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方法文章

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

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DOI：

10.3791/52894

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2016年1月28日

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1Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

本文内容

摘要

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。

摘要

不含任何病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）因其高达35 kb的包装容量、低免疫原性和低毒性，被认为是目前最先进的基因递送载体之一。然而，由于载体基因组构建和病毒生产的流程较为复杂，许多实验室在使用HCAdV时面临困难。本文介绍了一种基于包含HCAdV基因组的质粒pAdFTC，高效克隆并生产HCAdV的详细实验方案。HCAdV基因组的构建依赖于一种利用归巢内切酶（I-CeuI 和 PI-SceI）的克隆载体系统。任何大小不超过14 kb的目的基因均可亚克隆至穿梭载体pHM5中，该载体包含一个两侧分别由I-CeuI 和 PI-SceI 限定的多克隆位点。在通过I-CeuI 和 PI-SceI 介导将目的基因从穿梭载体上释放后，可将其插入HCAdV克隆载体pAdFTC中。由于pAdFTC质粒尺寸较大，且所用酶具有较长的识别位点并伴随强烈的DNA结合特性，因此需谨慎操作克隆片段。在病毒生产过程中，通过NotI 消化释放HCAdV基因组，并将其转染至稳定表达Cre重组酶的HEK293来源的生产细胞系中。为提供腺病毒扩增所需的所有腺病毒基因，需使用一种包装信号两侧带有loxP位点的辅助病毒进行共感染。载体的预扩增在贴壁生长的生产细胞中进行，而大规模扩增则在悬浮培养的生产细胞中通过旋转瓶完成。病毒纯化过程包括两个基于氯化铯梯度的超速离心步骤，随后进行透析。本文汇总了近年来在使用该HCAdV载体系统过程中积累的经验、技巧和优化方法。

引言

在基因治疗应用中，避免由病毒蛋白、目的基因本身或输入的病毒蛋白表达所引起的细胞毒性和免疫原性副作用至关重要。腺病毒载体（AdV）被广泛用于将外源DNA导入多种细胞中，以研究目的基因表达的影响1,2。其中最先进的版本是完全缺失所有病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）3,4，其包装容量可达35 kb，同时具有低免疫原性和低毒性5-8。由于其高包装容量，可利用单次剂量的载体递送大片段或多个目的基因，因此成为科研领域的重要工具。

与可使用商业试剂盒轻松制备的缺失早期基因E1和/或E3的第一代或第二代腺病毒（AdV）不同，高容量腺病毒（HCAdV）的载体基因组构建和病毒制备更为复杂。HCAdV基因组的构建系统基于质粒pAdFTC和穿梭质粒pHM59-12，其中pAdFTC携带一个缺失所有病毒编码序列的HCAdV基因组。任何大小不超过14千碱基（kb）的目的基因均可克隆至穿梭载体pHM5中，该载体的多克隆位点两侧分别为归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI的识别/切割位点。因此，可通过连续使用PI-SceI和I-CeuI进行酶切，将克隆的目的基因释放出来，并定向插入至pAdFTC质粒所携带的HCAdV基因组中相应的限制性酶切位点。在pAdFTC中，位于PI-SceI和I-CeuI切割位点之间的外源基因插入位点两侧含有填充DNA（stuffer DNA）以及基因组包装所必需的非编码腺病毒序列，包括两端的5'和3'反向末端重复序列（ITRs）以及5'ITR下游的包装信号。额外的填充DNA可使最终的HCAdV基因组大小维持在27至36 kb的适宜范围内，从而确保病毒制备过程中高效的基因组包装。由于pAdFTC是一个最大可达45 kb的大质粒（具体大小取决于插入的外源基因长度），且归巢内切酶具有较长的DNA识别序列并表现出强烈的DNA结合能力，因此在将外源基因从pHM5转移至pAdFTC的过程中，需要进行多次纯化步骤。操作时应谨慎，避免施加剪切力。

HCAdV 基因组的 ITR 两侧分别带有 NotI 限制性内切酶识别位点，这些位点位于 5'ITR 的正上游和 3'ITR 的正下游12。因此，可通过 NotI 酶切释放 HCAdV，随后将病毒基因组转染至 HCAdV 生产细胞系中。需要注意的是，使用限制性内切酶 NotI 从质粒 pAdFTC 中释放病毒基因组，意味着所插入的转基因序列中不能含有 NotI 的 DNA 识别位点。基于 HEK293 细胞的生产细胞（116 细胞）可稳定表达 Cre 重组酶。在病毒扩增过程中，116 细胞需与一种辅助病毒（HV）共感染，该辅助病毒以反式提供腺病毒复制和包装所需的所有基因in trans3,4。该辅助病毒是一种第一代腺病毒，其包装信号两侧带有 loxP 位点（floxed packing signal），在病毒扩增过程中，由 116 细胞表达的 Cre 重组酶将其切除4。这一机制可确保主要被衣壳化的基因组为含有完整包装信号的 HCAdV 基因组。

