重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质,用于组织工程应用。例如,可设计人工细胞外基质蛋白,使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。
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重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质,用于组织工程应用。例如,可设计人工细胞外基质蛋白,使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。
重组技术是一种多功能平台,可用于创建具有可调控特性的新型人工蛋白质。近十年来,许多人工蛋白质已整合了源自自然界的功能结构域(或人工设计的结构域) 从头合成已有相关报道。特别是,人工细胞外基质(aECM)蛋白已被开发出来;这些aECM蛋白由来自纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白的生物功能域组成,并与包括弹性蛋白样重复序列、丝素蛋白和胶原重复序列在内的结构域相结合。迄今为止,aECM蛋白已在组织工程和伤口修复领域得到广泛研究。最近,Tjin及其同事开发了针对促进人皮肤角质形成细胞黏附与增殖的整合素特异性aECM蛋白。在该研究中,aECM蛋白整合了来自纤连蛋白、层粘连蛋白-5和IV型胶原蛋白的细胞结合域,并两侧连接弹性蛋白样重复序列。他们证明,所开发的aECM蛋白作为人工皮肤基质具有良好的应用前景。本文概述了此类aECM蛋白的设计与构建方法,以及利用弹性蛋白的温度响应特性进行纯化的流程。
几十年来,研究人员一直在探索将合成材料和天然材料用作组织工程中的支架1,2。尽管聚合物等合成材料具有优异的结构完整性和可调节的力学性能,但其生物活性往往不足,难以促进组织的生长和浸润。另一方面,细胞外基质(ECM)蛋白等天然材料虽具有良好的生物活性,却存在批次间差异大、降解过快以及免疫原性等问题。因此,人们希望采用重组蛋白,因为其可被设计为仅模拟天然蛋白中的理想特性3,4。
重组蛋白工程作为一种多功能平台,广泛应用于新型人工蛋白生物聚合物的设计与生产,已引起广泛关注。通过控制基因序列,可针对多种应用定制人工蛋白的功能5,6。特别是人工细胞外基质(aECM)蛋白,可被设计为具有多种功能,适用于组织工程、再生医学和伤口修复等领域2,7。更重要的是,克隆与纯化技术的进步显著提高了重组蛋白生产的可扩展性,并大幅降低了制造成本。目前已有可能以较低的生产成本大量生产重组蛋白,使其在临床应用中具备经济可行性5。
人工细胞外基质蛋白已开发用于组织工程应用8-11例如,Tirrell 等 设计了一种使用含纤连蛋白CS5序列和类弹性蛋白重复序列(ELP-CS5)的人工蛋白制备的小直径血管移植物。他们证明了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)能够在这些材料上黏附并生长12其他研究者还引入了来自纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原和玻璃粘连蛋白的短生物活性序列,以及模拟弹性蛋白、蜘蛛丝和胶原蛋白的结构域,以构建多种融合蛋白10由基于弹性蛋白的aECM蛋白制成的块状交联薄膜也表现出与天然弹性蛋白相似的力学性能(弹性模量范围为0.3–0.6 MPa)。13随后,有研究报道含较长纤连蛋白片段的aECM蛋白也能加速伤口愈合。 体外 由于整合素结合亲和力增加8.
最近,Tjin 及其同事开发出了针对整合素的特异性人工细胞外基质(aECM)蛋白14。每种 aECM 蛋白均包含一个来自天然人皮肤细胞外基质成分的生物活性细胞结合结构域2,7,15,例如层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白和纤连蛋白。例如,已有研究表明,整合素 α3Β1 可结合位于层粘连蛋白-5 α-3 链球状结构域 3(LG3)中的 PPFLMLLKGSTR 序列16,17。在该研究报告中,作者发现,原代人皮肤表皮角质形成细胞会根据 aECM 蛋白中所含细胞结合结构域的类型,优先通过不同的整合素与之结合。
Tjin 的研究中讨论的 aECM 蛋白 等 含有侧翼的弹性蛋白样结构域{(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 赋予材料弹性,以模拟人类皮肤的力学特性。此外,在类弹性蛋白重复序列中引入赖氨酸残基还可提高蛋白质在水相溶剂中的整体溶解度。同时,赖氨酸残基还可作为交联位点,促进交联的aECM薄膜的形成12在aECM蛋白序列中加入弹性蛋白样重复序列,可使这些蛋白通过逆向相变循环(ITC)实现快速纯化。14弹性蛋白在特定温度下会发生急剧且可逆的相变,该温度被称为低临界溶解温度(LCST)或逆相变温度(Tt)18-20弹性蛋白和类弹性蛋白重复序列在低于其低临界溶解温度(LCST)时呈现亲水性无规卷曲构象,并可溶于水;而在高于其LCST时,弹性蛋白迅速聚集形成微米级颗粒。此类相变过程具有可逆性,因此可利用等温浊点(ITC)技术实现基于弹性蛋白的aECM蛋白的快速纯化。21.
