人工细胞外基质（aECM）蛋白的设计与构建 大肠杆菌 用于皮肤组织工程

摘要

重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质，用于组织工程应用。例如，可设计人工细胞外基质蛋白，使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。

摘要

重组技术是一种多功能平台，可用于创建具有可调控特性的新型人工蛋白质。近十年来，许多人工蛋白质已整合了源自自然界的功能结构域（或人工设计的结构域） 从头合成已有相关报道。特别是，人工细胞外基质（aECM）蛋白已被开发出来；这些aECM蛋白由来自纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白的生物功能域组成，并与包括弹性蛋白样重复序列、丝素蛋白和胶原重复序列在内的结构域相结合。迄今为止，aECM蛋白已在组织工程和伤口修复领域得到广泛研究。最近，Tjin及其同事开发了针对促进人皮肤角质形成细胞黏附与增殖的整合素特异性aECM蛋白。在该研究中，aECM蛋白整合了来自纤连蛋白、层粘连蛋白-5和IV型胶原蛋白的细胞结合域，并两侧连接弹性蛋白样重复序列。他们证明，所开发的aECM蛋白作为人工皮肤基质具有良好的应用前景。本文概述了此类aECM蛋白的设计与构建方法，以及利用弹性蛋白的温度响应特性进行纯化的流程。

引言

几十年来，研究人员一直在探索将合成材料和天然材料用作组织工程中的支架^1,2。尽管聚合物等合成材料具有优异的结构完整性和可调节的力学性能，但其生物活性往往不足，难以促进组织的生长和浸润。另一方面，细胞外基质（ECM）蛋白等天然材料虽具有良好的生物活性，却存在批次间差异大、降解过快以及免疫原性等问题。因此，人们希望采用重组蛋白，因为其可被设计为仅模拟天然蛋白中的理想特性^3,4。

重组蛋白工程作为一种多功能平台，广泛应用于新型人工蛋白生物聚合物的设计与生产，已引起广泛关注。通过控制基因序列，可针对多种应用定制人工蛋白的功能^5,6。特别是人工细胞外基质（aECM）蛋白，可被设计为具有多种功能，适用于组织工程、再生医学和伤口修复等领域^2,7。更重要的是，克隆与纯化技术的进步显著提高了重组蛋白生产的可扩展性，并大幅降低了制造成本。目前已有可能以较低的生产成本大量生产重组蛋白，使其在临床应用中具备经济可行性⁵。

人工细胞外基质蛋白已开发用于组织工程应用^8-11例如，Tirrell 等 设计了一种使用含纤连蛋白CS5序列和类弹性蛋白重复序列（ELP-CS5）的人工蛋白制备的小直径血管移植物。他们证明了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能够在这些材料上黏附并生长¹²其他研究者还引入了来自纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原和玻璃粘连蛋白的短生物活性序列，以及模拟弹性蛋白、蜘蛛丝和胶原蛋白的结构域，以构建多种融合蛋白¹⁰由基于弹性蛋白的aECM蛋白制成的块状交联薄膜也表现出与天然弹性蛋白相似的力学性能（弹性模量范围为0.3–0.6 MPa）。¹³随后，有研究报道含较长纤连蛋白片段的aECM蛋白也能加速伤口愈合。 体外 由于整合素结合亲和力增加⁸.

最近，Tjin 及其同事开发出了针对整合素的特异性人工细胞外基质（aECM）蛋白¹⁴。每种 aECM 蛋白均包含一个来自天然人皮肤细胞外基质成分的生物活性细胞结合结构域^2,7,15，例如层粘连蛋白-5、IV型胶原蛋白和纤连蛋白。例如，已有研究表明，整合素 α₃Β₁ 可结合位于层粘连蛋白-5 α-3 链球状结构域 3（LG3）中的 PPFLMLLKGSTR 序列^16,17。在该研究报告中，作者发现，原代人皮肤表皮角质形成细胞会根据 aECM 蛋白中所含细胞结合结构域的类型，优先通过不同的整合素与之结合。

