小鼠异位颈部心脏移植

摘要

套管技术通过避免对小血管进行技术难度较高的缝合吻合，从而缩短并简化了小鼠异位颈部心脏移植模型的建立过程。本视频论文中展示的技术细节应有助于研究人员在其实验室中成功建立该模型。

摘要

小鼠异位颈部心脏移植是移植学和心血管研究中的重要工具。套管技术通过避免对小血管进行困难的缝合吻合，显著简化了该模型，从而缩短了热缺血时间。与腹部移植植入相比，颈部模型侵入性更小，且植入的移植物便于后续随访检查。吻合操作是将移植物的升主动脉套入套管并与受体的颈总动脉连接，同时将移植物的主肺动脉套入套管并与受体的颈外静脉连接。选择合适的套管尺寸以及充分游离血管，对于成功实现再血管化至关重要。通过使用停跳液灌注移植物以及实施低温保存，可最大限度地减少缺血-再灌注（I/R）损伤。本文提供了简化且改进的套管技术的详细操作步骤，旨在使具备基本显微外科技能的外科医生能够以较高的成功率完成该手术。

引言

心脏移植模型常用于研究缺血-再灌注损伤、同种异体移植物排斥反应、移植后血管病变以及免疫调节剂的效果。小鼠模型具有多种优势，如已知的免疫学和遗传背景、大量可用的近交系和转基因品系，以及相对较低的实验成本。

1973年，Corry 等¹首次描述了小鼠腹部心脏移植技术。在此模型中，移植物通过将供体升主动脉与受体腹主动脉进行端侧吻合，以及将主肺动脉与下腔静脉吻合，实现再血管化。1991年，Chen 等²描述了一种小鼠颈部心脏移植的缝合技术。在此模型中，通过将受体颈动脉与移植物升主动脉吻合，建立逆行性冠状动脉灌注。静脉血经冠状窦流入右心房、右心室，并通过肺动脉射入受体颈外静脉（图1）。与腹部移植物植入模型相比，颈部模型侵入性更小，且移植物位置表浅，便于进行后续的各种检查（例如触诊、超声心动图、活体荧光显微镜检查）^3,4。

尽管技术有所改进^5,6，但由于对小血管进行缝合吻合时存在技术困难，导致吻合口漏和血栓形成的发生率较高，限制了该模型的更广泛应用。1991年，Matsuura et al. 引入了套管技术，即将血管壁外翻至一个合成圆筒上，从而极大地促进了颈段心脏移植模型的建立⁷。该技术随后被应用于多种实验性移植模型，包....

方案

所有实验均经德国慕尼黑德国心脏中心及巴伐利亚州政府批准（批准号：Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13）。动物饲养于特定病原体-free设施中，并依照美国国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及国家科学院发布的《实验动物护理与使用指南》（美国国立卫生研究院出版物编号86-23，1985年修订版）接受人道护理。
注意：该操作需要一套完整的无菌显微外科器械，包括两把弯镊和血管扩张器（图2a）。围手术期抗生素预防通常并非必需，但在免疫功能受损动物中可能需要。动物通过终末期吸入异氟烷实施安乐死。

供体准备与移植物获取

1. 通过腹腔注射咪达唑仑（5.0 mg/kg）、美托咪啶（0.5 mg/kg）和芬太尼（0.05 mg/kg 体重）对动物进行麻醉。将小鼠仰卧位固定于手术区域，并通过足底回缩反射确认手术耐受状态。
2. 用氯己定对皮肤消毒三次，行腹正中切口。用湿纱布将肠管向左牵开，暴露下腔静脉。
3. 通过下腔静脉注射50 IU肝素（溶于0.4 ml生理盐水中）以实现抗凝。肝素化1分钟后切开血管。
4. 切开膈肌，行双侧开胸术以暴露心脏。将前胸壁向上翻转，并用夹子固定。
5. 切除胸腺，钝性分离主动脉与肺动脉干之间的结缔组织。切开右上腔静脉。
6. 用安装在5 ml注射器上的30 G针头在头臂干水平穿刺游离的升主动脉，以3 ml ....

结果

我们的团队在经过约20次训练手术后，能够成功完成所述技术操作。最具挑战性的步骤是将颈动脉的血管壁外翻至套管上，因为血管壁容易回弹，多次尝试可能导致血管壁撕裂。经过训练阶段后，平均总手术时间为60 ± 8分钟。其中供体取材约需20分钟，颈部血管准备需25分钟，吻合及皮肤缝合约需15分钟。

为研究心肌缺血/再灌注损伤，我们在多种实验条件下对同基因型C57BL/6小鼠进行了200多次手术操作，手术成功率达92%。早期死亡原因包括吻合操作困难（n = 3）、吻合口漏（n = 2）和心肺功能衰竭（n = 10）。另有1只动物因术后出现神经功能障碍而实施安乐死。在围手术期存活的动物中，移植物存活情况为 >7天时达到95%图4)。许多同系移植受体存活超过3个月。尽管未使用抗生素预防，我们未观察到任何感染性并发症。

在第一组实验中，12只同系型C57BL/6小鼠接受了移植，用于组织病理学检查（图3）。移植物在冰上4 °C条件下保存，经历4小时冷缺血后进行移植。再灌注7天.......

讨论

我们在多种实验条件下已完成超过200例心脏移植，成功率超过90%。采用此处所述的技术，经验丰富的外科医生可在60分钟内完成整个手术过程。通过在器官获取前预先准备颈部血管，移植物的总缺血时间可缩短至20分钟。与缝合技术相比，使用套管技术可显著缩短植入时间（即热缺血时间）¹⁶。

与先前所述的直接切除心脏的方法不同^5,17，我们通过灌注临床上使用的停跳液 并结合低温来诱导心脏停搏。 晶体 Custodiol HTK 溶液含有 10 mmol/L 钾，以及低浓度的钠、钙和镁，可有效实现心脏停搏。其中添加的组氨酸、色氨酸和α-酮戊二酸可减轻酸中毒，提供 ATP，并在缺血期间保护细胞膜。 该方法模拟了体外循环手术中可控性心脏停搏的临床状态，使此模型成为研究心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的理想选择。此外，该模型允许在冷缺血开始时将药物直接加入停跳液中。移植物可在 0–4 °C 下保存，最长保存时间不超过 4 小时。过长的缺血时间可能导致心肌收缩功能减退，并引发右心腔过度扩张及出血等并发症。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子 JFC-7.2	S&T	P-00036	弯曲尖端 0.20 mm
血管扩张器 D-5a	S&T	S-00124
外膜剪刀	S&T	S-00102
血管夹 B-1V	S&T	S-00396
Yasargil 夹	Peter Lazic	65,097	长度 3.5 mm
双极电凝镊	Micromed	148-100-011	尖端 0.25 mm
聚酰亚胺管	River Tech Medical		19-24 号
8.0 丝线结扎线	Catgut
Custodiol HTK 溶液	Essential Pharmaceuticals