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方法文章

筛选食品中的一类整合子及基因盒

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DOI：

10.3791/52889

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2015年6月19日

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

本文内容

摘要

本方案描述了食品中1类整合子及其相关基因盒的检测方法。

摘要

抗生素耐药性是21世纪人类健康面临的最大威胁之一st 21世纪以来，通过水平基因转移获得耐药基因是多种耐药机制传播的主要因素。在介导水平转移的DNA元件中，1类整合子在革兰氏阴性病原菌中广泛传播抗生素耐药决定子方面发挥了关键作用。迄今为止，这些整合子已获取并扩散了超过130种不同的抗生素耐药基因。随着抗生素的持续使用，1类整合子已在人类及其家养动物的共生菌和病原菌中普遍存在。因此，它们如今可出现在所有人源废弃物中，在这些环境中继续获取新的基因，并有可能通过食物链重新进入人体。本方案详细描述了一种利用培养与PCR技术检测食品中1类整合子及其相关耐药基因盒的简化方法。通过该方案，研究人员能够：采集并制备样品以建立富集培养并筛选1类整合子；分离单个细菌菌落以鉴定整合子阳性菌株；鉴定携带1类整合子的细菌种类；并对这些整合子及其相关基因盒进行表征。

引言

抗生素的发现是20世纪最伟大的科学成就之一th 世纪。然而，抗生素的使用与滥用已导致耐药细菌迅速进化，如今这些耐药菌对公共卫生构成了严重威胁。st 世纪。大多数治疗手段难以应对的耐药菌株不断出现，这使我们可能正步入一个抗菌药物不再有效的时代1,2.

赋予抗生素抗性的遗传机制是一个古老的系统，其出现远早于人类及抗生素选择压力数百万年3移动遗传元件，例如质粒、转座子、基因组岛、整合性接合元件和整合子，可在细菌种内及种间传播抗生素抗性基因（ARG）。4在这些可移动遗传元件中，尽管整合子依赖质粒和转座子实现其在细菌基因组中的移动和插入，但其在抗生素抗性基因（ARG）的传播过程中发挥了核心作用。5. 整合子利用整合子整合酶捕获基因盒，并通过整合子编码的启动子表达这些基因盒6,7 (图1). 整合子基因盒是小型可移动元件，由单个开放阅读框（ORF）组成，其表达产物可赋予对抗生素或消毒剂的抗性81类整合子是从临床分离株中最为常见的整合子5，其中共同获得了超过130种不同的抗生素抗性基因盒9.

1类整合子在与人类相关的共生菌和致病菌中的扩散，导致人类排泄物中含有大量这类遗传元件10。据估计，仅在英国，每年通过污水污泥释放的携带1类整合子的细菌数量高达1019个11。因此，目前在野生鸟类、鱼类及其他本土野生动物的微生物群中检测到携带抗生素抗性基因的1类整合子也就不足为奇了12-14。将整合子重新释放到环境中构成了重大的公共卫生威胁，因为新基因盒的获取以及与其他可移动遗传元件的复杂重排仍在持续发生，尤其是在污水处理厂和其他水体环境中15-18。自然环境因而成为新抗性决定因子和机会性致病菌的温床19,20。含有新型整合子的细菌及新的抗生素抗性基因（ARGs）可能通过受污染的水和食物再次回流至人类群体21,22。对环境中抗生素抗性基因的监测是未来理解与管理抗生素耐药性的关键策略之一23。尤其应关注生食或轻微加热处理的食物，因为这类食品在传播新型可移动遗传元件和致病菌方面具有最高风险。

本方案概述了一种用于检测、鉴定和表征食品中1类整合子及其相关基因盒的简化方法（图2）。通过结合培养法与聚合酶链式反应（PCR），可快速检测复杂细菌群落及单个分离菌株中的整合子。文中提供了细菌物种的鉴定方法，以及整合子相关基因盒的结构和序列鉴定方法。该方法适用于多种植物性和动物性食品，并为这两类食品分别提供了典型工作流程示例。

