介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。
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摘要
摘要
不含任何病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）因其高达35 kb的包装容量、低免疫原性和低毒性，被认为是目前最先进的基因递送载体之一。然而，由于载体基因组构建和病毒生产的流程较为复杂，许多实验室在使用HCAdV时面临困难。本文介绍了一种基于包含HCAdV基因组的质粒pAdFTC，高效克隆并生产HCAdV的详细实验方案。HCAdV基因组的构建依赖于一种利用归巢内切酶（I-CeuI 和 PI-SceI）的克隆载体系统。任何大小不超过14 kb的目的基因均可亚克隆至穿梭载体pHM5中，该载体包含一个两侧分别由I-CeuI 和 PI-SceI 限定的多克隆位点。在通过I-CeuI 和 PI-SceI 介导将目的基因从穿梭载体上释放后，可将其插入HCAdV克隆载体pAdFTC中。由于pAdFTC质粒尺寸较大，且所用酶具有较长的识别位点并伴随强烈的DNA结合特性，因此需谨慎操作克隆片段。在病毒生产过程中，通过NotI 消化释放HCAdV基因组，并将其转染至稳定表达Cre重组酶的HEK293来源的生产细胞系中。为提供腺病毒扩增所需的所有腺病毒基因，需使用一种包装信号两侧带有loxP位点的辅助病毒进行共感染。载体的预扩增在贴壁生长的生产细胞中进行，而大规模扩增则在悬浮培养的生产细胞中通过旋转瓶完成。病毒纯化过程包括两个基于氯化铯梯度的超速离心步骤，随后进行透析。本文汇总了近年来在使用该HCAdV载体系统过程中积累的经验、技巧和优化方法。
引言
在基因治疗应用中，避免由病毒蛋白、目的基因本身或输入的病毒蛋白表达所引起的细胞毒性和免疫原性副作用至关重要。腺病毒载体（AdV）被广泛用于将外源DNA导入多种细胞中，以研究目的基因表达的影响1,2。其中最先进的版本是完全缺失所有病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）3,4，其包装容量可达35 kb，同时具有低免疫原性和低毒性5-8。由于其高包装容量，可利用单次剂量的载体递送大片段或多个目的基因，因此成为科研领域的重要工具。
与可使用商业试剂盒轻松制备的缺失早期基因E1和/或E3的第一代或第二代腺病毒（AdV）不同，高容量腺病毒（HCAdV）的载体基因组构建和病毒制备更为复杂。HCAdV基因组的构建系统基于质粒pAdFTC和穿梭质粒pHM59-12，其中pAdFTC携带一个缺失所有病毒编码序列的HCAdV基因组。任何大小不超过14千碱基（kb）的目的基因均可克隆至穿梭载体pHM5中，该载体的多克隆位点两侧分别为归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI的识别/切割位点。因此，可通过连续使用PI-SceI和I-CeuI进行酶切，将克隆的目的基因释放出来，并定向插入至pAdFTC质粒所携带的HCAdV基因组中相应的限制性酶切位点。在pAdFTC中，位于PI-SceI和I-CeuI切割位点....
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方案
1. 基于质粒pAdFTC构建重组HCAdV基因组
注意：所有质粒此前已有描述11,12，可根据要求获取。克隆流程在图1中示意图所示。
- 将目的基因（GOI）及其启动子和多聚腺苷酸化信号（pA）通过任意克隆策略插入穿梭质粒pHM5中，构建获得pHM5-GOI。
注意：由于 pAdFTC 是一种相对较大的质粒，建议采用经典质粒制备方法，避免使用基于硅胶膜的商业质粒纯化试剂盒，以免质粒 DNA 发生剪切。Ceu我 和 PI-Sce我与DNA紧密结合，并改变消化后DNA的电泳迁移率。因此，在琼脂糖凝胶电泳前，必须进行苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀（步骤1.3）。 - 消化 20 µg pHM5-GOI 和 10 µg pAdFTC I-CeuI (10 U) 37 °C 下反应 3 小时，总体积为 100 µl，以线性化质粒（分别约为 2.8 kb + 目的基因 ORF 序列和约 31 kb）。
- 使用酚-氯仿抽提法纯化线性化质粒，随后进行乙醇（EtOH）沉淀 13.
- 加入100 µl苯酚:氯仿:异戊醇，轻轻翻转离心管数次以混匀。在15,000 x g条件下离心2分钟。
- 将上清液转移至新离心管中，加入20 µl乙酸钠（pH 5....
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结果
此处展示了HCAdV制备物的克隆、扩增和纯化的代表性示例。提供了克隆策略的概览（图1），以及通过限制性内切酶消化进行HCAdV基因组克隆和释放的代表性示例（图2）。展示了将目的基因（GOI）表达盒从pHM5质粒中用PI-SceI和I-CeuI酶切后，经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀（另见步骤1.2–1.5）所得的典型限制性酶切图谱（图2A）。通常可观察到一条约3 kb的条带，对应于pHM5质粒骨架，以及另一条对应于GOI表达盒的条带。随后从琼脂糖凝胶中纯化含有GOI表达盒的条带。将纯化的GOI表达盒与经PI-SceI和I-CeuI分别酶切并去磷酸化的pAdVFTC质粒（步骤1.7）一同进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确认其正确大小，并估算后续连接反应中分子的相对含量（图2B）。连接反应完成后（见步骤1.8），经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀，并用SwaI酶切以去除未切割的.......
