重组技术使材料设计人员能够为组织工程应用创造具有定制功能的新型人工蛋白质。例如，人工细胞外基质蛋白可以设计为掺入源自天然 ECM 的结构和生物结构域。在这里，我们描述了含有弹性蛋白样重复序列的 aECM 蛋白的构建和纯化。
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重组技术使材料设计人员能够为组织工程应用创造具有定制功能的新型人工蛋白质。例如，人工细胞外基质蛋白可以设计为掺入源自天然 ECM 的结构和生物结构域。在这里，我们描述了含有弹性蛋白样重复序列的 aECM 蛋白的构建和纯化。
重组技术是一种多功能平台，用于创建具有可调特性的新型人工蛋白。在过去的十年中，已经报道了许多包含源自自然界（或从头创造）的功能域的人工蛋白质。特别是，已经开发了人工细胞外基质 （aECM） 蛋白;这些 aECM 蛋白由取自纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白的生物结构域组成，并与结构结构域相结合，包括弹性蛋白样重复序列、丝状重复序列和胶原蛋白重复序列。迄今为止，aECM 蛋白在组织工程和伤口修复中的应用已得到广泛研究。最近，Tjin 及其同事开发了整合素特异性 aECM 蛋白，旨在促进人类皮肤角质形成细胞的附着和繁殖。在他们的工作中，aECM 蛋白包含取自纤连蛋白、层粘连蛋白-5 和胶原蛋白 IV 的细胞结合结构域，以及侧翼弹性蛋白样重复序列。他们证明，在他们的工作中开发的 aECM 蛋白是用作人造皮肤底物的有希望的候选者。在这里，我们概述了这种 aECM 蛋白的设计和构建以及它们利用弹性蛋白的热响应特性的纯化过程。
几十年来，合成和天然材料都被探索用作组织工程中的支架1,2。虽然聚合物等合成材料具有出色的结构完整性和可调机械性能，但它们的生物活性通常不足，无法促进组织的生长和浸润。另一方面，细胞外基质 （ECM） 蛋白等天然材料具有出色的生物活性，但存在批次间差异、快速降解和免疫原性问题等局限性。因此，需要重组蛋白，因为它们可以设计为仅模拟天然蛋白的理想特性3,4。
重组蛋白工程作为新型人工蛋白生物聚合物设计和生产的多功能平台，引起了广泛的兴趣。通过控制基因序列，可以针对各种应用定制人工蛋白质的功能5,6。特别是，人工细胞外基质 （aECM） 蛋白可以定制为具有多种功能，适用于组织工程、再生和伤口修复2,7。更重要的是，克隆和纯化技术的进步提高了可扩展性，并大大降低了重组蛋白的制造成本。可以以较低的生产成本生产大量重组蛋白，这对于临床使用来说是经济的5。
人工细胞外基质蛋白已被开发用于组织工程应用8-11。例如，Tirrell 等人使用含有纤连蛋白 CS5 序列和弹性蛋白样重复序列 （ELP-CS5） 的人工蛋白质设计了一种小直径血管移植物。他们表明，人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 能够在这些材料上粘附和生长12。其他研究还掺入了取自纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋....
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1.克隆重组质粒编码AECM蛋白质
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在设计包含弹性蛋白样重复融合蛋白，它维持一个整体弹性内容中，融合蛋白18的足够大的部分是很重要的。这是为了确保该融合蛋白构建体保留其弹性蛋白样特征，以便使用ITC进行纯化。的AECM蛋白质设计和本节中所述的序列被明确取自工作由Tjin 等人14。在这项工作中，三AECM蛋白被成功地克隆到pET22b（+）表达载体。连续结扎首先开始与结扎弹力重复插入到pET载体，随后通过将细胞结合区。最后，最后一组弹性重复通过使用相同的方法插入到细胞结合结构域的末端。为了验证该重组基因构建成功，各重组质粒试验，在37℃用XhoⅠ和Sal 3小时C. 图1示出该DNA插入物和载体带中的测试消化后。对于每个AECM蛋白，插入件的尺寸对应于基因的大小，证实了克隆确实是成功的。通过DNA测序进一步核实也证实了测试结果的消化。
我们能够净化通过ITC给出存在于每个AECM蛋白足够 弹力含量AECM蛋白质。 图2示出了整个纯化过程的示意图。在O / N培养物接种于1升摇瓶具有典型.......
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重组蛋白质工程是一种通用的技术来创建使用自下而上的方法新的蛋白质材料。的基于蛋白质的材料可根据感兴趣的应用被设计成具有多种功能，量身定做。由于增加的进步中克隆和表达的技术，它已成为比较简单（和成本有效），以在一个可再现的和可扩展的方式创建各种人造蛋白质。弹性蛋白样结构域已在许多人造蛋白质被结合，以用作纯化标记，以及赋予机械性能。包含弹性蛋白样序列的人工蛋白可以使用ITC的，从而消除了对昂贵的纯化柱和抗体可以容易地纯化。
本协议描述的步骤，构建了AECM编码蛋白质的重组质粒。基因的弹性蛋白样重复编码被购买。为像弹性样多肽高度重复的肽序列，则建议设计的克隆策略，使得递归定向连接（RDL）的策略可用于22。通过使用RDL，重复的多肽具有特定链长度都可以人工合成，因此目的基因可以购买短单体。
在我们的工作中，所述细胞结合结构域被设计成含有侧翼NheI位的限制位点上的两端，以使中央的细胞结合结构域的模块式交换。选择限制性位点是独特的，并且不存在于功能结构域或其他地方以外的宿主载体的多克隆位点（MCS）是很重要的.......
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作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
作者想感谢来自教育部ACRF一级（RG41）资金和南洋理工大学启动补助。低，Tjin由研究学生奖学金（RSS）南洋理工大学，新加坡资。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pET22b （+） | Novagen | 69744 | T7 表达载体，对氨苄青霉素具有抗性 |
| BL21（DE3）pLysS | Invitrogen | C6060-03 | 其他抗生素 - 氯霉素 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG） | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M 储备溶液与高压灭菌水，诱导前新鲜制备。 |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | 质粒分离试剂盒 |
| T4 连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| 氨苄青霉素 | Affymetrix | 11259 | |
| 氯霉素 | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ 凝胶 DNA 回收试剂盒 | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold 菌株 | 安捷伦科技 | 200315 |
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