Tjin 的研究中讨论的 aECM 蛋白 等 含有侧翼的弹性蛋白样结构域{(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ 赋予材料弹性，以模拟人类皮肤的力学特性。此外，在类弹性蛋白重复序列中引入赖氨酸残基还可提高蛋白质在水相溶剂中的整体溶解度。同时，赖氨酸残基还可作为交联位点，促进交联的aECM薄膜的形成¹²在aECM蛋白序列中加入弹性蛋白样重复序列，可使这些蛋白通过逆向相变循环（ITC）实现快速纯化。¹⁴弹性蛋白在特定温度下会发生急剧且可逆的相变，该温度被称为低临界溶解温度（LCST）或逆相变温度（T_t)^18-20弹性蛋白和类弹性蛋白重复序列在低于其低临界溶解温度（LCST）时呈现亲水性无规卷曲构象，并可溶于水；而在高于其LCST时，弹性蛋白迅速聚集形成微米级颗粒。此类相变过程具有可逆性，因此可利用等温浊点（ITC）技术实现基于弹性蛋白的aECM蛋白的快速纯化。²¹.

本研究报道了一种通用方法，用于设计、构建和纯化含生物活性细胞结合结构域并融合了弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质（aECM）蛋白。文中描述了设计和克隆编码aECM蛋白氨基酸序列的质粒的过程，概述了利用等温浊点法（ITC）纯化aECM蛋白的步骤，最后讨论了通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法（Western Blotting）检测所获得aECM蛋白纯度的方法。