本研究报道了一种通用方法,用于设计、构建和纯化含生物活性细胞结合结构域并融合了弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质(aECM)蛋白。文中描述了设计和克隆编码aECM蛋白氨基酸序列的质粒的过程,概述了利用等温浊点法(ITC)纯化aECM蛋白的步骤,最后讨论了通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法(Western Blotting)检测所获得aECM蛋白纯度的方法。
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1. 编码aECM蛋白的重组质粒的克隆
2. 将重组质粒转化至细菌表达宿主
3. aECM 蛋白的细菌表达
4. 细菌培养物的裂解
5. 使用逆向相变循环纯化 aECM 蛋白质
6. 使用SDS-PAGE电泳表征aECM蛋白
7. 采用蛋白质印迹法表征 aECM 蛋白质
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在设计含有弹性蛋白样重复序列的融合蛋白时,需维持整体弹性蛋白含量,使其占融合蛋白足够大的比例18以确保融合蛋白构建体保留其类弹性蛋白特性,从而能够使用ITC进行纯化。本节所述的aECM蛋白设计与序列均引自Tjin的研究工作。 等.14. 在此研究中,三种aECM蛋白成功克隆至pET22b(+)表达载体中。依次连接首先将弹性蛋白重复序列插入片段连接至pET载体,随后插入细胞结合结构域。最后,采用相同方法将另一组弹性蛋白重复序列插入至细胞结合结构域的末端。为验证重组基因是否成功构建,每种重组质粒均用XhoI和SalI在37 °C下进行3小时的酶切验证。 图1 显示测试性消化后的DNA插入片段和载体条带。对于每种aECM蛋白,插入片段的大小均与相应基因的大小一致,证实克隆成功。进一步的DNA测序结果也验证了测试性消化的结果。
在每种 aECM 蛋白含有足够量的弹性蛋白的情况下,我们能够通过 ITC 实现 aECM 蛋白的纯化。图 2 展示了整...
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重组蛋白工程是一种采用自下而上策略构建新型蛋白质材料的多功能技术。基于蛋白质的材料可被设计具有多种功能,并可根据特定应用需求进行定制。随着克隆和蛋白表达技术的不断进步,以可重复且可放大的方式低成本构建多种人工蛋白已变得相对简便。弹性蛋白样结构域已被广泛应用于多种人工蛋白中,既可作为纯化标签,也可赋予材料特定的力学性能。含有弹性蛋白样序列的人工蛋白可通过反向温度循环(ITC)实现快速纯化,从而无需使用昂贵的纯化柱和抗体。
本方案描述了构建编码aECM蛋白的重组质粒的步骤。编码弹性蛋白样重复序列的基因已购得。对于弹性蛋白样多肽等高度重复的肽序列,建议设计克隆策略,以便采用递归定向连接(RDL)策略22。通过使用RDL,可合成具有特定链长的重复多肽,因此目的基因可作为短单体片段购买。
在我们的研究中,细胞结合结构域被设计为两端均含有侧翼NheI限制性酶切位点,以便模块化替换中央的细胞结合结构域。选择在功能结构域或宿主载体的多克隆位点(MCS)以外区域均不存在的独特限制性酶切位点非常重要,以确保对插入片段或载体的...
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作者声明不存在相互竞争的经济利益。
作者感谢新加坡教育部AcRF第一层级(RG41)项目资助以及南洋理工大学启动基金的支持。Low和Tjin获得新加坡南洋理工大学研究学生奖学金(RSS)的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | 含氨苄青霉素抗性的T7表达载体 |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | 额外抗生素——氯霉素 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 用去离子水配制1 M储存液,诱导前新鲜配制。 |
| QIAprep Spin Miniprep试剂盒 | Qiagen | 27106 | 质粒提取试剂盒 |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| 氨苄青霉素 | Affymetrix | 11259 | |
| 氯霉素 | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™凝胶DNA回收试剂盒 | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold菌株 | Agilent Technologies | 200315 |
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