方法文章

一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

DOI：

10.3791/52859

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2015年6月22日

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

本文内容

摘要

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本方案描述了在大鼠进行学习与记忆任务时，如何暂时且远程地抑制离散脑区中神经元活动的方法。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件），旨在区分学习过程中的不同组分。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了如何在动物进行学习与记忆任务时，暂时且远程地抑制特定脑区的神经元活动。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件化），旨在区分不同类型的学习过程。具体而言，通过病毒介导递送的方式，在啮齿类动物的特定脑区表达一种基因改造的抑制性G蛋白偶联受体（即设计受体）。三周后，当设计受体的表达水平达到较高程度时，在特定行为实验开始前30分钟系统性给予一种药理学试剂（即设计药物）。该药物可特异性结合设计受体，从而抑制表达该受体的神经元活动，而在其他方面无生物学活性。脑区的抑制状态可持续2至5小时（取决于给药剂量和途径）。行为范式完成后，需对脑组织进行检测，以确认病毒注射位点准确及受体表达正常。该方法特别适用于确定单个脑区对行为特定成分的贡献，并可应用于多种不同的行为范式研究中。

引言

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行为神经科学领域的一个激动人心的挑战是确定复杂行为的神经基础。已有多种技术被用于识别特定脑区对复杂行为各子成分的贡献，这些技术包括永久性损毁、通过套管植入实现的暂时性脑区失活以及光遗传学方法。尽管这些方法增进了我们对学习过程中脑区特异性的理解，但每种技术都存在一定的局限性。具体而言，永久性损毁通常在行为测试前实施，因此其效应贯穿整个实验范式始终。涉及短期神经抑制剂（例如，河豚毒素）的套管实验可能对脑组织造成显著损伤，并在行为测试前诱导实验对象产生应激反应。此外，通过套管进行的失活作用仅限于套管尖端周围的脑区组织。最后，尽管光遗传学技术在特定脑区活动的时间控制方面具有高度灵活性，但其成本高昂且技术要求复杂。

这些局限性可通过采用药理遗传学方法（仅由设计药物激活的设计受体，DREADDs）加以克服1,2。重要的是，尽管药理遗传学的概念较为复杂，其技术操作却十分简便。类似于传统的立体定位手术方法（例如将毒素（如 NMDA、红藻氨酸）注入特定脑区），该技术涉及将携带编码修饰型抑制性G蛋白偶联受体（hM4Di；即设计受体）DNA片段的腺相关病毒（AAV）注入标准实验啮齿类动物的特定脑区（见图1）。该病毒载体还包含一个荧光报告基因（mcitrine）。一旦病毒被细胞摄取，设计受体（及报告蛋白）在注射后约3周达到最大表达水平，并可通过系统给予原本无生物学活性的设计药物氯氮平-N-氧化物（clozap....

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方案

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动物实验已获得欧柏林学院机构动物护理与使用委员会的批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求21。

1. 病毒注射准备

注意：本方案采用 BSL-1 防护措施。当使用 BSL-2 防护措施时，需穿戴一次性实验服、手套、鞋套、护目用品和颗粒物防护口罩（N95 型）。所有操作 BSL-2 物质的人员必须由当地公共卫生机构进行颗粒物防护口罩的适配性检测。有关病毒载体操作与储存的更多细节，请参见 Lowery & Majewska (2010)22。

  1. 首次使用时，将未使用的病毒分装至20 µl离心管中保存，以避免反复冻融。
  2. 清理工作台面，移除所有不必要的物品，并用70%乙醇对台面进行消毒。准备10%次氯酸钠溶液用于AAV废弃物的去污处理。在工作台上放置盛有该次氯酸钠溶液的烧杯和一支无菌的10 µl注射器。在操作准备期间，将含有AAV的离心管置于装有碎冰的容器中。
  3. 将装有病毒的离心管固定在标准台式虎钳中。用10 µl注射器吸取至少4 µl的AAV。加样时注意避免针头触碰离心管底部而弯曲。确保注射器中4 µl AAV溶液内无气泡。
  4. 将空的病毒管丢弃至盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯中。未使用的病毒部分应按照供应商说明进行储存。
  5. 向废液容器中补充适量10%次氯酸钠溶液，废弃物需静置3....

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结果

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行为学结果

实验结束后，应定量和定性评估特定脑区暂时失活的效果。本示例采用一种三阶段行为范式（感觉预条件化），在预条件化阶段向后扣带皮层（RSC）给予CNO以抑制其神经活动，从而检验RSC是否对中性刺激间关联的形成具有必要性这一假设12。重要的是，研究者并不局限于本文所述的行为范式或实验设计，因为药理遗传学方法可与大多数行为范式相结合。

尽管通常不对预条件化阶段（第1阶段）期间获得的数据进行分析，但量化大鼠在条件化阶段（第2阶段）是否学会了光-食物关联非常重要。如图3A所示，实验组（Expt）和对照组（Ctrl）大鼠在光刺激呈现期间的食物杯行为均逐渐增加（图3A），表明大鼠已建立起视觉刺激（光）与食物奖励之间的经典条件反射关联。此外，两组大鼠在食物奖励呈现期间的食物杯行为也均逐渐增加（图3B），表明它们获取奖励的动机相当。在关键的测试阶段，当单独呈现听觉刺激而无其他刺激时，对照组大鼠的辨别分数显著不同于实验组大.......