通过在培养皿表面培养的116细胞中连续传代来实现HCAdV的预扩增。每次传代后，通过进行三次连续的冻融步骤，从感染的细胞中释放病毒颗粒。每次传代时，使用上一代细胞裂解液的1/3感染数量逐渐增加的细胞。最后，使用最后一次预扩增步骤获得的裂解液感染在旋转瓶中悬浮培养的生产细胞，以进行大规模扩增。通过在氯化铯密度梯度中进行超速离心，从悬浮细胞中纯化病毒颗粒4,12。在此过程中，空颗粒和完整组装的颗粒分离为两条不同的条带。为进一步浓缩HCAdV颗粒，进行第二次非梯度超速离心步骤。随后收集含有HCAdV的条带，并在生理缓冲液中透析。最终的载体制剂需检测绝对病毒颗粒数、感染性颗粒数以及HV污染水平。绝对病毒颗粒数可通过裂解病毒颗粒后测定260 nm处的吸光度，或通过定量实时PCR（qPCR）来确定12。纯化病毒颗粒的感染性可通过qPCR测定感染后3小时细胞内存在的HCAdV基因组来评估。

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方案

1. 基于质粒pAdFTC构建重组HCAdV基因组

注意：所有质粒此前已有描述11,12，可根据要求获取。克隆流程在图1中示意图所示。

  1. 将目的基因（GOI）及其启动子和多聚腺苷酸化信号（pA）通过任意克隆策略插入穿梭质粒pHM5中，构建获得pHM5-GOI。
    注意：由于 pAdFTC 是一种相对较大的质粒，建议采用经典质粒制备方法，避免使用基于硅胶膜的商业质粒纯化试剂盒，以免质粒 DNA 发生剪切。Ceu我 和 PI-Sce我与DNA紧密结合，并改变消化后DNA的电泳迁移率。因此，在琼脂糖凝胶电泳前，必须进行苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀（步骤1.3）。
  2. 消化 20 µg pHM5-GOI 和 10 µg pAdFTC I-CeuI (10 U) 37 °C 下反应 3 小时，总体积为 100 µl，以线性化质粒（分别约为 2.8 kb + 目的基因 ORF 序列和约 31 kb）。
  3. 使用酚-氯仿抽提法纯化线性化质粒，随后进行乙醇（EtOH）沉淀 13.
    1. 加入100 µl苯酚:氯仿:异戊醇，轻轻翻转离心管数次以混匀。在15,000 x g条件下离心2分钟。
    2. 将上清液转移至新离心管中，加入20 µl乙酸钠（pH 5，3 M）和400 µl冰冻乙醇（99.8%），充分混匀悬浮液。在15,000 × g条件下离心10分钟。
    3. 去除上清液，加入 300 µl 70% EtOH，在 15,000 x g 离心 2 分钟。然后去除上清液，将 DNA 沉淀在空气中干燥。将沉淀溶解于 10–20 µl dH₂O 中。2O. 不要将DNA沉淀干燥过久，否则DNA将更难溶解。
  4. 消化 I-Ceu我 -消化的 pHM5-GOI 和 pAdFTC 质粒（来自步骤 1.3）孵育至少 3 小时或过夜 使用限制性内切酶PI-SceI（10 U）于37 °C在50 µl总体积中反应，随后纯化 I-CeuI 和 PI-Sce使用酚-氯仿抽提法消化质粒，随后进行乙醇沉淀（见步骤1.3）。将DNA溶解于20 µl无核酸酶的dH₂O中2O.
