套管技术通过避免对小血管进行技术难度较高的缝合吻合，从而缩短并简化了小鼠异位颈部心脏移植模型的建立过程。本视频论文中展示的技术细节应有助于研究人员在其实验室中成功建立该模型。
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摘要
摘要
小鼠异位颈部心脏移植是移植学和心血管研究中的重要工具。套管技术通过避免对小血管进行困难的缝合吻合，显著简化了该模型，从而缩短了热缺血时间。与腹部移植植入相比，颈部模型侵入性更小，且植入的移植物便于后续随访检查。吻合操作是将移植物的升主动脉套入套管并与受体的颈总动脉连接，同时将移植物的主肺动脉套入套管并与受体的颈外静脉连接。选择合适的套管尺寸以及充分游离血管，对于成功实现再血管化至关重要。通过使用停跳液灌注移植物以及实施低温保存，可最大限度地减少缺血-再灌注（I/R）损伤。本文提供了简化且改进的套管技术的详细操作步骤，旨在使具备基本显微外科技能的外科医生能够以较高的成功率完成该手术。
引言
心脏移植模型常用于研究缺血-再灌注损伤、同种异体移植物排斥反应、移植后血管病变以及免疫调节剂的效果。小鼠模型具有多种优势，如已知的免疫学和遗传背景、大量可用的近交系和转基因品系，以及相对较低的实验成本。
1973年，Corry 等1首次描述了小鼠腹部心脏移植技术。在此模型中，移植物通过将供体升主动脉与受体腹主动脉进行端侧吻合，以及将主肺动脉与下腔静脉吻合，实现再血管化。1991年，Chen 等2描述了一种小鼠颈部心脏移植的缝合技术。在此模型中，通过将受体颈动脉与移植物升主动脉吻合，建立逆行性冠状动脉灌注。静脉血经冠状窦流入右心房、右心室，并通过肺动脉射入受体颈外静脉（图1）。与腹部移植物植入模型相比，颈部模型侵入性更小，且移植物位置表浅，便于进行后续的各种检查（例如触诊、超声心动图、活体荧光显微镜检查）3,4。
尽管技术有所改进5,6，但由于对小血管进行缝合吻合时存在技术困难，导致吻合口漏和血栓形成的发生率较高，限制了该模型的更广泛应用。1991年，Matsuura et al. 引入了套管技术，即将血管壁外翻至一个合成圆筒上，从而极大地促进了颈段心脏移植模型的建立7。该技术随后被应用于多种实验性移植模型，包括肾脏8、胰腺9、肢体10、肝脏11,12、肺13,14以及血管移植15。与缝合技术相比，采用套管技术所需吻合时间更短，因而热缺血时间也更短，并且血管并发症显著减少16。此外，该技术使缺乏显微外科训练的外科医生也能以较高的成功率完成手术。套管技术的一个缺点是必须结扎颈总动脉，这可能会影响脑部灌注。
在本视频论文中，我们介绍了一种改进且简化的用于小鼠颈部心脏移植的套管技术。
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方案
所有实验均经德国慕尼黑德国心脏中心及巴伐利亚州政府批准（批准号：Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13）。动物饲养于特定病原体-free设施中，并依照美国国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及国家科学院发布的《实验动物护理与使用指南》（美国国立卫生研究院出版物编号86-23，1985年修订版）接受人道护理。
注意：该操作需要一套完整的无菌显微外科器械，包括两把弯镊和血管扩张器（图2a）。围手术期抗生素预防通常并非必需，但在免疫功能受损动物中可能需要。动物通过终末期吸入异氟烷实施安乐死。
供体准备与移植物获取
- 通过腹腔注射咪达唑仑（5.0 mg/kg）、美托咪啶（0.5 mg/kg）和芬太尼（0.05 mg/kg 体重）对动物进行麻醉。将小鼠仰卧位固定于手术区域，并通过足底回缩反射确认手术耐受状态。
- 用氯己定对皮肤消毒三次，行腹正中切口。用湿纱布将肠管向左牵开，暴露下腔静脉。
- 通过下腔静脉注射50 IU肝素（溶于0.4 ml生理盐水中）以实现抗凝。肝素化1分钟后切开血管。
- 切开膈肌，行双侧开胸术以暴露心脏。将前胸壁向上翻转，并用夹子固定。
