高，例如使用较低的引物浓度和较少的循环次数对所有靶标进行偏向性多重扩增，从而增加模板浓度¹³。

仅有少数仪器适用于MAAB。这些系统中所用玻璃毛细管的热学特性有利于该方法的实施。毛细管较小的内径以及玻璃材料快速的热传导，相较于标准PCR塑料耗材，能够实现更严格的温度控制；由于塑料具有隔热性能，其在退火和变性循环之间的温度转换速率较慢。采用该方法，可在野生型与突变型等位基因的混合物中将突变等位基因的检测灵敏度从2-5%降低至低于1%¹⁰。

高分辨率熔解曲线分析（HRM）是一种简便、高效且经济的单核苷酸多态性（SNP）分型工具，适用于多种场景和广泛应用，从传染病监测到癌症基因变异的筛查均可使用。其他一些仪器，如Roche Nano和LightCycler系统（480和96型）以及Eco实时PCR系统，除了具备标准扩增、实时检测和拷贝数分析功能外，也提供HRM功能。使用高通量设备时，我们实验室测得的HRM条形码检测成本每反应低于0.50美元，包含所有试剂和耗材。

在本文所述背景下，基于现场的应用可实现实时种群监测，以发现与疟疾防控工作相关的种群变化，包括种群多样性下降、输入性寄生虫类型的检出，以及与药物敏感性降低相关的单核苷酸多态性（SNP）的出现和传播。对该方法的优化进一步提高了灵敏度，有助于评估疟疾消除和根除工作的进展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LightScanner 主混合液	BioFire Defense	HRLS-ASY-0003
轻质矿物油	Sigma	M5904	用于 BioFire Defense 基于板的高分辨率熔解（HRM）系统
TE	Teknova	T0226
Te	Teknova	T0221	含低浓度 EDTA 的 TE 缓冲液
PCR 级水	Teknova	W3330
恶性疟原虫标准品	MR4	MRA-151, 156, 205, 330	MR4.org 提供免费的基因组 DNA
Light Scanner 引物设计软件	BioFire Defense		用于 HRM 检测设计的商业软件
LightCycler 480 高分辨率熔解主混合液	Roche	4909631001	适用于 LightCycler-480、-96 和 nano 仪器，浓度为 2×
生物分析仪	Agilent	G2938A	Agilent 2100 生物分析仪
LightCycler 2.0	Roche	3531414001	基于毛细管的 MAAB 系统
LightCycler Nano	Roche	6407773001	基于条形管的 HRM 和扩增系统
LightCycler 96	Roche	5815916001	基于条形管和板的 HRM 及扩增系统
LightCycler 480	Roche	5015278001	基于板的 HRM（96 孔和 384 孔板）及扩增系统
LightScanner-96	BioFire Defense	LSCN-ASY-0011	基于板的 HRM（96 孔）
LightScanner-384	BioFire Defense	LSCN-ASY-0001	基于板的 HRM（96 孔）
96 孔板	Roche	4729692001	用于 HRM 的 96 孔板（LightCycler）
384 孔板	Roche	4729749001	用于 HRM 的 384 孔板（LightCycler）
96 孔板	Bio-Rad	HSP-9665	用于 HRM 的 96 孔板（LightScanner）
384 孔板	Bio-Rad	HSP-3865	用于 HRM 的 384 孔板（LightScanner）
LightCycler 8 管联排（透明）	Roche	6327672001	用于 HRM 的联排管（LightCycler 96 和 LightCycler Nano）
LightCycler 毛细管（20 μl）	Roche	4929292001	用于 HRM 的毛细管
光学板封膜	Roche	4729757001	其他品牌也可使用