小鼠后肢肌肉中复合肌肉动作电位（CMAP）的电生理运动单位计数（MUNE）测量

摘要

我们提出经过优化的实验方案，可实现 体内 监测小鼠运动单位功能。本文描述了测量由坐骨神经支配的小鼠后肢肌肉的复合肌肉动作电位（CMAP）及运动单位数目估计（MUNE）的技术。

摘要

复合肌肉动作电位（CMAP）和运动单位数量估计（MUNE）是可用于监测运动单位池功能状态的电生理学技术 体内这些检测方法可为神经肌肉系统的正常发育与退行性变化提供重要信息。由于这些方法在人类临床诊断和研究中常规应用，因而具有明确的转化潜力。本文介绍了与人类研究中所用技术相似的电生理学方法，可用于记录小鼠坐骨神经功能。复合肌肉动作电位（CMAP）反应是指在周围神经接受超最大刺激后，由单个肌肉或肌群所产生的电生理输出。运动单位数目估计（MUNE）是一种基于CMAP反应改良而来的电生理技术，其计算值代表支配被测肌肉或肌群的运动神经元或轴突（运动控制输入）的估计数量。本文阐述了在小鼠中通过刺激坐骨神经后，使用表面记录电极从小腿近端肌肉记录CMAP反应的方法。同时描述了一种增量式MUNE技术，通过施加次最大刺激来确定平均单运动单位电位（SMUP）的大小。MUNE值通过将CMAP波幅（峰-峰）除以SMUP波幅（峰-峰）计算得出。这些电生理学技术可在新生期和成年小鼠中进行重复测量，有助于快速分析与数据采集，同时减少实验所需动物数量。此外，这些检测指标与人类研究中获得的数据相似，有利于实现更直接的跨物种比较。

引言

运动单位计数估计（MUNE）最早由 McComas et al. 在三十多年前提出¹。原始技术是对复合肌肉动作电位（CMAP）记录技术的一种改进，通过逐步增加刺激强度以获得次最大幅度的递增反应。这些递增值被累加并取平均，以确定单个运动单位电位（SMUP）的估计大小。再将该大小除以CMAP反应，从而估算出所测肌肉的运动单位数量。自最初描述以来，已有多种变体技术被应用于人类研究和动物模型中，这些方法既包括利用电生理反应，也包括采用逐步递增的力（机械）测量²。Shefner 及其同事对该MUNE技术进行了改良，用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的小鼠模型^{3, 4}。

在本文描述中，我们详细介绍了执行迅速的简化版MUNE技术改良方法。重要的是，CMAP和MUNE可在新生和成年小鼠中提供可靠的测量结果^5-8。经验丰富的操作者可在每只动物上用10–20分钟 完成测量，且可进行重复测量，从而获得纵向数据⁵。在本研究中，我们采用临床电诊断系统。根据我们的经验，临床电诊断系统已优化为可快速高效地在体采集电生理数据in vivo，但标准的电生理设备也可轻松改装用于此用途。

方案

本方案已获得俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心动物护理与伦理委员会的批准，并遵循其动物护理与伦理指南。

1. 动物准备与麻醉 

1. 处理小鼠时需佩戴手套。
2. 用吸入的异氟烷麻醉小鼠，并置于俯卧位。使用3-5%异氟烷和1 L/min的氧流量诱导麻醉 每分钟₂ 流速。麻醉诱导后，以2-3%浓度和每分钟1升氧气维持麻醉。₂ 流速
   1. 调节 O₂ 根据动物的疾病状态、年龄和呼吸频率调整气流和异氟烷百分比，以达到适当的麻醉效果。体型较小或较虚弱的动物可能需要较低浓度的异氟烷即可实现充分麻醉即1.5–2.5% 异氟烷
   2. 通过使用镊子等物体对后肢足垫施加轻微压力，确认动物无退缩反应，以验证麻醉效果是否充分。 
3. 使用恒温加热板将表面温度维持在37 °C，因为温度变化可能影响复合肌肉动作电位（CMAP）的幅度和持续时间。
4. 用兽用石油基眼膏涂抹眼睛，以防止干燥。通过观察呼吸频率以及使用镊子按压足垫时评估有无回缩反应，来监测麻醉水平。
5. 使用剪毛器去除待研究后肢的毛发。去除后肢毛发后，轻轻伸展膝关节，外展髋关节，并用胶带将后肢固定于工作台面（如图所示）。 图1).
6. 在完成CMAP和MUNE记录并停止麻醉后，不得让动物无人看管，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同处的环境中。