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方案

生食或轻度烹饪的食物对人类健康最为重要。例如沙拉蔬菜、水果、贝类和甲壳类动物。

1. 样本采集

  1. 在尽量减少污染的条件下采集样品，并在运输过程中将其存放于独立、洁净的袋子中。采集后，样品应于 4 °C 保存，并在 24 小时内进行处理。

2. 富集培养物的制备

  1. 水果和蔬菜：
    1. 将约 10 g 样品放入耐用的塑料袋中。若处理较大的样品，应重点取水果或蔬菜的表皮部分。加入 90 ml 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0），使用桨叶式匀浆器处理 30 秒。若无桨叶式匀浆器，也可手动振荡混合。
    2. 将液体收集至两个 50 ml 离心管中。在 4,000 × g 条件下离心 7 分钟，使细菌沉淀。
    3. 小心移去上清液，并将菌体沉淀重悬于 30 ml 无菌的Luria Bertani（LB）培养基中。
    4. 将培养物置于摇床中过夜培养，分别将一个离心管置于 25 °C，另一个置于 37 °C。培养过程中应以每分钟 200 次振荡（opm）的速度摇动。培养完成后，将菌液储存在 4 °C，待用时取出。
  2. 海产品：
    1. 使用无菌镊子解剖出牡蛎的胃或虾类的消化道，并将其放入含有 200 µl 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）的无菌 1.5 ml 离心管中。研磨样品以制成匀浆液。
    2. 向两个无菌的 5 ml 离心管中各加入 5 ml LB 培养基，并分别接种海产品匀浆液。
    3. 将培养物置于摇床中过夜培养，分别将一个离心管置于 25 °C，另一个置于 37 °C。培养过程中应以每分钟 200 次振荡（opm）的速度摇动。培养完成后，将菌液储存在 4 °C，待用时取出。

3. 整合子的筛选培养

注意：本方法中全程采用标准 PCR 方案，使用随酶提供的缓冲液，MgCl2 的终浓度为 2.5 mM。如有需要，Lorenz（2011）24 在本期刊 earlier issue 中已概述了 PCR 优化及故障排除方法。

  1. 煮沸法DNA制备：
    1. 将100 µl富集培养物加入无菌的0.5 ml PCR管中。使用水浴或加热块将样品加热至99 °C，持续10 min。随后在冰上快速冷却2 min。
    2. 以14,000 × g离心5 min，使细胞碎片沉淀。离心后立即将样品放回冰上。DNA样品可于-20 °C保存至使用前，但必须在冰上解冻。
  2. 利用PCR筛选1类整合子：
    注意：来自过夜培养的混合培养物将使用HS463a/HS464 PCR方案（表1）进行1类整合子的检测。
    1. 将所有PCR试剂置于冰上解冻，并远离任何可能的外源DNA污染源。每份样品配制48 µl PCR主混合液，包括阴性对照（表2）。使用带滤芯吸头向各PCR管中加入48 µl PCR主混合液。
    2. 使用带滤芯吸头，向各PCR管中分别加入2 µl解冻的DNA。在PCR扩增仪中运行相应的程序。
    3. 为分析扩增结果，将7 µl PCR产物在含TBE缓冲液（90 mM TRIS-硼酸，2 mM EDTA）的2%琼脂糖凝胶上进行电泳。同时加入分子量标记物，例如100 bp DNA ladder。
    4. 电泳后使用DNA染色剂对凝胶染色，并用紫外透射仪观察结果。需确认阴性对照无扩增产物。若某样品在约470 bp处出现明显条带，则表明该混合培养物中含有携带1类整合子的细菌。接下来将从所有PCR阳性混合培养物中分离纯菌落。

4. 1类整合子单克隆筛选

  1. 连续稀释与涂布平板：
    注意：为了从PCR阳性的混合培养物中分离单菌落，需将混合培养物用磷酸钠缓冲液进行10倍系列稀释，然后涂布平板以获得单菌落。
    1. 取1 ml混合培养物加入到9 ml的0.1 M、pH 7.0磷酸钠缓冲液中，通过倒置混匀。取1 ml该稀释液再加入到另外9 ml磷酸缓冲液中，重复此步骤直至获得10-8的系列稀释度。
    2. 取10-4至10-8稀释度的菌液各100 µl，分别涂布于LB琼脂平板，每个稀释度设两个重复。将平板在与初始混合培养相同的温度下过夜培养。平板可在需要时存放于4 °C，但最好尽快处理单菌落。
  2. 单菌落挑选与煮沸法DNA制备：
    1. 从系列稀释平板上挑选单菌落，尽可能选择不同形态类型的菌落，依据包括菌落大小、形状和颜色等特征。使用无菌牙签从涂布平板上挑取单菌落。
    2. 用牙签接触菌落后，将其转移至含有100 µl无菌水的PCR管中。若需筛选大量菌落，可将菌落制备于微孔板中。用手指捻动牙签，使部分细胞脱落进入水中。
    3. 使用同一根牙签，在LB平板上划线接种该菌落。若每条划线约1 cm长，大量菌落可保存在标记好的平板上。 重复步骤1至3，直至挑选到足够数量的分离株。
    4. 将LB平板在与初始富集培养相同温度下过夜培养。培养物可在需要时存放于4 °C。
    5. 制备细菌悬浮液的DNA时，请按照第3.1节所述步骤操作。对纯培养物裂解液进行筛选时，执行第3.2节所述的HS463a/HS464 PCR。PCR结果为阳性的分离株将用于基因组DNA的制备（第5节）及后续分析。