方案

1. 编码aECM蛋白的重组质粒的克隆

1. 设计功能域的氨基酸序列（例如，细胞结合结构域和弹性蛋白样重复序列）。根据软件说明，使用免费软件设计位于功能结构域两端的限制性酶切位点，以方便亚克隆。例如，http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/）。在此选择功能结构域中不存在的独特限制性酶切位点，以确保酶切仅发生在预定位置。选择位于载体多克隆位点（MCS）中的限制性酶切位点例如，pET22b(+)）用于亚克隆。
2. 根据软件说明，使用免费网站将氨基酸序列反向翻译为核苷酸序列。例如，http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html）。确保密码子针对目标表达系统进行了优化 大肠杆菌 宿主。
3. 目的基因可作为单链寡核苷酸从商业途径购得（即， 如果寡核苷酸 < 100个碱基对（bp））并进行DNA退火（参见步骤1.4），以降低成本。否则，对于大于100 bp的基因，可通过商业公司订购。
4. 寡核苷酸的DNA退火
   1. 将DNA寡聚体退火以获得目标基因序列。将DNA寡核苷酸溶解于DNA寡聚体缓冲液（10 mM Tris：2-氨基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二醇，pH 8.0，经滤膜过滤）中，终浓度为1 µg/µl。
   2. 向32 µl DNA退火缓冲液（10 mM Tris，100 mM NaCl和100 nM MgCl）中加入每种寡核苷酸各4 µl₂) 以达到总体积为 40 µl 的混合液。
   3. 使用加热板将烧杯中的水煮沸，将混合物于95 °C水浴中孵育5分钟。取出烧杯，将整个装置置于泡沫塑料箱中过夜逐渐冷却。寡核苷酸已退火，可进行消化反应。
5. 加入相应的限制性内切酶以消化退火后的寡核苷酸即，简称插入片段）和宿主载体（即，pET22b(+)）中分别进行。使用以下配方（1-2 µg DNA，每种限制性内切酶2 µl，10x限制性内切酶缓冲液5 µl，加水至总体积50 µl），在37 °C下反应3-4小时。
   注意：pET22b(+) 质粒载体具有氨苄青霉素抗性，并在C末端含有一个6x-His标签。pET22b(+)中的6x-His标签使我们能够在第7步通过Western印迹使用His标签抗体来鉴定目标蛋白。
6. 向每种消化混合物中加入6×上样染料。将消化混合物分别上样，并同时加入DNA标记物，于含有紫外荧光DNA染料的1.2% DNA琼脂糖凝胶中，100 V电压下电泳1小时。使用紫外光成像仪观察1.2% DNA琼脂糖凝胶。
7. 使用商业化的凝胶纯化试剂盒切取凝胶以回收消化后的DNA产物。用柱子的最小洗脱体积进行洗脱，使DNA浓度至少达到50–100 ng/µl。
8. 将目的基因依次连接到经消化的DNA片段中即， 使用T4连接酶将弹性蛋白重复序列或通过DNA退火获得的细胞结合结构域插入质粒载体，反应体系如下：2 µl 载体，1 µl T4连接酶，1.5 µl T4连接缓冲液，x µl 插入片段，加水至总体积为15 µl（即加入10.5-x µl 水）. 在室温下孵育连接反应混合物 2小时。
   注意：应调整载体与插入片段的摩尔浓度比例，以优化连接效率。配方中插入片段的体积记为x，其具体数值取决于步骤1.7中洗脱得到的DNA浓度。
9. 解冻 E. coli DH5α 感受态细胞（或任何克隆菌株）置于冰上。预热 2xYT 琼脂平板（表1含氨苄青霉素（25 µg/ml）的培养基加热至 37 °C。
10. 使用热激法转化细胞：
    1. 将50 µl感受态细胞分装至洁净的预冷微量离心管中。加入5 µl（100 pg至100 ng）连接反应混合物，轻轻吹打混匀。冰浴孵育20分钟。
    2. 将含有细胞混合物的微型离心管浸入42 °C水浴中2分钟，然后放回冰上2分钟。准确计时浸浴时间，以尽量减少高温对细胞的损伤。
    3. 加入 500 µl SOC 培养基（表1)加入微量离心管中，37 °C 摇床孵育 1 小时。
    4. 将50至500 µl细胞/连接混合物涂布于预先升温至室温的含氨苄青霉素（25 µg/ml）的2xYT琼脂平板上，倒置平板于37 °C过夜（12–16小时）培养。
11. 第二天，使用洁净的移液器吸头从琼脂平板上挑取DNA菌落。将菌落接种于5 ml 2YT培养基中培养。表1在含有氨苄青霉素（25 µg/ml）的培养基中，37 °C、225 rpm 振荡培养过夜（12–16 小时）。
12. 次日，使用质粒提取试剂盒，按照制造商说明书提取每个挑取的菌落的DNA质粒。用50 µl水洗脱DNA。
13. 使用以下配方进行限制性内切酶酶切验证：（5 µl DNA，每种限制性内切酶0.2 µl，1 µl 10x限制性内切酶缓冲液，加水至总体积10 µl），37 °C孵育2小时，以筛选可能含有插入片段的菌落，随后按步骤1.6的方法在1.2% DNA琼脂糖凝胶上电泳分析。
    注意：消化完成后，成功的连接反应应产生两条条带，分别为载体和插入片段，其大小应与各自的分子量相对应图1).
14. 将可能的菌落送至商业测序公司，使用T7启动子正向和反向引物进行DNA测序。

2. 将重组质粒转化至细菌表达宿主

1. 根据测序结果，选择一个连接成功的菌落，并使用该DNA质粒转化至E. coli表达宿主中。
2. 将E. coli表达菌株（BL21(DE3)pLysS）置于冰上融化。同时，将含有氨苄青霉素（25 µg/ml）和氯霉素（34 µg/ml） 的琼脂平板恢复至室温。
   注意：BL21(DE3)pLysS菌株所含的pLysS质粒带有氯霉素抗性基因。pLysS质粒中含有一个组成型表达的T7抑制蛋白基因，用于抑制人工细胞外基质蛋白的泄漏表达。在培养过程中，必须使用氯霉素筛选含有pLysS质粒的细菌细胞。
3. 重复步骤1.10，以获得可表达人工蛋白的转化后E. coli细胞。用Parafilm封好琼脂平板，倒置存放于4 °C，可保存长达一个月。