2. 记录装置与设备

1. 将记录 CMAP 和 MUNE 的电极按 图1 所示位置放置。
2. 使用两个细环形电极作为记录电极。
   1. 将主动电极（E1）环形电极置于后肢腓肠肌近端部位（膝关节处）的皮肤上，参考电极（E2）环形电极置于足部中段跖骨区域的皮肤上。
   2. 为降低阻抗，需在环形电极下方的皮肤涂抹导电凝胶，充分浸润残留毛发并最大化电极与皮肤的接触。避免过度使用电极凝胶，以免在电极之间形成电通路，影响准确记录。
3. 刺激近端后肢坐骨神经时，使用两根绝缘的 28 G 单极针作为阴极和阳极。将阴极插入后肢近端区域，阳极则更靠近近端，插入覆盖骶骨区域的皮下组织。
   1. 避免将刺激电极插入过于靠近坐骨神经或过深的位置，以防直接损伤坐骨神经或其他结构。图1 展示了电极的放置位置。
4. 接地电极应置于对侧后肢或尾部的一次性表面电极上。

3. 数据采集

1. 坐骨神经复合肌肉动作电位
   1. 通过使用持续时间为0.1 ms、强度范围为1–10 mA的方波脉冲刺激坐骨神经，获取坐骨神经复合肌肉动作电位（CMAP）反应。
   2. 以逐渐增加的刺激强度获取CMAP反应，直至反应幅度不再增加。随后，为确保超强刺激，将刺激强度增加至获得最大反应所需刺激强度的约120%，并再次记录一次反应。若CMAP幅度未进一步增大，则将此次记录的反应记为最大CMAP。
   3. 记录复合肌肉动作电位（CMAP）的基线到峰值以及峰值到峰值的振幅，单位为 mV图2).
2. 平均单运动单位电位（SMUP）大小与运动单位数估计（MUNE）计算
   1. 采用递增刺激技术测定单个运动单位电位（SMUP）的平均大小¹为获得递增反应，以1 Hz频率施加持续时间为0.1 ms的亚最大刺激，同时以0.03 mA为步长逐步增加刺激强度，以获得最小的“全或无”反应。初始反应的刺激强度应介于0.21 mA至0.70 mA之间。
      1. 如果在0.21 mA至0.70 mA的刺激强度范围内未出现初始反应，则通过将刺激阴极位置调整至更靠近或更远离近端大腿处坐骨神经的位置，以分别降低或增加所需刺激强度。
      2. 若初始的渐增反应是在0.21 mA至0.70 mA之间的刺激强度下获得，并满足下文所述标准（3.2.2），则以0.03 mA为调节步长，逐步增加刺激强度，记录并储存额外9个符合既定标准的渐增反应。
   2. 在测量增量反应时，确保每个增量均满足以下标准。
      1. 确保递增反应的初始负向峰在时间上与CMAP图示中阴影部分所示的最大CMAP反应的负向峰对齐 图2.
      2. 确保每次递增反应稳定且无分数化，通过观察三次重复反应来确认。实时目视区分递增反应（与先前记录的递增反应叠加显示）。
         注：每次递增应与前一次反应相比在视觉上明显不同且更大图3）。实时分析可识别出相较于先前反应具有更大振幅（增量）的反应，而由背景噪声引起的小幅变化则可忽略。图中展示了10个增量的叠加视图 图4 （B 和 D）以进一步说明此观点。
      3. 在目视确认每个增量后，确保测得的振幅差值（确认反应振幅减去前一次反应的振幅 = 振幅差值）至少为 25 µV。
      4. 如果增幅小于25 µV，则弃用并重新测量该反应。记录10次增幅反应后，评估各次增幅，确保每次单独增幅反应的幅度不超过十次增幅总和的1/3。即 最终反应的总幅度）。如果未满足此条件，则需重新测量递增反应。 
   3. 将10个增量值取平均，以估算单个运动单位电位（SMUP）的平均波幅（图3）。注意： 图3 详细说明了平均SMUP计算的依据，但平均SMUP幅度可通过将最终递增反应的总幅度除以递增次数的总数来简单计算（即， 10).
      示例个体SMUP计算（图示于 图3):
      SMUP 1 = 第1个增量的峰-峰振幅
      SMUP 1=0.050 mV
      SMUP 2 =（第2个增量的峰峰值振幅）－（第1个增量的峰峰值振幅）
      SMUP 2 = 0.150 mV - 0.050 mV = 0.100 mV
      1. 计算每个后续增量（共10次），并对这10个增量取平均值。
   4. 通过将最大复合肌肉动作电位（CMAP）波幅（峰-峰）除以平均单运动单位电位（SMUP）波幅（峰-峰）来计算运动单位数估计值（MUNE）。（MUNE = CMAP / 平均 SMUP）。在某些电生理系统中，SMUP 的增量以 μV 为单位测量，而 CMAP 通常以 mV 为单位提供。必要时，在计算 MUNE 前需将 CMAP 和 SMUP 结果转换为相同单位。

