细胞周期进程的时间跟踪使用流式细胞仪，无需同步

Summary

这个协议描述了使用溴脱氧尿苷（BrdU）标记的摄取，以允许细胞是在S期在时间上的特定点的时间的跟踪。此外DNA染料和抗体标记的方便了S期细胞的命运在稍后时间详细分析。

Abstract

该协议描述了一种方法，该方法允许在细胞周期中跟踪细胞，而无需细胞同步。对于许多细胞系统来说，实现细胞同步可能很困难。标准做法是在特定阶段阻断细胞周期进程，然后释放积累的细胞，产生一波细胞，一致地通过周期。然而，一些细胞类型发现这种阻断有毒，导致细胞周期异常，甚至大规模死亡。溴脱氧尿嘧啶 （BrdU） 摄取可用于跟踪单个细胞的细胞周期阶段。细胞掺入这种合成的胸苷类似物，同时在 S 期合成新的 DNA。通过提供短时间的 BrdU，可以在 BrdU 存在时标记处于 S 期的细胞池。然后，可以在细胞周期的剩余时间内跟踪这些细胞，并进入下一轮复制，从而可以确定细胞周期阶段的持续时间，而无需诱导具有潜在毒性的细胞周期阻滞。还可以确定和关联细胞周期后续阶段内部和外部蛋白质的表达。这些可用于进一步细化细胞周期阶段的分配或评估对其他细胞功能（如检查点激活或细胞死亡）的影响。

Introduction

的细胞周期功能和发生在细胞的变化过程中的细胞周期进展的评估是基本理解生物学，特别是癌症生物学的许多方面。在发展为恶性肿瘤的治疗许多药物对细胞周期进程产生深远的影响，或通过细胞周期依赖性机制诱导细胞死亡。为了研究细胞周期动力学或细胞在细胞周期的特定阶段中，通常以同步的细胞。然而同步方法可以对细胞有害作用被研究，有可能混淆的结果^。1在单细胞随时间的细胞周期进程的最新的使用荧光标记的蛋白质，是只存在于细胞周期的特定阶段的已批准的分析^2，但是所述细胞进行研究需要被遗传操纵以表达这些标记的蛋白质，限制了其使用的地方这可以读取系统容易完成。

细胞周期包括两个活性阶段:合成（S）相，其中，DNA复制和有丝分裂（M），其中，细胞分裂发生。这些阶段由三个间隙相，G _{0，G 1}和G ₂分开。 _ģ0或静止，是其中细胞已离开循环的休止阶段中，G ₁是其中细胞大小之前的DNA复制和G _2，其中的DNA复制的完成之间但细胞分裂前的细胞生长继续增加。通过细胞周期的进展是由多个检查站的控制。当环境条件不支持DNA合成和防止进入S期对G ₁检查点被激活。内-S期检查点或延迟可以通过DNA损伤可能会导致复制叉停滞了被触发。期间克_2-复制的DNA的保真度被确认，并且如果检测到损坏那G ₂ ....

Protocol

这里所描述的协议使用的急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6但可以适用于其他类型的细胞。

1.解决方案和试剂

1. 完全RPMI
   1. 添加56毫升胎牛血清（FCS）和毫升的200mM 5.5 L-谷氨酰胺至500毫升瓶的RPMI-1640培养基。
2. BrdU的库存解决方案
   1. 在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）制备32.5毫BrdU的（10毫克/毫升）。
3. 尿嘧啶完全RPMI
   1. 加入6.2微升的BrdU原液中加入10毫升完全RPMI中。
4. DNA酶解决方案
   1. 制备1毫克DNA酶/ ml，在DPBS。
5. 染色缓冲液
   1. 制备3％热灭活的FCS和0.09％叠氮化钠在DPBS中。
6. 请参阅材料清单固定缓冲液，透化缓冲液和洗涤液的定义。