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讨论
本文所述方案基于人5型腺病毒（human adenovirus type 5），采用此前已报道的方法对高容量腺病毒载体（HCAdV）进行纯化 4,12pAdFTC 质粒中的 HCAdV 基因组缺失了所有腺病毒基因，仅保留 5'-和 3'-ITRs 以及包装信号。在此策略中，HV AdNG163R-2 4 提供高效病毒生产所需的全部必要基因 在转染中。这提供了高达 35 kb 的包装容量，明显优于第一代和第二代腺病毒（AdV）或广泛使用的慢病毒（LV）或腺相关病毒（AAV）载体。HCAdV 的第二个优势，尤其对于 体内 与第一代或第二代腺病毒载体相比，其应用优势在于表达病毒蛋白所导致的细胞毒性和免疫原性副作用显著降低 5-8.
然而，与LV或AAV载体以及第一代或第二代AdV载体相比，此处所述方案在时间和工作量上更为密集。主要障碍在于大尺寸转基因的克隆及其随后向病毒生产质粒pAdV-FTC的转移。利用归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI可实现从穿.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）资助项目 EH 192/5-1（A.E.）、欧盟（E-rare-2）项目 Transposmart（A.E.）、乌普萨拉大学医院研究基金（UWH Forschungsförderung）（E.S. 和 W.Z）、维滕/黑尔德克大学博士培养计划（P.B.）提供支持。J.L. 获得中国国家留学基金管理委员会奖学金资助，T.B. 和 M.G. 获得Else Kröner-Fresenius基金会（EKFS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | 限制性酶切 |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | 限制性酶切 |
| T4 连接酶 | New England Biolabs | M0202S | 连接反应 |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | 限制性酶切 |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | 限制性酶切 |
| 小牛肠碱性磷酸酶（CIP） | New England Biolabs | M0290S | 酶切质粒的去磷酸化 |
| 潮霉素B | PAN Biotech | P02-015 | CRE表达116细胞的筛选 |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | HEK293T细胞培养基 |
| 最低必需培养基（MEM）Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116细胞培养基 |
| Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS） | PAN Biotech | P04-36500 | 细胞洗涤、细胞重悬 |
| 250 ml储存瓶 | Sigma | CLS430281-24EA | 悬浮培养116细胞的感染 |
| 500 ml聚丙烯离心管 | Sigma | CLS431123-36EA | 从悬浮培养物中沉淀细胞 |
| 旋转培养瓶 | Bellco | 1965-61030 | 悬浮培养116细胞 |
| 超透明超速离心管 | Beckman Coulter | 344059 | 密度梯度离心 |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | 密度梯度离心 | |
| SW-41转子 | Beckman Coulter | 密度梯度离心 | |
| Spectrum Laboratories Spectrapor透析膜 | VWR | 132129 | 透析管 |
| 即用型透析夹片 | Thermo | 66383 | 透析 |
| 单次使用DH10B电转化感受态E. coli | Invitrogen | C4040-52 | 连接反应的转化 |
| PureYield质粒中量提取系统 | Promega | A2495 | 中量质粒提取 |
| peqGOLD组织DNA小量提取试剂盒 | Peqlab | 12-3396-02 | 基因组DNA提取 |
| SuperFect转染试剂 | Qiagen | 301305 | 116细胞的转染 |
| opti MEM（10% FBS） | Gibco | 31985-062 | 116细胞的转染 |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | BioRad | qPCR仪 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇 | Carl Roth | A156.1 | DNA纯化 |
| 氯化铯 | Carl Roth | 8627.1 | 密度梯度离心 |
| 乙酸钠 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA沉淀 |
| LB培养基 | Carl Roth | X968.3 | 细菌生长培养基 |
| 乙醇 99.8%纯度 | Carl Roth | 9065.5 | DNA沉淀与洗涤 |
| SDS 99.5% | Carl Roth | 2326.2 | 裂解 缓冲液 |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | 裂解 缓冲液 |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | 透析缓冲液/裂解 缓冲液 |
| 甘油 99.5% | Carl Roth | 3783.1 | 透析缓冲液 |
| MgCl2 98.5% | Carl Roth | KK36.2 | 透析缓冲液 |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | 可选透析缓冲液 |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | 可选透析缓冲液 |
| 蔗糖 | Carl Roth | 9286.1 | 可选透析缓冲液 |
| Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | 4984.2 | 可选透析缓冲液 |
| 1.5 ml离心管 | Sarstedt | 72,730,005 | 病毒制备物在-80 °C下的储存 |
参考文献
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al.
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