5. 采用珠磨法提取整合子阳性单菌落的基因组DNA25

  1. 取第4.2节中分离得到的纯培养物样品，接种于5 ml LB液体培养基中。在与初始富集培养相同的温度下振荡培养过夜。
  2. 在4,000 × g离心7分钟，弃上清。将沉淀的细胞重悬于Lysing Matrix E快速研磨管中的1 ml CLS-TC溶液中。使用珠磨仪以5.5 m/sec速度处理样品30秒。
  3. 在14,000 × g离心5分钟，将700 µl上清液转移至无菌的1.5 ml离心管中。
  4. 加入700 µl结合基质（用6 M硫氰酸胍按1:5稀释），室温下混匀5分钟。在14,000 × g离心1分钟，弃去上清液。
  5. 加入800 µl盐-乙醇洗涤液（70%乙醇，0.1 M醋酸钠），涡旋振荡至沉淀完全重悬。室温下洗涤5分钟，在14,000 × g离心1分钟，弃去上清液。确保彻底去除所有上清液，必要时使用微量移液器吸除，然后室温晾干5分钟。
  6. 用移液器反复吹打，将沉淀基质重悬于200 µl TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.6）中。室温孵育3分钟。在14,000 × g离心3分钟，将160 µl洗脱的DNA转移至无菌离心管中。取部分基因组DNA提取物在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳，以检测DNA提取的产量和完整性。纯化的基因组DNA储存于-20 °C，进行PCR检测时置于冰上解冻使用。

6. 诊断性 PCR 与 DNA 测序

注意：第5部分制备的基因组DNA将用于所有诊断性PCR，并用于确认1类整合子的阳性检测结果。

  1. 将基因组 DNA 置于冰上解冻，短暂涡旋混匀 DNA 样品，并在 14,000 × g 条件下瞬时离心 20 秒。使用引物 HS463a/HS464（表 1）重复 PCR 扩增 1 类整合子整合酶基因，确认该分离株可扩增出 471 bp 的产物（第 3.2 节）。
  2. 通过小亚基核糖体 RNA 基因（16S rDNA）分析，可将阳性培养物鉴定至物种水平。使用引物 f27/r1492（表 1）扩增 16S 基因，通过电泳检测 PCR 产物。所有细菌目标均应产生约 1450 bp 的 16S 扩增片段。
  3. 对 16S rRNA 基因扩增产物进行测序以确定物种身份；但由于第 6.2 步可能获得多个阳性 PCR 产物，且其中许多阳性结果可能属于同一种细菌，因此我们首先通过 16S PCR 产物的限制性酶切来区分不同物种。
    1. 取 16S PCR 产物的等分试样，用限制性内切酶 Hinf1 进行酶切。任何识别 4 bp 切割位点的酶均可使用，但 Hinf1 对 16S 目标序列能产生良好的多态性，且是一种可靠且经济的酶。
  4. 在无菌离心管中配制 30 µl 限制性酶切主混合液（表 2），加入 20 µl 未经纯化的 16S PCR 产物。于 37 °C 水浴中过夜孵育。用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
  5. 分析 Hinf1 产生的酶切图谱。具有相同 16S 限制性图谱的分离株很可能属于同一物种。无需对每个 16S PCR 产物进行测序，每种 Hinf1 酶切图谱最多选择三个代表性样本进行测序即可。
  6. 使用 commercial kit 纯化 16S PCR 产物。可使用单链核酸外切酶试剂盒，但基于柱纯化或沉淀的方法也能有效去除未掺入的引物和单链 DNA。使用引物 r910（表 1）对 16S 扩增子进行测序，反应体系的设置应符合测序机构的要求。
  7. 利用所得 DNA 序列，通过 blastn 功能在 NCBI DNA 数据库中进行比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。通常认为核苷酸序列相似性超过 97% 即可判定为同一种物种。