  5. 在制备型琼脂糖凝胶上分离pHM5质粒骨架（2.8 kb）和目的基因片段（来自步骤1.4），并使用商用凝胶回收与PCR纯化试剂盒对目的基因片段进行凝胶纯化。消化产物的代表性琼脂糖凝胶电泳结果如图所示 图2A.
  6. 去磷酸化 I-Ceu我 和 PI-Sce将步骤1.4中I-digested的pAdFTC在总体积25 µl的体系中，用牛小肠碱性磷酸酶CIP（10 U）于37 °C处理1小时，随后通过酚-氯仿抽提及后续乙醇沉淀（步骤1.3）纯化去磷酸化的质粒pAdFTC。用20 µl无核酸酶的dH₂O洗脱DNA2O.
  7. 从去磷酸化的pAdFTC质粒（步骤1.6）和纯化的GOI片段（步骤1.5）中各取一份进行分析性凝胶电泳，以检测酶切是否完全，并确认预期片段的大小是否正确（线性化pAdFTC约为31 kb）。
    注意：GOI 的大小取决于转基因表达盒的大小。估算后续连接所需各片段的相对浓度。图中显示了纯化后片段的代表性琼脂糖凝胶电泳结果。 图2B.
  8. 在总体积为 20 µl 的反应体系中进行连接反应，使用 400 U 的 T4 DNA 连接酶，载体与插入片段的摩尔比为 1:3。
    注意：与所示琼脂糖凝胶一致 图2B 我们通常在20 µl的总体积中进行连接反应，包含2–6 µl载体、8–12 µl插入片段和400 U的T4 DNA连接酶。由于经过多次酚抽提步骤后DNA浓度通常较低，应尽可能使用较多的DNA，以避免额外添加H2O 需加入以达到终体积 20 µl。在 16 °C 过夜连接，随后进行苯酚-氯仿抽提，再进行乙醇沉淀（步骤 1.3）。
    1. 在15 µl无核酸酶的dH2O中洗脱DNA2O，并用限制性内切酶消化纯化的连接反应产物 SwaI (10 U) 25 °C 下反应 2 小时，总体积为 20 µl。然后通过苯酚-氯仿抽提 followed by 乙醇沉淀（步骤 1.3）浓缩并纯化 DNA。用 10 µl 无核酸酶的 dH₂O 洗脱 DNA2O.
  9. 转化2 µl纯化的产物 斯瓦将连接产物通过电穿孔转化至DH10B或DH5α电转感受态细胞中 E. coli 在含氨苄青霉素的LB平板（50 mg/ml氨苄青霉素）上于37 °C培养16–24小时，筛选克隆。挑选5–10个克隆，采用碱裂解法提取质粒DNA，随后进行苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀（步骤1.3）。 13.
  10. 对质粒小量制备物进行分析性酶切消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳，以检测DNA片段的大小。建议使用的限制性内切酶例如I-Ceu我与PI-Sce我释放插入片段， 光谱我或 HincII图2C).
  11. 在含有氨苄青霉素的LB培养基（50 mg/ml 氨苄青霉素）中扩增正确的克隆，并使用任意 commercially available 质粒纯化试剂盒进行中量或大量质粒制备。