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讨论

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本方案描述了如何应用药理遗传学方法（DREADD）来研究特定脑区在多阶段复杂学习任务中的作用。通过在学习的不同阶段临时且远程地抑制特定脑区的神经活动，这种联合方法为研究多种行为提供了平台，包括更精细或被掩盖的学习形式。在本方案所描述的示例中，对照组大鼠和在压后皮层（RSC）表达设计受体的大鼠被用于一项三阶段行为任务12。任务的第一阶段涉及呈现多个中性刺激，假设对照组大鼠会在其中两个刺激之间形成刺激-刺激关联。工作假说认为RSC对刺激-刺激学习是必需的，因此，在连续4天的条件化过程中，每次行为测试开始前30分钟，对照组和实验组大鼠分别系统性给予设计药物（CNO）或溶剂对照。当CNO与设计受体结合时，会降低表达该受体的神经元的活动。在后续的行为条件化和测试阶段，当假设RSC不再影响学习时，则不再给予CNO，从而不干扰神经活动。

方案中的关键步骤

AAV 化合物的安全操作：药理遗传学方法所涉及的手术操作在技术上并不比简单的立体定位注射更为复杂，但在某些机构使用 AAV 需要实验人员遵守 BSL-2 防护规范。研究人员.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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感谢 Robinson et al.12 的作者们为本实验方案所部分依据的手稿作出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
雄性，Long Evans 大鼠，55-60 日龄Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine病毒载体核心实验室注意：此为 BSL-1 级化合物
rAAV8/hSyn-GFP病毒载体核心实验室注意：此为 BSL-1 级化合物
氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide）R&D Systems4936-10设计药物
大鼠笼盖（聚碳酸酯材质）Alternative Design FT 8XL-PC用于输注后 48-72 小时覆盖动物笼具
滤纸（替换用）Alternative DesignFP-R-1018XAD与笼盖配套使用的滤纸
台式虎钳JETS2201-265用于在通风橱内固定含有 AAV 的微量离心管
生物危害垃圾袋Staples113444Medline 生物危害内衬袋
生物危害垃圾桶Amazon.comUnited Solutions 34 加仑矩形带轮垃圾桶，配挂钩锁紧手柄
异氟烷，100 mlPatterson Veterinary Supply Inc.07-890-8540麻醉剂
双通道小型动物立体定位仪，带数字显示控制台David KopfModel 942手术设备
非穿刺式耳杆（大鼠用，一套两个）David KopfModel 955手术设备
麻醉面罩（大鼠用）David KopfModel 906手术设备
高速立体定位钻，含台式电机控制器、脚踏开关、手柄及立体定位手柄支架David KopfModel 1474手术设备
微型钻头，0.9 mmFine Science Tools Inc19007-09手术耗材
自动微量注射泵，配 micro4 控制器David KopfModel UMP3-1手术设备
Pro-animal 可拆卸陶瓷刀片电推剪套装Ahdis21420手术耗材
聚维酮碘皮肤清洁剂Perdue Products L.P67618-149-04手术耗材
三重抗生素软膏Medline Supply53329-087-01手术耗材
Puralube vet 软膏Only Veterinary Supply17033-211-38手术耗材
Dino-lite显微镜AD7013MTL传统解剖显微镜的替代设备
Dino-lite 刚性台式悬臂支架显微镜MS36B手术设备
28 G 10 μl 注射器Hamilton80308-701SN手术设备
超高度 MDF 隔音屏蔽箱Med Associates, IncENV-018MD22' 宽 × 22" 高 × 16" 深
超高度模块化测试舱Med Associates, IncENV-007行为学设备
不锈钢网格地板Med Associates, IncENV-005行为学设备
笼内照明灯Med Associates, IncENV-215M用作笼内照明及刺激光源
模块化颗粒分配器Med Associates, IncENV-203M-45行为学设备
颗粒接收器，杯型Med Associates, IncENV-200R1M行为学设备
大鼠头部进入检测器Med Associates, IncENV-254-CB行为学设备
无尘精密饲料颗粒，45 mgBio-ServF0165行为学耗材
大鼠实验舱用笼内扬声器Med Associates, IncENV-224AM行为学设备
可编程音频发生器Med Associates, IncANL-926行为学设备
Smart ctrl 8 输入/16 输出模块包Med Associates, IncDIG-716P2行为学设备
大型台式机柜及电源Med Associates, IncSG-6510D行为学设备
PCI 接口模块包Med Associates, IncDIG-700P2-R2行为学设备
Med Intel 核心计算机套装，配 X Pro 19" 显示器Med Associates, IncCOM-103V行为学设备
多聚甲醛（颗粒状），1 kgElectron Microscopy Sciences19210危险：致癌物，需在通风橱内称量
兔单克隆抗体（HA 标签）Cell Signaling Technologies3724S组织学试剂
XP 兔单克隆抗体（GFP）Cell Signaling Technologies2956S组织学试剂
抗兔 IgGCell Signaling Technologies4412S组织学耗材
Superfrost Plus 载玻片VWR international483111-703组织学耗材

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L.

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