小鼠脑侧脑室室管膜纤毛的活体成像

摘要

使用高分辨率微分干涉差显微镜（DIC），一种 离体 通过活体成像技术展示小鼠脑室内部运动型室管膜纤毛的搏动观察。该技术可记录纤毛独特的搏动频率、搏动角度及其细胞内钙振荡的节律特性。

摘要

多纤毛室管膜细胞排列在成年大脑的脑室壁上。室管膜纤毛结构或功能异常与多种神经系统功能障碍相关。目前的离体（ex vivo）活体成像技术可用于对运动性室管膜纤毛的动力学进行详细研究，该技术包括多个步骤：根据托莱多大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规程，使用二氧化碳对小鼠实施安乐死；随后进行开颅并取出脑组织，利用振动切片机或锋利刀片对脑组织进行矢状面解剖，以获得穿过侧脑室的极薄脑片，从而可视化室管膜纤毛。将脑片孵育在定制的玻璃底培养皿中，培养基为含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM/High-Glucose），在37 °C、95% O₂/5% CO₂ 混合气体环境中孵育，这对维持实验过程中组织的活性至关重要。随后使用高分辨率微分干涉差显微镜记录纤毛摆动的视频。通过逐帧分析视频，计算纤毛摆动频率。据此可根据纤毛摆动频率和摆动角度，将室管膜细胞明确分类为三种类型。此外，该技术还可结合高速荧光成像分析，用于表征室管膜细胞独特的细胞内钙振荡特性，以及药理学试剂对钙振荡和纤毛摆动频率的影响。同时，该技术也适用于纤毛结构及纤毛蛋白定位研究中的免疫荧光成像。这在疾病诊断和表型研究中尤为重要。该技术的主要局限性在于，随着脑组织逐渐死亡，活体运动纤毛的活动会逐渐减弱。

引言

纤毛是源自细胞表面并延伸至细胞外环境的感觉性微管细胞器。根据其微管排列方式，纤毛可分为两类：“9+0”型或“9+2”型。从功能上，依据其运动能力，又可分为运动性纤毛和非运动性纤毛¹。初级纤毛通常指“9+0”型非运动性纤毛，其结构包含九组平行的微管二联体（以“9”表示），而中央鞘内无中央微管对（以“0”表示）。然而，某些“9+0”型纤毛（如调控胚胎左右对称性的结节纤毛）具有运动性²。另一方面，运动性纤毛除具有九组平行微管二联体外，还包含一对中央微管二联体，并与驱动蛋白dynein相关联，以实现运动功能。此外，某些“9+2”型纤毛（如嗅觉纤毛）则为非运动性³。衬于脑室和脊髓中央管的室管膜细胞具有运动性纤毛，可推动脑脊液（CSF）沿脑室流动⁴。

该方法的总体目标是促进对运动纤毛动力学及结构异常的研究。脑的健康与发育在很大程度上依赖于脑室中脑脊液（CSF）的有效循环。例如，正常的脑脊液流动和液体平衡需要室管膜纤毛的正常摆动和功能^5,6，而后者在调控神经元细胞的定向移动和干细胞迁移过程中发挥关键作用⁷。因此，室管膜纤毛功能或结构的异常可导致脑脊液流动异常，进而引发脑积水——一种脑室中脑脊液异常积聚的医学状况。这种情况可能继而导致颅内压升高、头颅进行性增大、惊厥、管状视野以及智力障碍⁸。

该技术相较于现有方法的优势在于，首次能够根据纤毛摆动频率和摆动角度的独特性，鉴定出三种不同的室管膜细胞类型：I型、II型和III型。这些室管膜细胞定位于脑室的特定区域。此外，该方法还可用于展示年龄以及药理学物质（如酒精和西洛他唑）对室管膜细胞类型或其定位的影响，而此类研究在此前的室管膜细胞分类体系下无法实现。西洛他唑是一种磷酸二酯酶-3抑制剂，该酶可将cAMP代谢为AMP，同时参与调控细胞内钙离子浓度⁹。通过高速荧光成像分析，可对室管膜细胞独特的细胞内钙振荡特性进行成像与量化。例如，酒精和西洛他唑均显著改变了室管膜纤毛的摆动频率以及细胞内钙振荡的特性，进而可能影响室管膜纤毛驱动的脑脊液容积更新¹⁰。综上所述，该技术为首次揭示三种具有不同钙振荡特性的室管膜细胞类型提供了关键证据。

在接下来的部分中，将详细逐步介绍该操作流程，重点关注组织的制备与处理。

方案

动物使用的相关程序已获得托莱多大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，符合美国国立卫生研究院机构动物护理和使用委员会指南以及《实验动物护理和使用指南》的要求。