- 切除胸腺，钝性分离主动脉与肺动脉干之间的结缔组织。切开右上腔静脉。
- 用安装在5 ml注射器上的30 G针头在头臂干水平穿刺游离的升主动脉，以3 ml 4 °C冷停跳液缓慢逆行灌注心脏，避免压力过高。防止空气进入冠状动脉循环。将冰冻生理盐水滴加至移植心脏表面，进一步加强心脏停搏效果。
- 在头臂干起始处近端横断主动脉。
- 用8-0丝线紧靠心脏结扎下腔静脉及双侧上腔静脉，并在结扎线远端将其横断。
- 尽可能向远端游离肺动脉干。用8-0丝线紧靠分叉处结扎肺动脉，并在结扎线远端将其横断。
- 用单根8-0丝线将肺静脉整体结扎后横断。
- 取出供体心脏，保存于冰冻停跳液中，直至移植时使用。
2. 受体准备
- 在显微镜下使用11号手术刀 或剪刀 切割聚酰亚胺管，制备用于吻合的套管。该套管由一个圆柱形主体和一段延伸部分（占周长的1/3）组成，用于放置血管夹，每段长度均为1 mm（图2b）。
- 对动物进行麻醉，并如上所述确认其手术耐受性。皮下注射（s.c.）0.25 ml温盐水溶液以补充液体。
- 使用电动剃须刀去除右侧颈区的毛发，并将动物仰卧位固定于加热垫上。用胶带固定四肢，注意避免过度拉伸前肢，以免影响呼吸。使用眼膏覆盖眼睛，防止角膜干燥。用氯己定对术区消毒三次。
- 从右侧下颌角至胸骨上切迹做一横向皮肤切口。
- 钝性游离颈外静脉。使用双极镊凝固并切断其侧支。
- 在颌下腺静脉汇合处水平，于结扎线之间切断颈外静脉。
- 将颈外静脉穿过套管，并通过在套管的延伸部分放置血管夹近端阻断血管。移除结扎线，并用1:10肝素化盐水冲洗血管腔。
- 将血管壁外翻覆盖于套管上，并用预置的环形8-0丝线结扎固定。
- 切除胸锁乳突肌的浅层部分。
- 游离右侧颈总动脉，并在颈动脉分叉下方的结扎线之间横断血管。
- 将颈总动脉穿过套管，并通过在套管的延伸部分放置 Yasargil 夹近端阻断血管。移除结扎线，并用1:10肝素化盐水冲洗血管腔。
- 使用血管扩张器轻柔扩张动脉腔，将血管壁外翻覆盖于套管上，并用预置的环形8-0丝线结扎固定。
- 为获得足够的移植物植入空间，切除右侧颌下腺叶。
- 在植入前保持手术区域湿润。
3. 移植物植入
- 将移植物倒置于受体颈部区域，使主动脉朝向内侧，肺动脉朝向外侧。
- 将移植物的主动脉套入套管，并覆盖颈动脉，然后用一圈8-0丝线结扎固定吻合口。
- 在肺动脉干前侧做切口，将其与颈外静脉一同套入套管。再次用一圈8-0丝线结扎固定吻合口。
- 先松开颈外静脉上的血管夹，随后松开颈动脉上的血管夹。心脏立即充盈血液。为促进再灌注，可在移植物表面滴加37 °C温生理盐水。通常心脏在一分钟内恢复窦性心律。移除静脉侧的套管延长部分。
- 确认移植物位置正确，吻合口应无张力，血管无扭曲。切勿电灼皮肤血管，以免影响伤口愈合。出血通常可自行停止。用单根8-0连续缝线缝合皮肤。
4. 术后护理
- 皮下注射 0.25 ml 温热的生理盐水溶液以补充液体。
- 为拮抗麻醉药物，皮下注射纳洛酮（1.2 mg/kg）、氟马西尼（0.5 mg/kg）和阿替美唑（2.5 mg/kg 体重）。将动物留在加热垫上，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。至少继续观察动物一小时，记录任何异常行为。在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同处的环境中。
- 术后至少 72 小时内，按照本地机构规程，提供预先镇痛治疗，使用布托啡诺（0.05 mg/kg，皮下注射，每日三次）或其他替代性镇痛方案。
- 外科医生和兽医应定期检查动物。若出现体重减轻 >15%、精神萎靡、肿胀或手术部位感染等情况，应采用终末期异氟烷吸入法对动物实施安乐死。
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结果
我们的团队在经过约20次训练手术后，能够成功完成所述技术操作。最具挑战性的步骤是将颈动脉的血管壁外翻至套管上，因为血管壁容易回弹，多次尝试可能导致血管壁撕裂。经过训练阶段后，平均总手术时间为60 ± 8分钟。其中供体取材约需20分钟，颈部血管准备需25分钟，吻合及皮肤缝合约需15分钟。