2. 从pAdFTC质粒中释放HCAdV基因组及在生产细胞系116中预扩增HCAdV载体

  1. 消化20 µg含有步骤1.11中克隆的目的基因的基于pAdFTC的腺病毒生产质粒 在总体积为100 µl的条件下使用 不I（20 U）于 37 °C 处理 >2小时，进行两次酚-氯仿抽提，随后乙醇沉淀。溶于20-30 µl无菌dH₂O中。2O.
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳检测1:10稀释的消化后pAdFTC-GOI-DNA等分试样。可观察到一条9 kb的条带，对应质粒骨架；根据目的基因（GOI）的大小，还可观察到第二条DNA条带，对应HCAdV基因组（大小：28–36 kb）。
    注意：一个具有代表性的示例 不I digest 显示在 图2D线性化DNA可在4 °C下保存数天，或在-20 °C下保存数周。
  3. 在开始本方案之前，请确保辅助病毒 AdNG163R-2 已经扩增完毕 4.
    注意转染了由pAdFTC衍生的HCAdV载体的细胞属于基因改造生物，被归类为生物安全等级2级（BSL-2），请采取适当的 containment 措施和废弃物处理措施，包括使用个人防护装备，并在BSL-2级层流罩内操作。
  4. 在添加了10%胎牛血清和潮霉素B（100 µg/ml）的MEM eagle培养基中培养116细胞。接种低代次（低于第10代）的116细胞（约0.4 x 10⁶）6 在转染前一天，将细胞接种于60 mm组织培养皿中，使其在次日达到50–80%汇合度。
  5. 转染第2.1步中线性化的HCAdV基因组 通过使用钙磷酸盐转染或其他市售转染试剂等方法，转入116个细胞图3A转染后16-18小时，小心吸除培养基，加入3 ml新鲜培养基（MEM，5% FBS），并用HV AdNG163R-2感染细胞 4 每个细胞应用5个转导单位（TU）（因为一个汇合的60 mm组织培养皿含有约3.2 × 10）6 细胞，加入约 1.6 × 107 HV的TU。
    1. 感染后第一小时内，每隔20分钟轻轻晃动培养皿一次，以确保HV分布均匀。将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养。2若病毒扩增效率高，可在感染后48小时观察到由病毒复制引起的细胞病变效应（CPE），表现为细胞变圆、贴壁松散或从培养皿上脱落。若CPE出现时间早于48小时，需减少辅助病毒（HV）用量；若CPE出现较晚，则需增加辅助病毒用量。
  6. 感染后48小时，用培养基冲洗培养皿上的细胞以收集包括上清液在内的细胞。悬浮在培养基中的细胞称为第0代（P0）。将P0细胞分成两份。
    1. 取0.5 ml已解离的细胞，以2,000 × g离心3分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀，用于后续基因组DNA（gDNA）的提取，以进行基于qPCR的扩增过程分析。将细胞沉淀于-20 °C保存，直至进一步处理。
    2. 将悬浮于培养基中的2.5 ml解离细胞反复冻融3至4次（在-80 °C或液氮中冷冻，在室温或37 °C水浴中解冻），以释放病毒颗粒。该组分随后称为P0裂解液。
  7. 确保已准备好生长至90–95%汇合度的含116细胞的组织培养皿，细胞使用添加了FBS（10%）和潮霉素B（100 µg/ml）的MEM培养基并在HV条件下培养，用于后续传代步骤。
  8. 将1 ml新鲜培养基（MEM，5% FBS）与前一步骤（2.6.2）中获得的2.5 ml裂解液混合，终体积为3.5 ml，加入HV，按每细胞2 TU量加入（因为一个汇合度为90–95%的60 mm组织培养皿约含有3.2 × 10⁶个细胞）6 细胞，加入约 6.4 × 106 HV 的 TU）。图3B)。小心吸出 116 细胞的 60-mm 培养皿中的培养基，加入病毒混合液。重复步骤 2.6–2.8 两次以获得第1代和第2代裂解物。
  9. 将17.5 ml新鲜培养基（MEM，含5% FBS）与P2代裂解液2.5 ml混合，并加入慢病毒，按每细胞2 TU的量加入（由于80–100%融合度的150 mm组织培养皿约含有~2 x 107 细胞，加入约 4 x 107 HV的TU）。从150 mm培养皿中吸出116细胞的培养基，加入病毒混合物感染细胞。将感染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2.
  10. 感染后48小时，按照步骤2.6所述收获细胞 以获得第3代细胞（P3）图3B).
    1. 重复步骤 2.6.1。
    2. 从剩余的19.5 ml P3中，通过将重悬的细胞反复冻融3–4次以释放病毒颗粒。此组分随后称为P3裂解液。
      注意： 某些载体最终可能需要在150毫米培养皿中进行额外的传代，直至其扩增至足够水平。因此，在连续传代过程中需监测预扩增过程的效率。可按照第3节所述方法进行基于qPCR的扩增过程分析（另见 图 4A携带绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的HCAdV的预扩增可通过荧光显微镜观察GFP荧光信号进行简便评估（图4B).