结果

本报告中描述的CMAP和MUNE技术可通过微创电极放置方式记录坐骨神经支配的后肢肌肉的神经肌肉功能（图1）。复合肌肉动作电位（CMAP）的最大幅值代表了肌群的总体输出，可通过波幅和面积参数进行描述（图2）；然而，在当前方法中，我们采用波幅来量化CMAP以及单个运动单位动作电位（SMUP）的大小。由于CMAP反映的是肌肉内肌纤维去极化的总和反应，因此从运动神经元到肌纤维通路上的任何部位发生病理改变，均可能导致CMAP幅值减小。因此，CMAP是评估整体功能状态的优良指标。如预期所示，CMAP幅值在发育过程中会逐渐增加⁵。然而，在去神经支配后可能发生的代偿性改变（例如侧支 sprouting）可使CMAP幅值得以维持，即使存在运动神经元或运动轴突丢失的情况。因此，需要采用MUNE技术来确定受检肌肉或肌群的运动神经元或轴突输入数量。通过记录单个递增反应（图3），可估算单个运动单位的平均输出（即SMUP大小），从而提供有关运动单位功能状态的更详细信息。

CMAP 和 MUNE 可用于测量多种神经肌肉疾病小鼠模型中的神经肌肉功能。在图4中，对比了一只成年对照小鼠与一只坐骨神经 crush 损伤后11周的成年小鼠的结果。坐骨神经 crush 损伤后，MUNE 显著降低，功能运动单位估计为50个，而对照小鼠为278个功能运动单位。相比之下，由于侧支芽生的作用，损伤小鼠的 CMAP 振幅（基线到峰值为39.6 mV，峰值到峰值为74.9 mV）与对照组（基线到峰值为49.0 mV，峰值到峰值为84.2 mV）相比仅表现为轻度降低。