2.细胞

没有德:将细胞未培养大于6个月。这种方法是直接适用于与调整细胞密度和培养介质中的任何非粘附细胞系。使用的增长指数在实验开始细胞。

1. 保持NALM6细胞在完全RPMI T-75培养瓶中。执行使用Ⅱ级生物安全柜无菌条件下的所有步骤。

Results

这个方法可以用于获得信息的范围。一些应用程序在这里列出。

细胞周期的持续时间的评估

为了确定通过细胞周期所需的细胞过境时间，将细胞收获在以下的BrdU的脉冲不同的时间点。评估之间的时间间隔，可以适应于特定的细胞被分析。造血细胞系进行了评估每小时超过在不存在任何药物治疗，以确定细胞周期阶段标准培养条件下的长度的24小时期间， 图2示出了一个选择NALM6细胞在24小时内的快照的分析。将细胞在所述的BrdU脉冲（ 即内图1中的BrdU阳性栅极）时S期进展至G ₂ / M期，随着细胞在细胞周期被的相的峰值检测10小时的BrdU的p后ulse。脉冲后，S期的BrdU标记细胞的比例达到了最低点14小时，几乎所有的细胞都17小时后返回至G _1。通过24小时的BrdU阳性细胞的比例已重新进入S期作为其下一个细胞周期的一部分，指示细胞可以内完成24小时的细胞周期，但是大多数还没有进入第二轮的复制，与已知的36一致小时.......

Discussion

分析细胞周期的能力，对于癌症生物学的理解和两种药物和基因影响细胞增殖和生长的作用机制重要。虽然有许多测定法，据说测量细胞增殖的，多数只提供的量度指示的数目的细胞存在。这些包括测量通过直接可视化和计数，代谢活性或ATP浓度细胞数测定。许多这些方法的主要优点是，它们相对容易地进行，并适合于微孔板格式和自动化，使它们可用于筛选大量的条件或化合物。许多这些方法的缺点是，由于死亡的细胞损失不考虑，可能导致细胞增殖的低估。此外，这些方法测量的体积人口和不允许单个细胞的研究或细胞通过中转细胞周期。

常用的增殖测定，也许是最可靠和准确的是那些测量DNA的合成。传统的细胞增殖测定孵育细胞为几个小时至过夜用³ H-胸苷，其被掺入新合成的^DNA。13这一方法的明显的问题是利用放射性材料，但另一个限制是，该结果测量平均细胞群的增殖。的BrdU同样可以使用未经辐射的问题，虽然还需要一些步骤和BrdU是一个潜在的致变物。然而，BrdU的具有可与流兼容术，允许单个细胞的分析的优点^。14其他流式细胞兼容的方法来评估细胞增殖，在单细胞水平包括越来越多.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU 流式试剂盒	BD Biosciences 552598		包含 BrdU 抗体、7-AAD 和 BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液（称为固定缓冲液）
BD Cytoperm 透化缓冲液加	BD Biosciences	561651	称为透化缓冲液
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	称为洗涤缓冲液
DNase	Sigma	D-4513
BD 猎鹰 12 x 75 mm FACS管	BD Biosciences 352008
BD Pharmingen染色缓冲液	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA流式细胞仪	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2， P20， P100， P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
牛血清	FisherBiotec	FBS-7100113
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513-100ML
5-溴-2′-脱氧尿嘧啶	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 通气培养瓶	BD Biosciences	355001
移液器 25 ml	Greiner	760180
Aersol 移液器 200 &微;l	Interpath	24700
Aersol 移液器 1 ml	Interpath	24800
离心	Spintron	GT-175R
CO2 培养箱	结合	C 150
AF488 抗组蛋白 H3 磷酸化 （Ser10） 抗体	信号传导	9708S
磷酸化 CHK2 （Thr68） （C13C1） 兔单克隆抗体	细胞信号传导	2197S
磷酸化 CHK1 （Ser345） （133D3） 兔单克隆抗体	细胞信号转导	2348S
NALM6	帝斯曼	ACC-128