本方案描述了食品中1类整合子及其相关基因盒的检测方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
抗生素耐药性是21世纪人类健康面临的最大威胁之一st 21世纪以来，通过水平基因转移获得耐药基因是多种耐药机制传播的主要因素。在介导水平转移的DNA元件中，1类整合子在革兰氏阴性病原菌中广泛传播抗生素耐药决定子方面发挥了关键作用。迄今为止，这些整合子已获取并扩散了超过130种不同的抗生素耐药基因。随着抗生素的持续使用，1类整合子已在人类及其家养动物的共生菌和病原菌中普遍存在。因此，它们如今可出现在所有人源废弃物中，在这些环境中继续获取新的基因，并有可能通过食物链重新进入人体。本方案详细描述了一种利用培养与PCR技术检测食品中1类整合子及其相关耐药基因盒的简化方法。通过该方案，研究人员能够：采集并制备样品以建立富集培养并筛选1类整合子；分离单个细菌菌落以鉴定整合子阳性菌株；鉴定携带1类整合子的细菌种类；并对这些整合子及其相关基因盒进行表征。
引言
抗生素的发现是20世纪最伟大的科学成就之一th 世纪。然而，抗生素的使用与滥用已导致耐药细菌迅速进化，如今这些耐药菌对公共卫生构成了严重威胁。st 世纪。大多数治疗手段难以应对的耐药菌株不断出现，这使我们可能正步入一个抗菌药物不再有效的时代1,2.
赋予抗生素抗性的遗传机制是一个古老的系统，其出现远早于人类及抗生素选择压力数百万年3移动遗传元件，例如质粒、转座子、基因组岛、整合性接合元件和整合子，可在细菌种内及种间传播抗生素抗性基因（ARG）。4在这些可移动遗传元件中，尽管整合子依赖质粒和转座子实现其在细菌基因组中的移动和插入，但其在抗生素抗性基因（ARG）的传播过程中发挥了核心作用。5. 整合子利用整合子整合酶捕获基因盒，并通过整合子编码的启动子表达这些基因盒6,7 (图1). 整合子基因盒是小型可移动元件，由单个开放阅读框（ORF）组成，其表达产物可赋予对抗生素或消毒剂的抗性81类整合子是从临床分离株中最为常见的整合子5，其中共同获得了超过130种不同的抗生素抗性基因盒9.
1类整合子在与人类相关的共生菌和致病菌中的扩散，导致人类排泄物中含有大量这类....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
生食或轻度烹饪的食物对人类健康最为重要。例如沙拉蔬菜、水果、贝类和甲壳类动物。
1. 样本采集
- 在尽量减少污染的条件下采集样品，并在运输过程中将其存放于独立、洁净的袋子中。采集后，样品应于 4 °C 保存，并在 24 小时内进行处理。
2. 富集培养物的制备
- 水果和蔬菜：
- 将约 10 g 样品放入耐用的塑料袋中。若处理较大的样品，应重点取水果或蔬菜的表皮部分。加入 90 ml 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0），使用桨叶式匀浆器处理 30 秒。若无桨叶式匀浆器，也可手动振荡混合。
- 将液体收集至两个 50 ml 离心管中。在 4,000 × g 条件下离心 7 分钟，使细菌沉淀。
- 小心移去上清液，并将菌体沉淀重悬于 30 ml 无菌的Luria Bertani（LB）培养基中。
- 将培养物置于摇床中过夜培养，分别将一个离心管置于 25 °C，另一个置于 37 °C。培养过程中应以每分钟 200 次振荡（opm）的速度摇动。培养完成后，将菌液储存在 4 °C，待用时取出。
- 海产品：
- 使用无菌镊子解剖出牡蛎的胃或虾类的消化道，并将其放入含有 200 µl 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）的无菌 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
对混合培养物和细菌分离株进行 intI1 的筛选
引物组 HS463a/HS464 PCR 可用于检测 1 类整合子整合酶基因 intI1 的存在（图 1）。该引物组适用于在混合培养物中检测 intI1，也可用于筛选从涂布平板上收获的细菌菌落（图 2）。阳性分离株使用该引物组扩增应产生一条位于 471 bp 的单一强条带（图 3A）。大多数阳性分离株所携带的 intI1 基因来源于人类或其农业和家养动物。这些分离株在使用引物 F165/R476 进行的 PCR 中也应呈阳性，扩增产物为 311 bp 的片段（图 1）。环境来源的 intI1 通常在此第二项检测中呈阴性。
整合子盒式阵列的表征
纯分离物的基因组DNA可用于整合子盒式阵列的表征。与转座子Tn402相.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
整合子及其相关基因盒的鉴定可能是预测新发机会性病原体出现、追踪病原体进入人类食物链途径以及发现新的耐药性和毒力决定因子的关键步骤8,21,26。本文旨在描述一种简化的方法，用于对样本中的1类整合子进行筛查、分析其基因盒阵列，并鉴定其所处的细菌种类。该实验方案的关键步骤包括良好的微生物操作规范，以及防止可能产生假阳性的PCR污染。
本文所述方案可轻松修改，以检测其他具有临床意义的整合子，包括在人类病原体中也发现的2类和3类整合子。该方案还可进一步修改，用于检测来自水体、生物膜、土壤或沉积物中微生物群落的整合子。本技术存在一些局限性，主要源于对细菌细胞培养的依赖。许多环境细菌难以培养，因此本文所述方案无法检测到这些菌种。通过使用不同的细菌培养基配方和延长孵育时间，可扩大可回收菌种的范围。尽管如此，与人类健康相关的主要菌种大多可在本文所述条件下生长。
与使用选择性培养基进行平板培养的技术相比，本方案具有一些优势。无需对单个分离株所携带的耐药决定因子的身份进行假设，即可回收并鉴定新的耐药基因。更广泛而言，该工作流.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无相关利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Michaela Hall、Larissa Bispo 和 Gustavo Tavares 提供的技术支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | 用于所有 PCR 反应 |
| RNAse（来自牛胰的核糖核酸酶 A） | Sigma | R6513-10MG | 用于所有 PCR 反应 |
| HinFI 限制性内切酶 | Promega | R6201 | 用于消化 16S rDNA PCR 产物。该酶附带最适缓冲液和 BSA |
| 100 bp DNA 标准分子量标记 | GE Healthcare | 27400701 | 用作所有琼脂糖凝胶电泳的分子大小标准 |
| GelRed DNA 染料 | Biotium | 41003 | 注意：操作此物质时必须穿戴个人防护装备 |
| 硫氰酸胍 | Life Technologies | AM9422 | 注意：操作此物质时必须穿戴个人防护装备 |
| CLS-TC 溶液 | MP Biomedicals | 6540409 | 基因组 DNA 提取起始阶段使用的重悬溶液 |
| Lysing Matrix E FastPrep 管 | MP Biomedicals | 116914500 | 用于机械破碎细菌细胞壁的离心管。此货号对应每包 500 根的包装，也可购买较小数量 |
| 结合基质 | MP Biomedicals | 116540408 | 用 6 M 硫氰酸胍按 1:5 比例稀释后，用于基因组 DNA 提取方法中 |
| Fast Prep 仪器 | MP Biomedicals | 提供多种型号 | MP Biomedicals 提供多种可选购的 FastPrep 仪器。更多信息请访问 http://www.mpbio.com |
参考文献
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