3. aECM 蛋白的细菌表达

1. 参见图2，用移液器吸头从转化后的琼脂平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和氯霉素抗生素的10 ml 无菌TB培养基（表1）中，置于试管内。将该初始培养物在37 °C、225 rpm振荡条件下过夜（O/N，12–16小时）培养。
2. 将10 ml初始培养物转移至装有1 L新鲜无菌TB培养基（含相同抗生素）的3 L三角烧瓶中。在37 °C、225 rpm振荡条件下培养2–3小时，通过取1 ml培养物加入空白比色皿中测定其光密度（OD₆₀₀），观察是否达到0.6–0.8。在诱导前保留1 ml培养物用于后续SDS-PAGE表征。
   1. 为测定细胞培养物的OD₆₀₀，先准备一比色皿TB培养基作为空白对照。另取1 ml培养物转移至新的空白比色皿中。使用分光光度计，在600 nm波长下以空白对照为参比测定培养物的光密度。
   2. 将1 ml培养物样品转移至1.5 ml微量离心管中，于12,000 × g离心2分钟，弃去上清液，保存沉淀样品用于后续SDS-PAGE分析。
3. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM进行诱导，在37 °C、225 rpm振荡条件下继续培养4小时。在诱导结束时（4小时）保留1 ml培养物用于SDS-PAGE表征。
4. 将培养物转移至1 L离心瓶中，于4 °C、12,000 × g离心30分钟收集细胞。弃去上清液，称量细胞沉淀，并按0.5 g/ml的比例将其重悬于TEN缓冲液（1 M Tris，0.01 M EDTA，0.1 M NaCl，pH = 8.0）中。

4. 细菌培养物的裂解

1. 将重悬的细胞培养物在 -80 °C 冰冻过夜。在室温水浴或冰上解冻冷冻的细胞培养物以裂解细胞。解冻过程中加入 10 μg/ml 脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）、10 μg/ml 核糖核酸酶 A（RNase I）和 50 μg/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF），并轻轻搅拌使溶液均匀。
2. 待所有重悬细胞完全解冻后，将溶液调至 pH 9.0 以提高蛋白质在水中的溶解度¹²。在冰上搅拌条件下逐滴加入 6 N NaOH，直至形成均一溶液。使用直径为 2 mm 的平头探针，在冰上进行超声破碎处理 20 分钟，脉冲时间为 5 秒。
3. 将细胞溶液在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 30 分钟。将上清液转移至洁净的空瓶中，并于 4 °C 保存，用于后续纯化。
4. 同时，用 TEN 缓冲液再次重悬细胞沉淀，并在 -80 °C 重新冷冻。为彻底裂解细胞，重复冻融和超声处理过程，最多三次。保留 20 µl 细胞裂解液用于 SDS-PAGE 分析。

