利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

摘要

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。

摘要

本方案描述了一种无需对细胞进行同步化即可追踪细胞周期进程的方法。对于许多细胞体系而言，实现细胞同步化具有挑战性。常规做法是在细胞周期的特定阶段阻断其进程，随后释放被累积的细胞，从而产生一批同步推进的细胞群体。然而，某些细胞类型对这种阻断具有毒性反应，可能导致细胞周期异常甚至大量死亡。溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法可用于追踪单个细胞所处的细胞周期阶段。在S期合成新DNA时，细胞会将这种合成的胸苷类似物BrdU整合入DNA中。通过短暂提供BrdU，可以标记出在BrdU存在期间正处于S期的一群细胞。随后可追踪这些细胞完成后续细胞周期进程并进入下一轮DNA复制，从而在无需施加潜在毒性细胞周期阻断的情况下，确定各细胞周期时相的持续时间。此外，还可检测并关联细胞周期后续各阶段中细胞内外蛋白的表达情况。这些信息可用于进一步精确判定细胞所处的周期阶段，或评估对其他细胞功能（如检查点激活或细胞死亡）的影响。

引言

评估细胞周期进程中细胞所表现出的特征及其变化，对于理解生物学的诸多方面（尤其是癌症生物学）至关重要。目前许多处于研发阶段的恶性肿瘤治疗药物，对细胞周期进程具有显著影响，或通过依赖细胞周期的机制诱导细胞死亡。为了研究细胞周期动态或处于细胞周期特定阶段的细胞，通常需要对细胞进行同步化处理。然而，同步化方法可能对被研究细胞产生不利影响，从而潜在地干扰实验结果。¹ 近年来，利用仅在细胞周期特定阶段存在的荧光标记蛋白，已可实现随时间对单个细胞的细胞周期进程进行分析²，但该方法需要对细胞进行遗传操作以表达这些标记蛋白，因此其应用仅限于易于实现此类操作的实验体系。

细胞周期包含两个活跃阶段：合成（S）期，在此期间DNA进行复制；以及有丝分裂（M）期，在此期间发生细胞分裂。这两个阶段之间由三个间隙期（G₀、G₁和G₂）分隔。G₀期又称静息期，是细胞退出细胞周期后的休止状态；G₁期是细胞在DNA复制前体积增大的阶段；G₂期则是DNA复制完成后、细胞分裂开始前继续生长的阶段。细胞周期的进程受到多个检查点的调控。当环境条件不利于DNA合成时，G₁检查点被激活，阻止细胞进入S期。S期内部检查点或延迟机制可由DNA损伤触发，此类损伤可能导致复制叉停滞。在G₂期，细胞会确认复制后的DNA....

方案

本方案采用急性淋巴细胞白血病细胞系 NALM6，但也可应用于其他细胞类型。

1. 溶液与试剂

1. 完全 RPMI 培养基
   1. 向 500 ml 的 RPMI-1640 培养基中加入 56 ml 胎牛血清（FCS）和 5.5 ml 的 200 mM L-谷氨酰胺。
2. BrdU 储存液
   1. 在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制 32.5 mM BrdU（10 mg/ml）。
3. 含 BrdU 的完全 RPMI 培养基
   1. 将 6.2 µl BrdU 储存液加入 10 ml 完全 RPMI 培养基中。
4. DNase 溶液
   1. 在 DPBS 中配制 1 mg/ml 的 DNase 溶液。
5. 染色缓冲液
   1. 在 DPBS 中配制含 3% 热灭活 FCS 和 0.09% 叠氮化钠的染色缓冲液。
6. 固定缓冲液、通透缓冲液和洗涤缓冲液的定义请参见材料列表。

2. 细胞

注意：细胞培养时间不超过6个月。本方法可直接适用于任何非贴壁细....

结果

该方法可用于获取多种信息，此处概述了几个应用实例。

细胞周期持续时间的评估

为确定细胞通过细胞周期所需的时间，在溴脱氧尿苷（BrdU）脉冲标记后不同时间点收集细胞。评估的时间间隔可根据所分析的特定细胞类型进行调整。在未添加任何药物处理的条件下，对造血细胞系在24小时内每小时进行一次检测，以确定标准培养条件下细胞周期各时相的持续时间。 图2 展示了在24小时期间对NALM6细胞进行的一系列快照分析。在BrdU脉冲时处于S期的细胞（即 在 BrdU 阳性门控范围内 图1) 进入 G 期₂/M，细胞周期该时相的细胞比例在BrdU脉冲后10小时达到峰值。S期中BrdU标记细胞的比例在脉冲后14小时降至最低，几乎所有细胞均已重新进入G₁ 17小时后。到24小时时，部分BrdU标记的细胞已重新进入S期，作为其下一个细胞周期的一部分，表明这些细胞可在24小时内完成一个细胞周期；然而，大多数细胞尚未进入第二轮复制，.......

讨论

分析细胞周期的能力对于理解癌症生物学以及影响细胞增殖和生长的药物与基因的作用机制至关重要。尽管已有多种据称可测量细胞增殖的检测方法，但大多数方法仅能提供反映细胞数量的指标。这些方法包括通过直接显微观察和计数、代谢活性或ATP浓度来测定细胞数量。这些方法的主要优势在于操作相对简便，适用于微孔板格式并可实现自动化，因此适用于大量条件或化合物的筛选。然而，这些方法的不足之处在于未考虑因细胞死亡导致的细胞丢失，可能导致对细胞增殖程度的低估。此外，这些方法检测的是细胞群体的整体情况，无法用于单个细胞的研究，也无法追踪细胞在细胞周期中的进程。

在常用的增殖检测方法中，可能最可靠且准确的是那些测量DNA合成的方法。传统的细胞增殖检测通常将细胞与³H-胸腺嘧啶共同孵育数小时至过夜，后者会被整合到新合成的DNA中¹³。该方法明显的问题是使用了放射性物质，另一个局限性在于结果仅反映细胞群体的平均增殖水平。BrdU可在避免辐射问题的情况下实现类似应用，尽管需要额外的实验步骤，且BrdU本身具有潜在的致突变性。然而，BrdU的优势在于可与流式细胞术兼容，从而实现.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC BrdU 流式检测试剂盒	BD Biosciences	552598	包含 BrdU 抗体、7-AAD 和 BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液（称为固定缓冲液）
BD Cytoperm 增强通透缓冲液 Plus	BD Biosciences	561651	称为通透缓冲液
BD Perm/Wash 缓冲液	BD Biosciences	554723	称为洗涤缓冲液
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS 管	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen 染色缓冲液	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA 流式细胞仪	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1640 不含 L-谷氨酰胺 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
胎牛血清	FisherBiotec	FBS-7100113
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513-100ML
5-溴-2′-脱氧尿苷	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 透气培养瓶	BD Biosciences	355001
移液管 25 ml	Greiner	760180
气溶胶移液器 200 µl	Interpath	24700
气溶胶移液器 1 ml	Interpath	24800
离心机	Spintron	GT-175R
CO2 培养箱	Binder	C 150
AF488 抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10）抗体	Cell Signalling	9708S
磷酸化 Chk2（Thr68）(C13C1) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2197S
磷酸化 Chk1（Ser345）(133D3) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128