3. 使用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）监测扩增过程（另见图4A）。

  1. 使用任何商业化的基因组DNA（gDNA）提取试剂盒或其他选定方法，从预扩增各代次细胞沉淀（步骤2.6–2.10）中提取gDNA。为获得最佳PCR结果，应尽可能使用新鲜的gDNA；否则可将gDNA储存于-20 °C，待后续使用。
  2. 为通过qPCR分析确定相应代次细胞中HCAdV基因组的数量，需使用含有HCAdV基因组中目的基因（GOI）的质粒，制备含101–109拷贝的标准曲线。
  3. 取P0至P3代（步骤2.6–2.10）等量的gDNA，采用针对HCAdV基因组中目的基因（GOI）的特异性引物（终浓度400 nM）进行qPCR分析。qPCR操作请遵循相应qPCR试剂生产商的说明书。qPCR程序设置如下：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环的扩增反应，每个循环包括95 °C变性10秒、55–60 °C退火15秒、72 °C延伸20秒。根据标准曲线可推算出反应中HCAdV基因组的数目。

4. 在悬浮培养的116细胞中大规模扩增HCAdV载体

  1. 向一个3-L 旋转培养瓶中加入900 ml预热（37 °C）的新鲜MEM培养基，培养基中需添加10% FBS和潮霉素B（100 µg/ml）（图3B）。
  2. 从至少10个150-mm组织培养皿中移除培养基，这些培养皿中的116细胞应达到90–100%的融合度，使用移液管加入10 ml预热（37 °C）的新鲜MEM培养基（含10% FBS和100 µg/ml潮霉素B）冲洗细胞。反复吹打数次以获得均匀的细胞悬液。立即将细胞直接转移至步骤4.1中已含有900 ml培养基的旋转培养瓶中。
    注意：请勿使用胰蛋白酶/EDTA，因其可能对悬浮细胞的生长产生不利影响。移除培养基后应立即转移细胞至旋转培养瓶中。每次操作不要超过两个组织培养皿。加入新鲜培养基后等待时间越长，细胞从培养皿表面脱落就越困难。
  3. 为确保细胞最佳生长，将旋转培养瓶置于磁力搅拌器上，在组织培养孵育箱中于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。将磁力搅拌器转速调节至70 rpm，以防止细胞贴附于玻璃表面。
  4. 监测旋转培养瓶中的细胞生长情况，以评估细胞是否具有活性以及是否增殖至足够数量。每次添加新鲜培养基前，从生物反应器中取出2 ml细胞悬液转移至60-mm组织培养皿中，在显微镜下观察细胞形态。
    注意：悬浮于培养基中呈团块状的细胞表明细胞生长状态和活性良好（参见图4C）。24小时后，细胞将在组织培养皿表面形成集落，30–50%的融合度为理想密度。
  5. 建立旋转培养体系24小时后，加入500 ml新鲜培养基（MEM，10% FBS），并额外补充100 µg/ml潮霉素B。24小时后重复此步骤。
  6. 建立旋转培养体系72小时后，加入1,000 ml含10% FBS和100 µg/ml潮霉素B的新鲜MEM培养基，最终细胞悬液总体积达到3 L。
  7. 当培养体积达到3升后24小时，于室温下以500 × g离心10分钟收集116悬浮细胞。弃去上清液。将空的旋转培养瓶置于组织培养超净台中备用。
  8. 用含5% FBS的新鲜MEM培养基重悬细胞沉淀，通过反复吹打8–10次以获得均匀的细胞悬液。培养基体积取决于后续感染所用材料：若使用步骤2.10.2的裂解物（19.5 ml，参见步骤4.8.1，选项a），或使用步骤5.9.2纯化的HCAdV病毒储备液（根据病毒滴度加入数µl，参见步骤4.8.2，选项b）。总体积应为150 ml。
    1. 选项a：使用P3代（初级扩增）裂解物感染116悬浮细胞时，将步骤4.8所得细胞转移至一个配备无菌磁力搅拌子的250-ml储存瓶或250-ml小型旋转培养瓶中，并用P3代裂解物（步骤2.10.2）及每细胞2 TU的HV共同感染细胞。假设细胞密度为每毫升3 × 105个细胞，则总细胞数为9 × 108个。因此需加入1.8 × 109 TU的HV。
    2. 选项b：使用纯化后的病毒储备液感染116悬浮细胞时，将步骤4.8 所得细胞转移至一个配备无菌磁力搅拌子的250-ml储存瓶或250-ml小型旋转培养瓶中，并以每细胞100个病毒颗粒的剂量共同感染先前纯化的HCAdV（来自步骤5.9.2）。因此，根据纯化HCAdV的物理滴度（通过260 nm吸光度测定，参见步骤6），加入9 × 1010 VP，同时加入1.8 × 109 TU的HV。
  9. 将步骤4.8.1 或4.8.2 所得的细胞-病毒混合物置于组织培养孵育箱中，于37 °C、5% CO2条件下，在磁力搅拌器上以60 rpm搅拌2小时。确保储存瓶未完全密封，以允许空气流通。
  10. 感染后2小时，将细胞-病毒混合物全部转移回3-L 旋转培养瓶中，并加入1,850 ml预热（37 °C）的新鲜MEM培养基（含5% FBS），使总体积达到2 L。在组织培养孵育箱中于37 °C、5% CO2条件下以70 rpm继续培养48小时。
  11. 在500-ml离心管中，于室温下以890 × g离心10分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于28 ml DPBS中，反复吹打以获得均匀的细胞悬液。将细胞-病毒悬液在液氮中或-80 °C下冷冻，确保完全冻结。将细胞-病毒悬液保存于-80 °C，直至开始病毒纯化步骤。