为研究心肌缺血/再灌注损伤，我们在多种实验条件下对同基因型C57BL/6小鼠进行了200多次手术操作，手术成功率达92%。早期死亡原因包括吻合操作困难（n = 3）、吻合口漏（n = 2）和心肺功能衰竭（n = 10）。另有1只动物因术后出现神经功能障碍而实施安乐死。在围手术期存活的动物中，移植物存活情况为 >7天时达到95%图4)。许多同系移植受体存活超过3个月。尽管未使用抗生素预防，我们未观察到任何感染性并发症。
在第一组实验中，12只同系型C57BL/6小鼠接受了移植，用于组织病理学检查（图3）。移植物在冰上4 °C条件下保存，经历4小时冷缺血后进行移植。再灌注7天...
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讨论
我们在多种实验条件下已完成超过200例心脏移植，成功率超过90%。采用此处所述的技术，经验丰富的外科医生可在60分钟内完成整个手术过程。通过在器官获取前预先准备颈部血管，移植物的总缺血时间可缩短至20分钟。与缝合技术相比，使用套管技术可显著缩短植入时间（即热缺血时间）16。
与先前所述的直接切除心脏的方法不同5,17，我们通过灌注临床上使用的停跳液 并结合低温来诱导心脏停搏。 晶体 Custodiol HTK 溶液含有 10 mmol/L 钾，以及低浓度的钠、钙和镁，可有效实现心脏停搏。其中添加的组氨酸、色氨酸和α-酮戊二酸可减轻酸中毒，提供 ATP，并在缺血期间保护细胞膜。 该方法模拟了体外循环手术中可控性心脏停搏的临床状态，使此模型成为研究心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的理想选择。此外，该模型允许在冷缺血开始时将药物直接加入停跳液中。移植物可在 0–4 °C 下保存，最长保存时间不超过 4 小时。过长的缺血时间可能导致心肌收缩功能减退，并引发右心腔过度扩张及出血等并发症。
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
M.-A. Deutsch 获得德国心脏研究基金会（Deutsche Stiftung für Herzforschung）和德国胸心与血管外科学会（Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie）鲁斯切研究项目（Dr. Rusche Forschungsprojekt，2014年）的支持。M. Krane 获得德国心脏研究基金会（F/37/11）、德国心血管研究中心（DZHK B 13-050A；DZHK B 14-013SE）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，KR3770/7-1；KR3770/9-1）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 JFC-7.2 | S&T | P-00036 | 弯曲尖端 0.20 mm |
| 血管扩张器 D-5a | S&T | S-00124 | |
| 外膜剪刀 | S&T | S-00102 | |
| 血管夹 B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil 夹 | Peter Lazic | 65,097 | 长度 3.5 mm |
| 双极电凝镊 | Micromed | 148-100-011 | 尖端 0.25 mm |
| 聚酰亚胺管 | River Tech Medical | 19-24 号 | |
| 8.0 丝线结扎线 | Catgut | ||
| Custodiol HTK 溶液 | Essential Pharmaceuticals |
参考文献
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重印与许可