图1. 电极放置位置。 黑色（E1）“激活”电极 (A) 和红色（E2）“参考”记录电极 (B) 置于腓肠肌近端靠近膝部的位置。刺激阴极（黑色）(C) 和阳极（红色）(D) 被皮下插入记录电极近端，以诱发远端反应。一次性盘状电极 (D) 置于后肢、尾部或骶骨处作为接地电极，以最小化伪迹。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 复合肌肉动作电位。图中展示了一个典型的复合肌肉动作电位（CMAP）反应示意图。(A) 基线到峰幅值从等电位基线测量至初始负相峰顶（负电压在基线上方表示）。(B) 峰到峰幅值从负相峰电压测量至正相峰电压。灰色阴影区域表示负相峰面积。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3. 增量反应。 展示了两个具有代表性的增量反应，分别为叠加状态和单独状态。在MUNE计算中，每个增量的幅值以峰峰值进行测量。增量#1是记录到的初始“全或无”反应，代表一个单个运动单位电位（SMUP）。每个后续增量（#2-10）表示在前一个反应基础上叠加的量子化增加。因此，为了获得增量2-10的SMUP幅值，需从当前增量的幅值中减去前一个反应的幅值。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 坐骨神经复合肌肉动作电位（CMAP）与运动单位数目估计（MUNE）示例。 (A) 成年对照小鼠（6月龄）的坐骨神经复合肌肉动作电位（CMAP），其基线到峰值振幅为 49.0 mV，峰-峰振幅为 84.2 mV。示波器灵敏度 = 每格 10 mV，扫描时程 = 10 ms。(B) 对照小鼠中10个相应的分级反应，总振幅为 3.028 mV，除以10得到平均单运动单位电位（SMUP）大小（0.3028 mV）。示波器灵敏度 = 每格 0.5 mV，扫描速度 = 每格 1 ms。计算得 MUNE = 278（MUNE = CMAP / 平均 SMUP = 84.2 mV / 0.3028 mV）。(C) 成年小鼠（6月龄）在坐骨神经 crush 损伤后11周的坐骨神经 CMAP，显示基线到峰值振幅轻度降低（39.6 mV），峰-峰振幅为 74.9 mV。示波器灵敏度 = 每格 10 mV，扫描速度 = 每格 1 ms。(D) 神经损伤小鼠中10个相应的分级反应，其总峰-峰振幅为 14.923 mV，除以10得平均 SMUP 大小为 1.4923 mV。示波器灵敏度 = 每格 2 mV，扫描速度 = 每格 1 ms。计算得 MUNE = 50（MUNE = CMAP / 平均 SMUP = 74.9 mV / 1.4923 mV）。（**注意：坐骨神经损伤小鼠的分级反应灵敏度不同。）请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

MUNE 和 CMAP 是临床上相关的重要检测指标，常用于研究以及对肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等神经肌肉疾病患者的监测^{9, 10}。例如，在 SMA 中，CMAP 和 MUNE 与年龄、疾病严重程度及临床功能评估指标具有良好的相关性^10-14。这两种检测方法均为微创性，可在同一受试者中进行纵向功能评估。需要强调的是，这些检测方法无法测量皮质运动神经元对运动单元的激活或募集情况，但它们能够对运动神经元及其功能对应单元——运动单元的完整性提供具有临床意义的评估。

神经肌肉疾病动物模型对于理解人类疾病的致病机制以及潜在有效治疗药物的临床前研发至关重要。能够在不同物种间通用的结果评估指标和生物标志物的转化应用，有助于推动有前景的临床前研究成果更快地过渡到人类临床试验。此前已有多个研究团队利用电生理学和力（机械）学测量方法来评估小鼠模型中的运动单位功能^{2-4, 15-22}。由于这些测量方法相对复杂，我们对其进行了优化，并以可视化形式呈现，以促进其在小鼠研究中的更广泛使用和实施。通过视频演示与操作指导的形式，可突出展示实验过程中的关键步骤，并针对性地指出潜在的操作难点。将这些技术应用于运动神经元疾病潜在疗法的临床前测试，有望提高从小鼠到人类疾病治疗转化的成功率。

在获取CMAP和MUNE反应的过程中，有几个关键步骤。记录电极的正确且一致的放置位置，以及电极与后肢皮肤之间的充分接触，对于可重复地测量波幅并降低背景噪声至关重要。因此，应始终确认后肢皮肤与电极之间保持紧密接触。我们发现，与针电极相比，表面电极能够提供更稳定的CMAP和MUNE记录结果。由于皮下组织非常薄，针电极记录表面的微小移动可能导致CMAP波幅出现较大变异。此外，针电极更具侵入性，可能造成肌肉破坏和损伤，因此在新生小鼠或纵向研究中并非理想选择。非选择性的表面电极记录存在一个潜在缺点：当某一特定肌肉受累程度明显高于或低于其他肌肉时，表型分辨能力可能下降，这一点已在一种肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中有所报道²¹。