7. 整合子和基因盒阵列的作图与表征

注意：来自人类主导生态系统的1类整合子可能是您所有样本中最常见的整合子类型。这些整合子均具有较近的单一来源，因此其DNA序列高度保守5。

  1. 通过使用引物组 intI1F165/intI1R47610（表1）进行 PCR，区分来源于人类样本的 1 类整合子与在环境样本中自然存在的 1 类整合子。
    注意：来自临床或共生细菌的 1 类整合子将产生约 300 bp 的扩增产物，而环境来源的 1 类整合子则不会产生任何扩增产物。
  2. 使用引物组 HS458/HS459 扩增盒式阵列，以对临床型整合子进行表征。该 PCR 可扩增 intI1 与大多数盒式阵列末端的 3’ 保守区之间的区域。由于盒式元件的数量和种类具有可变性，PCR 产物的大小也会有所不同。
  3. 纯化扩增产物，并使用各自的扩增引物对 DNA 进行测序。利用 blastn 功能（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将测序结果比对至 DNA 数据库。
  4. 确保盒式基因的命名遵循标准化的命名规范9，因为许多整合子基因盒的数据提交使用了不一致或模糊的名称。应特别关注新发现的基因盒，因其可能编码新的表型，包括赋予增强的传播性、致病性或毒力的基因8,21。
    注意：1 类整合子的临床前形式仍在自然环境中传播。特别是与活跃的 Tn402 转座子相关的类型最受关注26。这些整合子的盒式阵列无法通过引物组 HS458/HS459 扩增，但可使用 MRG284/MRG285 引物组（表1）进行扩增，所得扩增产物的大小因盒式元件组成不同而异。扩增产物应按照 7.2 节所述方法进行纯化和 DNA 测序。

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结果

对混合培养物和细菌分离株进行 intI1 的筛选

引物组 HS463a/HS464 PCR 可用于检测 1 类整合子整合酶基因 intI1 的存在（图 1）。该引物组适用于在混合培养物中检测 intI1，也可用于筛选从涂布平板上收获的细菌菌落（图 2）。阳性分离株使用该引物组扩增应产生一条位于 471 bp 的单一强条带（图 3A）。大多数阳性分离株所携带的 intI1 基因来源于人类或其农业和家养动物。这些分离株在使用引物 F165/R476 进行的 PCR 中也应呈阳性，扩增产物为 311 bp 的片段（图 1）。环境来源的 intI1 通常在此第二项检测中呈阴性。

整合子盒式阵列的表征

纯分离物的基因组DNA可用于整合子盒式阵列的表征。与转座子Tn402相...

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讨论

整合子及其相关基因盒的鉴定可能是预测新发机会性病原体出现、追踪病原体进入人类食物链途径以及发现新的耐药性和毒力决定因子的关键步骤8,21,26。本文旨在描述一种简化的方法，用于对样本中的1类整合子进行筛查、分析其基因盒阵列，并鉴定其所处的细菌种类。该实验方案的关键步骤包括良好的微生物操作规范，以及防止可能产生假阳性的PCR污染。

本文所述方案可轻松修改，以检测其他具有临床意义的整合子，包括在人类病原体中也发现的2类和3类整合子。该方案还可进一步修改，用于检测来自水体、生物膜、土壤或沉积物中微生物群落的整合子。本技术存在一些局限性，主要源于对细菌细胞培养的依赖。许多环境细菌难以培养，因此本文所述方案无法检测到这些菌种。通过使用不同的细菌培养基配方和延长孵育时间，可扩大可回收菌种的范围。尽管如此，与人类健康相关的主要菌种大多可在本文所述条件下生长。

与使用选择性培养基进行平板培养的技术相比，本方案具有一些优势。无需对单个分离株所携带的耐药决定因子的身份进行假设，即可回收并鉴定新的耐药基因。更广泛而言，该工作流...

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披露

作者无相关利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Michaela Hall、Larissa Bispo 和 Gustavo Tavares 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GoTaq Colourless MastermixPromegaM7132用于所有 PCR 反应
RNAse（来自牛胰的核糖核酸酶 A）SigmaR6513-10MG用于所有 PCR 反应
HinFI 限制性内切酶PromegaR6201用于消化 16S rDNA PCR 产物。该酶附带最适缓冲液和 BSA
100 bp DNA 标准分子量标记GE Healthcare27400701用作所有琼脂糖凝胶电泳的分子大小标准
GelRed DNA 染料Biotium41003注意：操作此物质时必须穿戴个人防护装备
硫氰酸胍Life TechnologiesAM9422注意：操作此物质时必须穿戴个人防护装备
CLS-TC 溶液MP Biomedicals6540409基因组 DNA 提取起始阶段使用的重悬溶液
Lysing Matrix E FastPrep 管MP Biomedicals116914500用于机械破碎细菌细胞壁的离心管。此货号对应每包 500 根的包装，也可购买较小数量
结合基质MP Biomedicals116540408用 6 M 硫氰酸胍按 1:5 比例稀释后，用于基因组 DNA 提取方法中
Fast Prep 仪器MP Biomedicals提供多种型号MP Biomedicals 提供多种可选购的 FastPrep 仪器。更多信息请访问 http://www.mpbio.com

参考文献

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4(2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865(2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017(2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

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