重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质,用于组织工程应用。例如,可设计人工细胞外基质蛋白,使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。
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重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质,用于组织工程应用。例如,可设计人工细胞外基质蛋白,使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。
重组技术是一种多功能平台,可用于创建具有可调控特性的新型人工蛋白质。近十年来,许多人工蛋白质已整合了源自自然界的功能结构域(或人工设计的结构域) 从头合成已有相关报道。特别是,人工细胞外基质(aECM)蛋白已被开发出来;这些aECM蛋白由来自纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白的生物功能域组成,并与包括弹性蛋白样重复序列、丝素蛋白和胶原重复序列在内的结构域相结合。迄今为止,aECM蛋白已在组织工程和伤口修复领域得到广泛研究。最近,Tjin及其同事开发了针对促进人皮肤角质形成细胞黏附与增殖的整合素特异性aECM蛋白。在该研究中,aECM蛋白整合了来自纤连蛋白、层粘连蛋白-5和IV型胶原蛋白的细胞结合域,并两侧连接弹性蛋白样重复序列。他们证明,所开发的aECM蛋白作为人工皮肤基质具有良好的应用前景。本文概述了此类aECM蛋白的设计与构建方法,以及利用弹性蛋白的温度响应特性进行纯化的流程。
几十年来,研究人员一直在探索将合成材料和天然材料用作组织工程中的支架1,2。尽管聚合物等合成材料具有优异的结构完整性和可调节的力学性能,但其生物活性往往不足,难以促进组织的生长和浸润。另一方面,细胞外基质(ECM)蛋白等天然材料虽具有良好的生物活性,却存在批次间差异大、降解过快以及免疫原性等问题。因此,人们希望采用重组蛋白,因为其可被设计为仅模拟天然蛋白中的理想特性3,4。
重组蛋白工程作为一种多功能平台,广泛应用于新型人工蛋白生物聚合物的设计与生产,已引起广泛关注。通过控制基因序列,可针对多种应用定制人工蛋白的功能5,6。特别是人工细胞外基质(aECM)蛋白,可被设计为具有多种功能,适用于组织工程、再生医学和伤口修复等领域2,7。更重要的是,克隆与纯化技术的进步显著提高了重组蛋白生产的可扩展性,并大幅降低了制造成本。目前已有可能以较低的生产成本大量生产重组蛋白,使其在临床应用中具备经济可行性5。
人工细胞外基质蛋白已开发用于组织工程应用8-11例如,Tirrell 等 设计了一种使用含纤连蛋白CS5序列和类弹性蛋白重复序列(ELP-CS5)的人工蛋白制备的小直径血管移植物。他们证明了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)能够在这些材料上黏附并生长12其他研究者还引入了来自纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原和玻璃粘连蛋白的短生物活性序列,以及模拟弹性蛋白、蜘蛛丝和胶原蛋白的结构域,以构建多种融合蛋白10由基于弹性蛋白的aECM蛋白制成的块状交联薄膜也表现出与天然弹性蛋白相似的力学性能(弹性模量范围为0.3–0.6 MPa)。13随后,有研究报道含较长纤连蛋白片段的aECM蛋白也能加速伤口愈合。 体外 由于整合素结合亲和力增加8.
最近,Tjin 及其同事开发出了针对整合素的特异性人工细胞外基质(aECM)蛋白14。每种 aECM 蛋白均包含一个来自天然人皮肤细胞外基质成分的生物活性细胞结合结构域2,7,15,例如层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白和纤连蛋白。例如,已有研究表明,整合素 α3Β1 可结合位于层粘连蛋白-5 α-3 链球状结构域 3(LG3)中的 PPFLMLLKGSTR 序列16,17。在该研究报告中,作者发现,原代人皮肤表皮角质形成细胞会根据 aECM 蛋白中所含细胞结合结构域的类型,优先通过不同的整合素与之结合。
Tjin 的研究中讨论的 aECM 蛋白 等 含有侧翼的弹性蛋白样结构域{(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 赋予材料弹性,以模拟人类皮肤的力学特性。此外,在类弹性蛋白重复序列中引入赖氨酸残基还可提高蛋白质在水相溶剂中的整体溶解度。同时,赖氨酸残基还可作为交联位点,促进交联的aECM薄膜的形成12在aECM蛋白序列中加入弹性蛋白样重复序列,可使这些蛋白通过逆向相变循环(ITC)实现快速纯化。14弹性蛋白在特定温度下会发生急剧且可逆的相变,该温度被称为低临界溶解温度(LCST)或逆相变温度(Tt)18-20弹性蛋白和类弹性蛋白重复序列在低于其低临界溶解温度(LCST)时呈现亲水性无规卷曲构象,并可溶于水;而在高于其LCST时,弹性蛋白迅速聚集形成微米级颗粒。此类相变过程具有可逆性,因此可利用等温浊点(ITC)技术实现基于弹性蛋白的aECM蛋白的快速纯化。21.