5. HCAdV 的纯化与透析

  1. 为制备用于氯化铯（CsCl）梯度离心的病毒裂解液，将步骤 4.11 中获得的细胞-病毒悬液用液氮速冻，并在 37 °C 水浴中融化，重复此冻融过程共 4 次。
  2. 在室温下以 500 × g 离心病毒裂解液 8 分钟，收集含有 HCAdV 的上清液。
  3. 为超速离心准备 CsCl 溶液，具体如下：分别称取 CsCl 粉末 37.5 g（用于 1.5 g/cm3）、33.5 g（用于 1.35 g/cm3）和 31.25 g（用于 1.25 g/cm3），并用 dH2O 定容至 25 ml。
    1. 搅拌至溶液澄清，经无菌滤膜过滤。最后分别取出 1 ml 各种溶液，用精密天平称重，以检查密度是否正确。1 ml 溶液的质量应分别为 1.5 g、1.35 g 和 1.25 g。
    2. 若密度过高，通过逐步加入少量无菌 dH2O（µl）进行调整。加入 dH2O 后再次测量密度。必要时继续添加 dH2O。
    3. 重复上述操作直至密度准确。若密度过低，则加入少量 CsCl 粉末进行调整，再次无菌过滤并检测密度。若密度仍过高，按前述方法加入 dH2O 调整；若密度仍过低，则继续添加 CsCl，再次无菌过滤并检测密度。重复该过程直至密度正确。
  4. 在 6 支透明超速离心管中制备 CsCl 梯度。使用移液器小心缓慢地按以下顺序加入 CsCl 溶液：0.5 ml 的 1.5 g/cm3 CsCl 溶液、3 ml 的 1.35 g/cm3 CsCl 溶液和 3.5 ml 的 1.25 g/cm3 CsCl 溶液（图 2C）。
  5. 将步骤 5.2 中获得的约 4.5 ml 澄清病毒上清液小心地铺加在 1.25 g/cm3 CsCl 层上方。使用甩平转子（SW-41）在超速离心机中以 226,000 × g（35,000 rpm）在 12 °C 下离心至少 2 小时，加减速设置为缓慢，以分离含 HCAdV 基因组的病毒颗粒与空颗粒及细胞碎片。
    注意：在理想条件下，离心管顶部会形成一层弥散的细胞碎片层。其下方可见两条白色条带，上层条带含有空颗粒，下层条带即为 HCAdV（图 2C 和 图 5A）。
  6. 小心移除细胞碎片层和空颗粒层，用洁净的移液器吸头从每根离心管中收集 1 ml 下层条带，并转移至无菌 50 ml 离心管中。向收集的病毒颗粒中加入 1.35 g/cm3 CsCl 溶液至总体积达 24 ml，并轻轻混匀。
  7. 将离心管用 1.35 g/cm3 CsCl-病毒溶液加满，使用甩平转子（SW-41）在超速离心机中以 226,000 × g（35,000 rpm）在 12 °C 下过夜（18–20 小时）离心，加减速设置为缓慢。
  8. 收集明显存在的下层条带中的 HCAdV。由于可能存在的上层条带含有空颗粒，需用移液器从顶部移除上层（见 图 2C 和 图 5B），然后用移液器吸取下层条带。
  9. 对收集的病毒颗粒进行透析以更换缓冲液。
    1. 剪取一段长约 8 cm 的透析袋（截留分子量：50,000），用无菌 dH2O 清洗 3 次。用塑料夹封闭透析袋一端，使用 1 ml 移液器将步骤 5.8 中收集的病毒液转移至透析袋内。避免袋内产生气泡，用塑料夹封闭另一端。
    2. 在 1 L 透析缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10% 甘油、1 mM MgCl2，溶于去离子 H2O）中于 4 °C 缓慢搅拌透析 2 小时。更换为 2 L 透析缓冲液，继续在 4 °C 缓慢搅拌下过夜透析。也可选用蔗糖缓冲液（140 mM NaCl、5 mM Na2HPO4·2H2O、1.5 mM KH2PO4、730 mM 蔗糖，pH 7.8）。
    3. 使用 1 ml 移液器从步骤 5.9.2 中收集透析后的病毒颗粒。分装为多个所需小体积（25–100 µl）的等份，并将纯化后的病毒于 -80 °C 保存。

6. 通过光密度（OD）测定最终HCAdV制备物的物理滴度

  1. 将步骤 5.9.2 中获得的最终载体产物 25 µl 用 475 µl 裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM EDTA (pH 8.0)、0.5% SDS）稀释，室温下轻轻振荡 20 分钟，然后在室温下以 15,000 × g 离心 2 分钟。
  2. 由于在 260 nm 处的吸光度值（A260）通常较低，使用 100 µl 上清液进行 4 次吸光度测定，并计算四次测量的平均值。使用以下公式计算每毫升病毒颗粒数（vp/ml）：vp/ml  =（平均 A260）×（20）×（1.1 × 1012）×（36 kb / HCAdV 大小（kb））。
    注意：典型的绝对病毒颗粒产量（OD 滴度）结果如图 7A所示。经验表明，OD 滴度会高估病毒颗粒数量，通过 OD 测得的绝对病毒颗粒数可能比通过 q-PCR 测得的感染性病毒颗粒数高出 20–100 倍。如需更精确地测定绝对病毒颗粒数、感染性 HCAdV 颗粒数以及 HV 污染情况，请参见第 7 节。