5. 使用逆向相变循环纯化 aECM 蛋白质

1. 收集步骤 4.3 的细胞裂解液，并采用逆向温度循环法（ITC）纯化 aECM 蛋白，该方法类似于弹性蛋白类蛋白的纯化方法²¹。循环过程将使用不同的温度，分别为 4 °C（称为“冷”循环）和 37 °C（称为“暖”循环）。
2. 将细胞裂解液分装至 50 ml 离心管中，在 4 °C 条件下以 40,000 × g 离心 2 小时。细胞沉淀应呈深棕色且质地稀软。
3. 用移液器小心移除上清液，确保与沉淀充分分离。将上清液收集至洁净的离心管中，并加入 NaCl 至终浓度为 1 M（最高可达 3 M）。在 225 rpm 振荡条件下，将溶液于 37 °C 温育 2 小时。
   注意：加入 NaCl 会引发 aECM 中弹性蛋白组分的相变，导致蛋白聚集。上清液将变得浑浊。若蛋白浓度足够高，可在离心管壁观察到白色泡沫状蛋白沉淀。
4. 将步骤 5.3 所得上清液在 37 °C 条件下以 40,000 × g 离心 2 小时。弃去上清液，用金属刮刀压碎沉淀，并在 4 °C 条件下，使用磁力搅拌器剧烈搅拌，将沉淀颗粒重悬于冰冻的灭菌蒸馏水中（50 mg/ml），过夜处理。沉淀应完全溶解。
5. 重复步骤 5.2 至 5.4 三至五次，以获得更高纯度的蛋白产物。
6. 完成最终一轮纯化后，在 4 °C 条件下将蛋白溶液置于蒸馏水中透析以去除盐分。每隔 4 小时或 8 小时更换透析液，持续透析 2–3 天（包括过夜）。保留 20 µl 纯化后的蛋白用于 SDS-PAGE 分析，其余蛋白溶液冻干后储存于 -80 °C，以备后续使用。

6. 使用SDS-PAGE电泳表征aECM蛋白

1. 制备12% SDS-PAGE凝胶（如果分子量较大，建议使用8% SDS-PAGE凝胶以获得更好的分离效果）。向每个样品中加入2x SDS上样缓冲液，在100 °C加热10分钟，然后在100 V电压下电泳1小时，或直至与aECM蛋白分子量相对应的蛋白ladder迁移至凝胶中部。
2. 从SDS-PAGE装置中取出凝胶，加入足量的考马斯亮蓝染色液（表2），使液体完全浸没凝胶，在培养皿中染色1小时。将凝胶转移至脱色液（表2）中，在摇床上漂洗5分钟。更换脱色液，继续在摇床上脱色，直至凝胶背景清晰透明，目标蛋白条带应清晰可见。
3. 通过与蛋白ladder的迁移位置比较，确定目标蛋白的分子量。
4. 为进一步确认目标蛋白的存在，按步骤7进行Western印迹分析。

7. 采用蛋白质印迹法表征 aECM 蛋白质

1. 按照第6节的方法，在12% SDS-PAGE凝胶上电泳样品，不进行染色。
2. 将硝酸纤维素膜裁剪至略大于SDS-PAGE凝胶的尺寸，再裁剪4张相同大小的滤纸。
3. 将一张滤纸用Western转膜缓冲液（20% v/v甲醇，25 mM Tris，190 mM甘氨酸，pH 8.3）浸湿，将SDS-PAGE凝胶置于其上，随后覆盖另一张滤纸，接着放置硝酸纤维素膜，最后再覆盖两张湿滤纸。确保整个装置完全浸没在足量的Western转膜缓冲液中。
   注意：此时凝胶与膜不应直接接触，因为蛋白质在接触时可能已结合至膜上。
4. 将两张湿滤纸放入半干式Western转膜装置中，随后放置硝酸纤维素膜，小心地将SDS-PAGE凝胶对准并置于膜上，最后在凝胶上方再覆盖两张湿滤纸。以45 mA电流运行30分钟进行转膜；若电压超过30 V，则需补充缓冲液。
   注意：建议将SDS-PAGE凝胶一次性准确放置于膜上，避免在膜上反复移动凝胶，以防蛋白质在接触时即发生非特异性结合。
5. 取出硝酸纤维素膜，用封闭液（含5%脱脂奶粉的PBS，pH 7.4，经滤纸过滤）在室温下封闭2小时。弃去封闭液，加入PBS漂洗。
   注意：更换新手套，以避免外源蛋白质污染膜。
6. 将一抗（抗His抗体）用PBS按1:1,000比例稀释，在室温下轻轻摇动孵育1小时。配制足够体积的抗体稀释液以完全浸没整张膜，例如按1:1,000稀释比例，将1 µl抗体（储存浓度：1 mg/ml）加入999 µl PBS中，得到总体积为1 ml的混合液。
7. 用5 ml PBST（含0.1% Tween20的PBS）漂洗膜。
8. 加入与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，用PBS按1:5,000比例稀释，在室温下轻轻摇动孵育1小时。配制足够体积的稀释液以完全浸没膜，例如按1:5,000稀释比例，将1 µl抗体（储存浓度：1 mg/ml）加入4,999 µl PBS中，得到总体积为5 ml的混合液。
9. 用5 ml PBST洗涤膜，重复洗涤两次。
10. 加入化学发光底物，用量应足以覆盖整张膜，并按照所用底物的说明书进行孵育。
    注意：不同底物对蛋白质检测的灵敏度可能不同，若增加抗体浓度仍无法增强信号，建议选用最高灵敏度的底物。
11. 使用基于CCD相机的成像系统捕获化学发光信号。若信号较弱或存在非特异性信号，可调整一抗和二抗的稀释比例；若背景信号过高，可延长封闭时间。