本研究报道了一种通用方法,用于设计、构建和纯化含生物活性细胞结合结构域并融合了弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质(aECM)蛋白。文中描述了设计和克隆编码aECM蛋白氨基酸序列的质粒的过程,概述了利用等温浊点法(ITC)纯化aECM蛋白的步骤,最后讨论了通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法(Western Blotting)检测所获得aECM蛋白纯度的方法。
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1.克隆重组质粒编码AECM蛋白质
2。改造重组质粒的细菌进入宿主表达
蛋白质AECM 3.细菌表达
4.裂解细菌培养
5. AECM纯化的蛋白质的逆转变自行车
AECM蛋白6.表征使用的SDS-PAGE电泳
AECM蛋白7.使用表征免疫印迹
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在设计包含弹性蛋白样重复融合蛋白,它维持一个整体弹性内容中,融合蛋白18的足够大的部分是很重要的。这是为了确保该融合蛋白构建体保留其弹性蛋白样特征,以便使用ITC进行纯化。的AECM蛋白质设计和本节中所述的序列被明确取自工作由Tjin 等人14。在这项工作中,三AECM蛋白被成功地克隆到pET22b(+)表达载体。连续结扎首先开始与结扎弹力重复插入到pET载体,随后通过将细胞结合区。最后,最后一组弹性重复通过使用相同的方法插入到细胞结合结构域的末端。为了验证该重组基因构建成功,各重组质粒试验,在37℃用XhoⅠ和Sal 3小时C. 图1示出该DNA插入物和载体带中的测试消化后。对于每个AECM蛋白,插入件的尺寸对应于基因的大小,证实了克隆确实是成功的。通过DNA测序进一步核实也证实了测试结果的消化。
我们能够净化通过ITC给出存在于每个AECM蛋白足够 弹力含量AECM蛋白质。 图2示出了整个纯化过程的示意图。在O / N培养物接种于1升摇瓶具有典型...
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重组蛋白质工程是一种通用的技术来创建使用自下而上的方法新的蛋白质材料。的基于蛋白质的材料可根据感兴趣的应用被设计成具有多种功能,量身定做。由于增加的进步中克隆和表达的技术,它已成为比较简单(和成本有效),以在一个可再现的和可扩展的方式创建各种人造蛋白质。弹性蛋白样结构域已在许多人造蛋白质被结合,以用作纯化标记,以及赋予机械性能。包含弹性蛋白样序列的人工蛋白可以使用ITC的,从而消除了对昂贵的纯化柱和抗体可以容易地纯化。
本协议描述的步骤,构建了AECM编码蛋白质的重组质粒。基因的弹性蛋白样重复编码被购买。为像弹性样多肽高度重复的肽序列,则建议设计的克隆策略,使得递归定向连接(RDL)的策略可用于22。通过使用RDL,重复的多肽具有特定链长度都可以人工合成,因此目的基因可以购买短单体。
在我们的工作中,所述细胞结合结构域被设计成含有侧翼NheI位的限制位点上的两端,以使中央的细胞结合结构域的模块式交换。选择限制性位点是独特的,并且不存在于功能结构域或其他地方以外的宿主载体的多克隆位点(MCS)是很重要的...
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作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。
作者想感谢来自教育部ACRF一级(RG41)资金和南洋理工大学启动补助。低,Tjin由研究学生奖学金(RSS)南洋理工大学,新加坡资。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | 含氨苄青霉素抗性的T7表达载体 |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | 额外抗生素——氯霉素 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 用去离子水配制1 M储存液,诱导前新鲜配制。 |
| QIAprep Spin Miniprep试剂盒 | Qiagen | 27106 | 质粒提取试剂盒 |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| 氨苄青霉素 | Affymetrix | 11259 | |
| 氯霉素 | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™凝胶DNA回收试剂盒 | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold菌株 | Agilent Technologies | 200315 |
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