获取平均SMUP大小在技术上比获取CMAP更具挑战性。由于SMUP的反应幅度较小（处于微伏μV范围，而非毫伏mV范围），背景噪声可能造成更大干扰。通过调整接地电极、阴极、阳极以及检查实验装置附近其他电子设备，可降低背景噪声。通常用于细胞内电生理学实验的法拉第笼在此并不需要。目测识别单个SMUP反应是最难掌握的技术，需要经过练习才能获得稳定且可重复性良好的结果。必须确保所记录的SMUP反应是在最大CMAP反应持续时间内开始的。我们已制定了单个递增反应的可接受标准，以使该过程更易于操作，并提高评分者内部和评分者之间的可靠性。

增量MUNE技术的一个潜在缺点是由于运动单位的交替现象，可能导致功能性运动单位数量的高估。我们采用了一种类似于Shefner et al. 的技术，即每个反应应可重复出现至少3次，以降低这一现象的影响³。

根据我们的经验，临床电诊断系统因改进了操作者与电诊断系统之间的接口人体工程学设计，便于操作控制，因而更适用于本文所述的研究。我们实验室使用的双通道系统配备了两个非切换式放大器通道，放大器具有24位模数转换器，每通道采样率为48 kHz。硬件增益可调节范围为10 nV至100 mV/格。低频滤波器范围为0.2 Hz至5 kHz，高频滤波器设置范围为30 Hz至10 kHz。采用恒流刺激器（刺激强度：0–100 mA；脉冲持续时间：0.02–1 ms）。大多数临床系统均具备类似且合适的功能，可调节以充分记录复合肌肉动作电位（CMAP）和运动单位数目估计（MUNE）反应。此外，也可组装标准的电生理设备以充分记录CMAP和MUNE，但其操作界面可能需要调整，以便于刺激参数的调节以及快速识别CMAP和单运动单位动作电位（SMUP）反应。

我们此前已采用本文所述的CMAP和MUNE技术，对小鼠从出生后早期至成年期间后肢坐骨神经支配肌肉进行快速且可重复的评估⁵。当行为学检测运动功能不可行或可靠性较低时，这些技术可为小鼠模型提供有效的评估手段。将该技术应用于新生小鼠，有助于研究运动单位的发育过程，并有望加深我们对运动神经元支配及修剪机制的理解。例如，我们已发现，在新生小鼠出生后前两周从多神经元支配向单神经元支配转变的修剪过程中，通过MUNE记录到的功能性运动单位数量会增加⁵。利用该技术对小鼠进行长期追踪检测，适用于研究运动单位对外周神经损伤、遗传性神经肌肉疾病以及衰老的反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pro 修毛器宠物美容套装	Oster	078577-010-003	用于毛发去除的电推剪
Synergy T2 肌电图系统	Natus Neurology	型号已不再提供	便携式电诊断系统
28 G 单极针电极	Teca	017K121	阴极和阳极刺激电极
Alpine Biomed 数字环形电极，带绞合导线和 1.5 mm TP 连接器	Alpine Biomed	9013S0312	记录电极
带铁底座的 Helping Hands 鳄鱼夹	Radio Shack	64-079	用于固定记录电极位置
Spectra 360 电极凝胶	Parker Laboratories	9013G5012	用于降低皮肤阻抗
monoject 弯头冲洗注射器	Covidien	81412012	用于涂抹电极凝胶
肌电图针状电极电缆	Teca	902-RLC-TP	用于将单极电极连接至电诊断刺激器
一次性 2" x 2" 电极或根据需要裁剪的类似电极	Carefusion	019-415000	接地电极
带内置 RTD 传感器的小型加热板，15 x 10 cm	World Precision Instruments	61830	与动物体温控制器配合使用的加热板，用于向动物传递热量
适用于 ATC2000 的硅胶垫	World Precision Instruments	503573	可导热、可拆卸的垫片，覆盖在加热板上以便清洁
动物体温控制器	World Precision Instruments	ATC2000	低噪声动物加热系统，用于维持动物体温
兽用石油基眼膏	Puralube	26870	麻醉期间使用，以避免角膜损伤