1. 脑组织提取、切片与组织制备

1. 通过将野生型 C57BL/6 小鼠品系置于 CO₂ 窒息环境中深度麻醉 5 分钟实施安乐死，随后通过颈椎脱位确认死亡。
2. 用 70% 乙醇清洁小鼠头部。
3. 使用无菌剪刀和镊子进行开颅手术：首先从头部顶部开始剥离皮肤，以暴露颅骨。
4. 暴露颅骨后，从后侧开始向前侧方向逐块剥离骨片以去除颅骨，注意避免破坏脑室结构。
5. 取出完整的大脑组织。
6. 将大脑置于盛有 DMEM/高糖培养基的 100 mm 培养皿中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素溶液（含青霉素 10,000 单位/ml 和链霉素 10,000 µg/ml），并预热至 37 °C。
7. 用手持锋利刀片沿正中矢状面切开大脑，然后使用振动切片机从每半脑获取最初的 100–200 mm 组织切片。
8. 用预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（1× PBS）冲洗脑组织。
9. 立即将脑切片放入预热至 37 °C 的 DMEM/高糖培养基中。

2. 活细胞成像配置与设置

1. 将脑组织切片置于含有1 ml DMEM/高糖培养基的30 mm玻璃底培养皿中。调节显微镜封闭腔室环境至37 °C，95%/5% O₂/CO₂（图1）。
2. 使用60倍油镜，首先在60倍物镜上滴加一滴镜油，利用常规微分干涉（DIC）透射光对细胞进行聚焦，以采集室管膜细胞/纤毛图像。
3. 随后，根据DMEM气泡移动的方向判断活动性室管膜纤毛的位置，因为纤毛摆动会在局部形成类似气泡移动的现象。使用DIC滤光片选择脑侧脑室中具有健康细胞及活动纤毛的区域。找到室管膜纤毛后，调节光照与焦距以获得满意的图像。
4. 根据特定实验目的，使用Metamorph成像软件设置活细胞成像参数。在本实验演示中，采用相机1×1 binning模式、60倍物镜及5–10毫秒曝光时间，采集20帧24位图像。
5. 通过将显微镜光圈调节至最佳水平，以实现最短曝光时间，从而采集DIC图像。观察实时图像传输至相机，以实现快速、即时的无延迟图像采集。根据获得足够图像对比度所需的最短曝光时间，计算纤毛摆动速度。

3. 数据可视化与分析

1. 通过将视频速度调慢，并使用细胞计数器或类似工具计数1分钟内纤毛摆动的次数，计算纤毛摆动次数。
2. 为计算搏动频率，将视频录制时的曝光时间乘以获取的帧数或时间间隔图像数量，得到总秒数（示例：5毫秒曝光时间 × 200帧 = 1,000毫秒，即1秒）。
3. 计算一秒钟内的纤毛摆动次数，以获得频率，频率的单位为每秒摆动次数。通过将一秒钟时间间隔内的纤毛摆动次数相除来计算（示例：在曝光时间为 5 毫秒的 200 帧视频中，纤毛摆动 50 次） 即 5 毫秒 × 200 帧 = 1 秒；现在用 50 次搏动除以 1 秒 = 50 赫兹。
4. 通过评估室管膜纤毛在动力相和恢复相期间的运动轨迹，计算纤毛摆动角度。按照先前描述的方法进行，略作修改。 ¹¹在整个拍打周期中，可观察到单根纤毛的精确运动。
5. 在显示器上方的醋酸盐片上，沿室管膜边缘画一条水平线，并在纤毛动力冲程起始时的中线位置画一条垂直线。
6. 逐帧绘制纤毛在动力行程中向前运动时的精确位置。以类似方式，绘制纤毛在恢复行程中的运动轨迹。
7. 根据纤毛在动力行程和恢复行程中偏离中线的最大角度，计算纤毛摆动角度。

4. 钙信号记录

1. 脑组织切片后，用 1× PBS 或杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s PBS，pH 7.0）短暂冲洗脑片。配制新鲜的 Fluo-2 溶液，以避免荧光淬灭，并获得良好的信噪比。
2. 将 Fluo-2 溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 1 mM 的储存液，充分混合并涡旋至少 5 分钟，确保 Fluo-2 在 DMSO 中均匀溶解。
3. 将 Fluo-2 储存液稀释至 500 ml 预热至 37 °C 的含 2% B27 的 DMEM/高糖培养基中，终浓度为 20 mg/ml。
   注：B-27 是一种优化的无血清添加剂，含有维生素 A、 抗氧化剂混合物和 胰岛素，可用于支持海马体及其他中枢神经系统神经元的短期或长期存活。
4. 立即将脑片置于玻璃底培养皿中，加入含 20 mg/ml Fluo-2 的溶液，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
5. 为确定钙荧光染料 Fluo-2 的最佳负载浓度，并避免钙染料对细胞的毒性，可用 ATP 刺激细胞，并通过检测 ATP 诱导的钙信号的时间进程和峰值幅度来评估细胞活力。
6. 以 5 毫秒的采集速率记录钙振荡视频，持续至少 1 秒（即每秒 200 帧），激发波长和发射波长分别为 488 nm 和 515 nm（视频 2）。
7. 为区分 Fluo-2 钙信号与自发荧光或运动伪影，应单独监测在 515 nm 处发射的荧光强度。
   注：Fluo-2 并非适用于定量细胞内钙浓度的荧光染料。然而，它是一种优异的动态钙染料，可用于检测快速钙变化，例如钙振荡。若需更精确的钙定量，推荐使用 Fura-2。但 Fura-2 的动态变化受限于其比率型染料的特性。
8. 根据制造商提供的公式计算准确的游离细胞内钙浓度。示例：[Ca²⁺] = K_d × (R–R_min)/(R_max – R)。其中 K_d 为染料与释放钙离子的解离常数，R 为在 488 nm 处测得的荧光强度，R_min 和 R_max 分别为在最低和最高离子浓度下的荧光比值¹²。