7. 通过qPCR测定最终载体制剂中总颗粒数、HCAdV的感染性单位及HV污染水平。滴定程序示意图见图6

  1. 在6孔或12孔组织培养板中接种HEK293细胞，使细胞在次日达到90%汇合度。为测定感染性病毒颗粒数量（感染性滴度），取多孔板中一孔细胞加入1 µl纯化的病毒，另一孔加入10 µl步骤5.9.3所得的纯化病毒进行感染。
  2. 感染后3小时收集细胞。吸除培养基，加入胰蛋白酶覆盖整个孔底，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。用移液器吹打使细胞脱落，随后在室温下以890 × g离心3分钟收集细胞。
  3. 将细胞沉淀重悬于200 µl DPBS中，充分洗涤以去除游离（非感染性）载体颗粒。在室温下以890 × g离心3分钟。弃上清，将细胞沉淀重悬于200 µl新鲜DPBS中。
    注意：为准确测定感染性滴度，必须通过胰蛋白酶处理和充分洗涤去除细胞表面所有非感染性病毒颗粒。
  4. 为测定总病毒颗粒数（感染性颗粒与非感染性颗粒之和，即物理滴度），用移液器直接以培养基吹打下两个未感染的HEK293细胞孔中的细胞，无需使用胰蛋白酶。
  5. 在室温下以890 × g离心3分钟收集细胞。弃去培养基，将细胞沉淀重悬于200 µl DPBS中。随后分别向细胞中直接加入1 µl和10 µl纯化的HCAdV制剂。使用未感染的细胞作为空白对照，以确保gDNA提取及后续q-PCR实验条件一致。
  6. 从步骤7.3 和7.5获得的HEK293细胞中提取基因组DNA（gDNA）
    1. 将重悬于200 µl DPBS中的细胞（步骤7.3和7.4）涡旋振荡3秒，加入200 µl SDS溶液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5），10 mM EDTA（pH 8.0），0.5% SDS）和20 µl蛋白酶K（20 mg/ml），再次涡旋振荡3秒。于55 °C缓慢摇动孵育12–16小时。然后加入2 µl RNA酶A（20 mg/ml），于37 °C孵育30分钟。
    2. 加入350 µl苯酚:氯仿:异戊醇混合液，以15,000 × g离心2分钟。将上清转移至新管中，并重复此步骤一次。
    3. 将上清转移至新管，加入50 µl乙酸钠（pH 5，3 M）和1 ml冰冻乙醇（99.8%），混匀。以15,000 × g离心10分钟，沉淀基因组DNA。
    4. 弃去上清，加入500 µl 70%乙醇，以15,000 × g离心2分钟。再次弃去上清，加入500 µl 70%乙醇，在室温下振荡30分钟，然后以15,000 × g离心2分钟。
    5. 弃去上清，将DNA沉淀在空气中干燥。切勿长时间干燥DNA沉淀，否则将难以溶解。将DNA沉淀重悬于120 µl dH2O中，于37 °C振荡孵育约1小时。若DNA溶液黏稠，可于37 °C持续振荡数小时，或在55 °C孵育约1小时。
  7. 为测定感染性HCAdV颗粒和绝对HCAdV颗粒数量，构建含有HCAdV基因组中目的基因（GOI）的质粒标准曲线，拷贝数范围为101–108。
  8. 通过qPCR分析步骤7.3 和7.4 所得感染HEK293细胞的等量gDNA，使用400 nM针对HCAdV基因组中目的基因（GOI）的特异性引物，测定总颗粒数和感染性颗粒数。
  9. 设定PCR程序如下：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒、55 °C退火10秒、72 °C延伸20秒。根据标准曲线（步骤7.7），推算反应中腺病毒基因组的总数。
  10. 使用以下公式计算最终载体制剂中腺病毒基因组的数量：（反应中HCAdV数量 / 反应中gDNA质量（ng））×（感染皿中所有细胞DNA总质量（ng）/ 病毒体积（µl））。
    注意：绝对病毒颗粒和感染性病毒颗粒的典型产量范围约为1 × 107–1 × 108 病毒颗粒/µl。比此高或低十倍的滴度仍可视为正常。更高滴度为更优结果。根据绝对HCAdV颗粒与感染性HCAdV颗粒的比例，经验表明约5–10%的绝对HCAdV颗粒具有感染性（图7A）。
  11. 为测定HV污染水平，通过qPCR扩增存在于HV基因组中的腺病毒晚期基因3（L3）片段。使用携带腺病毒晚期基因3（L3）的质粒构建标准曲线（步骤7.7）。
  12. 在该反应中使用400 nM的L3正向引物（5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3'）和L3反向引物（5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3'），以及300 nM的L3特异性探针（5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3'）。
  13. 设定PCR程序如下：95 °C预变性/激活10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒、60 °C退火1分钟。qPCR反应中可使用任何通用探针法PCR预混液。根据标准曲线（步骤7.7），计算最终载体制剂中感染性HV颗粒的数量。典型HV颗粒产量参见（图7A）。
  14. 最后计算HCAdV绝对感染性颗粒与HV污染水平的比值，以评估载体制剂的质量。
    注意：目前仍无法完全排除少量残留HV的存在。通常HV污染比例约为感染性颗粒的5%或更低，属于可接受范围（图7B）。当然，HV污染越少越好，尤其是当该载体制剂将用于动物实验时。

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结果

此处展示了HCAdV制备物的克隆、扩增和纯化的代表性示例。提供了克隆策略的概览（图1），以及通过限制性内切酶消化进行HCAdV基因组克隆和释放的代表性示例（图2）。展示了将目的基因（GOI）表达盒从pHM5质粒中用PI-SceI和I-CeuI酶切后，经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀（另见步骤1.2–1.5）所得的典型限制性酶切图谱（图2A）。通常可观察到一条约3 kb的条带，对应于pHM5质粒骨架，以及另一条对应于GOI表达盒的条带。随后从琼脂糖凝胶中纯化含有GOI表达盒的条带。将纯化的GOI表达盒与经PI-SceI和I-CeuI分别酶切并去磷酸化的pAdVFTC质粒（步骤1.7）一同进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确认其正确大小，并估算后续连接反应中分子的相对含量（图2B）。连接反应完成后（见步骤1.8），经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀，并用SwaI酶切以去除未切割的...