结果

在设计含有弹性蛋白样重复序列的融合蛋白时，需维持整体弹性蛋白含量，使其占融合蛋白足够大的比例¹⁸以确保融合蛋白构建体保留其类弹性蛋白特性，从而能够使用ITC进行纯化。本节所述的aECM蛋白设计与序列均引自Tjin的研究工作。 等.¹⁴. 在此研究中，三种aECM蛋白成功克隆至pET22b(+)表达载体中。依次连接首先将弹性蛋白重复序列插入片段连接至pET载体，随后插入细胞结合结构域。最后，采用相同方法将另一组弹性蛋白重复序列插入至细胞结合结构域的末端。为验证重组基因是否成功构建，每种重组质粒均用XhoI和SalI在37 °C下进行3小时的酶切验证。 图1 显示测试性消化后的DNA插入片段和载体条带。对于每种aECM蛋白，插入片段的大小均与相应基因的大小一致，证实克隆成功。进一步的DNA测序结果也验证了测试性消化的结果。

在每种 aECM 蛋白含有足够量的弹性蛋白的情况下，我们能够通过 ITC 实现 aECM 蛋白的纯化。图 2 展示了整...

讨论

重组蛋白工程是一种采用自下而上策略构建新型蛋白质材料的多功能技术。基于蛋白质的材料可被设计具有多种功能，并可根据特定应用需求进行定制。随着克隆和蛋白表达技术的不断进步，以可重复且可放大的方式低成本构建多种人工蛋白已变得相对简便。弹性蛋白样结构域已被广泛应用于多种人工蛋白中，既可作为纯化标签，也可赋予材料特定的力学性能。含有弹性蛋白样序列的人工蛋白可通过反向温度循环（ITC）实现快速纯化，从而无需使用昂贵的纯化柱和抗体。

本方案描述了构建编码aECM蛋白的重组质粒的步骤。编码弹性蛋白样重复序列的基因已购得。对于弹性蛋白样多肽等高度重复的肽序列，建议设计克隆策略，以便采用递归定向连接（RDL）策略²²。通过使用RDL，可合成具有特定链长的重复多肽，因此目的基因可作为短单体片段购买。

在我们的研究中，细胞结合结构域被设计为两端均含有侧翼NheI限制性酶切位点，以便模块化替换中央的细胞结合结构域。选择在功能结构域或宿主载体的多克隆位点（MCS）以外区域均不存在的独特限制性酶切位点非常重要，以确保对插入片段或载体的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pET22b (+)	Novagen	69744	含氨苄青霉素抗性的T7表达载体
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	额外抗生素——氯霉素
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Gold Biotechnology	I2481C	用去离子水配制1 M储存液，诱导前新鲜配制。
QIAprep Spin Miniprep试剂盒	Qiagen	27106	质粒提取试剂盒
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202S
氨苄青霉素	Affymetrix	11259
氯霉素	Affymetrix	23660
Zymoclean™凝胶DNA回收试剂盒	Zymo Research	D4001
XL10-gold菌株	Agilent Technologies	200315