5. 免疫荧光显微镜

1. 用含有4%多聚甲醛（PFA）和2%蔗糖的磷酸盐缓冲液溶液固定脑切片，固定10分钟。或者，先用4% PFA固定整个脑组织，然后使用冷冻切片机将其切成50 mm的切片。
2. 用1×PBS洗涤组织三次，每次5分钟。
3. 将脑切片与含0.1% Triton-X的1×PBS溶液孵育5分钟，然后用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
4. 将脑切片与小鼠一抗（抗乙酰化α-微管蛋白抗体）在含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS溶液中孵育，抗体稀释比例为1:5,000，室温孵育1小时或4 °C过夜。
5. 用1×PBS洗涤组织三次，每次5分钟。
6. 将脑切片与二抗（荧光素标记的抗小鼠IgG）在含10% FBS的1×PBS溶液中孵育，抗体稀释比例为1:500，室温孵育1小时。
7. 在荧光显微镜下观察前，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对切片进行复染5分钟，以标记细胞核（或DNA）¹³。为减少光漂白，应以尽可能短的曝光时间立即成像。

结果

测量活体小鼠脑中室管膜纤毛功能

本方案所述方法用于监测从小鼠脑组织新鲜解剖获取的室管膜纤毛的功能与结构，并用于监测和研究纤毛摆动频率。完成完整实验所需的步骤已在示意图流程图中展示。 （图1）建议在较短时间内完成实验，以尽可能保持纤毛的运动活性。同时展示了脑室管膜细胞及其运动纤毛的代表性延时录像和图像。 （视频 1） 和 图 2a)通过计算运动纤毛的摆动频率和角度模式，对获得的流数据进行分析。将纤毛分为三种类型的判据如下所示。 表1. 使用纤毛标志物乙酰化-α-微管蛋白（acetylated-α-tubulin）确认室管膜纤毛的存在，并用DAPI（DNA标记物）对室管膜细胞进行复染以显示细胞核 （图2b）根据对脑侧脑室室管膜细胞至少22次独立实验的观察，我们能够基于纤毛摆动频率将室管膜细胞分为三种类型。此外，我们证明了0.25%浓度的乙醇会显著抑制各类室管膜细胞的纤毛摆动频率图3

讨论

本文介绍了一种用于制备小鼠脑组织以进行活体成像和荧光显微观察的实验方案，可快速、灵敏地近距离观察脑室内的室管膜纤毛。该技术不仅限于侧脑室，也可用于观察其他脑室内纤毛。此成像技术能够在体外（ex vivo）条件下实时呈现由纤毛摆动驱动脑脊液流动的动态过程。此外，该方法还支持对纤毛运动方向性的分析。这主要得益于高分辨率微分干涉差（DIC）与荧光成像系统的结合使用。该系统的一个优势在于显微镜被封闭在环境控制舱内，可精确调控温度、湿度和CO₂浓度，这些参数对于活体成像实验中细胞与组织的存活至关重要。系统还配备了自动XY和Z轴控制模块、数字相机以及波长滤光片切换器，这些功能均有助于对纤毛运动等动态细胞行为进行高效成像。显微镜连接计算机，通过专业的成像软件可便捷地获取高质量图像。

利用该技术将室管膜细胞划分为不同类型，相较于现有或以往研究室管膜纤毛的方法具有显著进步。例如，若将室管膜细胞视为单一细胞群体，则某些药物或毒性物质（如酒精）的作用可能被低估或完全忽略¹⁷。需要明确的是，尽管这三类室管膜纤毛在纤毛摆动频率和摆动角度等特征上存...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/高糖	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30088-03
青霉素/链霉素	Thermo Scientific	SV30010
磷酸盐缓冲液	Thermo Scientific	SH30256-01
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
蔗糖	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
含DAPI的VECTASHIELD HardSet封片剂	Vector Labs	H-1500
抗乙酰化α-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	T7451	克隆号 6-11B1
FITC抗小鼠抗体	Vector Labs	FI-2000
细胞培养板	VWR Vista Vision	30-2041
盖玻片（18 × 18）	VWR Vista Vision	16004.326
振动切片机	Leica Biosystems	Leica VT1200S
冷冻切片机	Leica Biosystems	Leica CM1860
倒置荧光显微镜	Nikon	Nikon TE2000	60X油镜
显微镜盖玻片 24 × 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
含DAPI封片剂	Vector Laboratories	H-1500
DAPI滤光片组	Chroma Technology