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讨论

本文所述方案基于人5型腺病毒（human adenovirus type 5），采用此前已报道的方法对高容量腺病毒载体（HCAdV）进行纯化 4,12pAdFTC 质粒中的 HCAdV 基因组缺失了所有腺病毒基因，仅保留 5'-和 3'-ITRs 以及包装信号。在此策略中，HV AdNG163R-2 4 提供高效病毒生产所需的全部必要基因 在转染中。这提供了高达 35 kb 的包装容量，明显优于第一代和第二代腺病毒（AdV）或广泛使用的慢病毒（LV）或腺相关病毒（AAV）载体。HCAdV 的第二个优势，尤其对于 体内 与第一代或第二代腺病毒载体相比，其应用优势在于表达病毒蛋白所导致的细胞毒性和免疫原性副作用显著降低 5-8.

然而，与LV或AAV载体以及第一代或第二代AdV载体相比，此处所述方案在时间和工作量上更为密集。主要障碍在于大尺寸转基因的克隆及其随后向病毒生产质粒pAdV-FTC的转移。利用归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI可实现从穿...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）资助项目 EH 192/5-1（A.E.）、欧盟（E-rare-2）项目 Transposmart（A.E.）、乌普萨拉大学医院研究基金（UWH Forschungsförderung）（E.S. 和 W.Z）、维滕/黑尔德克大学博士培养计划（P.B.）提供支持。J.L. 获得中国国家留学基金管理委员会奖学金资助，T.B. 和 M.G. 获得Else Kröner-Fresenius基金会（EKFS）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
I-CeuINew England BiolabsR0699S限制性酶切
PI-SceINew England BiolabsR0696S限制性酶切
T4 连接酶New England BiolabsM0202S连接反应
SwaINew England BiolabsR0604S限制性酶切
NotINew England BiolabsR0189S限制性酶切
小牛肠碱性磷酸酶（CIP）New England BiolabsM0290S酶切质粒的去磷酸化
潮霉素BPAN BiotechP02-015CRE表达116细胞的筛选
DMEMPAN BiotechP04-03590   HEK293T细胞培养基
最低必需培养基（MEM）EaglePAN BiotechP04-08500116细胞培养基  
Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS）PAN BiotechP04-36500细胞洗涤、细胞重悬
250 ml储存瓶SigmaCLS430281-24EA悬浮培养116细胞的感染
500 ml聚丙烯离心管SigmaCLS431123-36EA从悬浮培养物中沉淀细胞
旋转培养瓶Bellco1965-61030悬浮培养116细胞
超透明超速离心管Beckman Coulter344059密度梯度离心
超速离心机Beckman Coulter密度梯度离心
SW-41转子Beckman Coulter密度梯度离心
Spectrum Laboratories Spectrapor透析膜VWR132129透析管
即用型透析夹片 Thermo66383透析
单次使用DH10B电转化感受态E. coliInvitrogenC4040-52连接反应的转化
PureYield质粒中量提取系统PromegaA2495中量质粒提取
peqGOLD组织DNA小量提取试剂盒 Peqlab12-3396-02基因组DNA提取
SuperFect转染试剂Qiagen301305116细胞的转染
opti MEM（10% FBS）Gibco31985-062116细胞的转染
iQ SYBR Green SupermixBioRad 170-8882q-PCR
CFX 96 C1000 touch BioRadqPCR仪
苯酚/氯仿/异戊醇 Carl RothA156.1DNA纯化
氯化铯Carl Roth8627.1密度梯度离心
乙酸钠 99%Carl Roth6773.2DNA沉淀
LB培养基 Carl RothX968.3细菌生长培养基
乙醇 99.8%纯度Carl Roth9065.5 DNA沉淀与洗涤
SDS 99.5%Carl Roth2326.2裂解 缓冲液
EDTACarl Roth8043.2裂解 缓冲液
Tris-HCl 99%Carl Roth9090.3透析缓冲液/裂解 缓冲液
甘油 99.5%Carl Roth3783.1透析缓冲液
MgCl2 98.5%Carl RothKK36.2透析缓冲液
NaClCarl Roth3957.1可选透析缓冲液
KH2PO4Carl Roth3904.2可选透析缓冲液
蔗糖Carl Roth9286.1可选透析缓冲液
Na2HPO4·2H2OCarl Roth4984.2可选透析缓冲液
1.5 ml离心管Sarstedt72,730,005病毒制备物在-80 °C下的储存

参考文献

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基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产
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