离体灌注大鼠心脏中缺血-再灌注损伤的诱导与评估

摘要

离体大鼠心脏是研究缺血再灌注损伤的经典模型。本文描述了通过以下步骤从大鼠体内获取跳动心脏的过程 原位 主动脉插管，心脏的朗根多夫灌注，模拟缺血-再灌注损伤，以及梗死染色以确认缺血损伤程度。

摘要

急性期缺血再灌注损伤所涉及的生化事件对于推进心肌梗死及胸部手术相关心脏并发症的新型治疗策略具有重要意义。某些药物能够对心肌产生缺血预处理作用，从而抵抗缺血再灌注损伤，这一特性已促使多项临床试验的开展，但收效甚微。离体心脏模型可实现对缺血再灌注损伤功能效应的实时急性观察，包括在缺血-再灌注损伤时间窗内任意时间点给予不同药理学干预措施的效果。由于短暂的缺血可使心脏对后续缺血性损伤产生预处理保护作用， 原位 主动脉插管用于对未经预处理的心肌进行功能评估。将一个充满生理盐水的球囊置入左心室，以实现实时压力生成的测量。通过停止灌流液流动来模拟缺血损伤，随后进行再灌注。可根据需要调节缺血和再灌注的持续时间，以在特定时间点检测相应的生化事件。尽管朗根多夫（Langendorff）离体心脏模型无法考虑影响缺血与再灌注的全身性因素，但它非常适合研究缺血-再灌注损伤时间窗内的急性功能与生化变化，以及药物干预对心脏预处理和后处理效应的影响。本实验方案的目标是演示如何执行 原位 主动脉插管与心脏切除，继而在朗根多夫模型中诱导缺血/再灌注损伤。

引言

阐明心肌缺血及再灌注过程中心脏反应的内在机制，对于改进心肌梗死的治疗至关重要¹ 且需要主动脉阻断的心脏外科手术²。尽管 体内 缺血再灌注损伤模型虽然在终点分析方面具有很高的实用价值，但在实时研究缺血再灌注损伤的急性功能效应方面效果有限。此外， 体内 缺血再灌注模型通常会导致梗死面积存在显著变异性，且在再灌注时将药物直接递送至心脏具有挑战性。采用兰格多夫离体心脏系统研究缺血再灌注损伤，可实现对药理学干预的实时功能评估，产生一致的梗死组织区域，并能够将药物瞬时直接递送至心肌。

1895年，Oscar Langendorff 首次描述了离体 Langendorff 心脏模型³，该模型已被用于缺血再灌注损伤研究长达40年，是研究缺血再灌注损伤的可靠模型^4,5。本文对这一模型进行了若干改进，以优化其在功能分析中的应用。在体状态下对跳动的心脏进行主动脉插管，可确保心脏不经历缺血预处理，从而避免对缺血再灌注实验结果造成干扰⁶。为实现这一点，需进行气管切开术，以实现通气并保障大鼠在手术期间的生理稳定性。随后，将心脏连接至一个带有玻璃水套的螺旋柱，通过逆向灌流将 Krebs Henseleit 缓冲液直接注入主动脉。将一个充满生理盐水的球囊插入左心室，并连接至压力传感器，从而可实时测量心室内压力，并计算多种功能参数。实验结束后，用心....

方案

此处列出的所有操作步骤均已获得南卡罗来纳医科大学机构动物照护与使用委员会的批准。本文所述实验为急性、非存活实验，因此无需使用眼药膏，也不需要无菌手术环境。动物处死通过心脏采血时放血完成。

1. 实验准备

1. 安装恒压或恒流式朗格多夫灌流装置⁴.
2. 配制 4 L 改良 Krebs Henseleit 缓冲液（单位：mM：112 NaCl，5 KCl，1.2 MgSO₄）₄, 1 K₂HPO₄，1.25 CaCl₂, 25 NaHCO₃，11 D-葡萄糖，0.2 辛酸，pH = 7.4
   1. 配制10倍浓度的储备缓冲液。
      1. 溶解 NaCl、KCl、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O 和葡萄糖，使其在去离子水中终浓度分别为 119 mM、4.7 mM、1.2 mM、2.5 mM 和 11 mM。₄，以及 K₂HPO₄ 在3 L超纯水中。
      2. 溶解 CaCl₂ 在500 ml超纯水中加入40 ml 1 N HCl。
      3. 缓慢加入 CaCl₂ 将超纯水加至1.2.1.1中制备的缓冲液中，定容至4 L。搅拌1小时....

结果

左心室球囊装置可实现对收缩左心室所产生的压力进行实时监测（图1）。如先前所述⁷，该压力曲线可用于计算多种心室功能参数。这些参数可在基础状态阶段以及再灌注阶段进行计算，对每组内多条曲线取平均值后进行比较，以判断药理学干预是否引起心脏预处理效应，正如我们此前所开展的工作⁹。其中一项参数为发展压（developed pressure），其定义为收缩压与舒张末期压之间的差值。在正常灌注的大鼠心脏中，发展压的范围通常为70至130 mmHg（图1A）。在发生缺血损伤后，发展压降低，同时舒张末期压升高（图1B）。当在取出心脏前给予大鼠已知的预处理药物（如I类和IIb类HDAC抑制剂SAHA（vorinostat））¹⁸，则缺血-再灌注损伤所引起的发展压降低和舒张末期压升高现象会得到缓解（图1C）。其他左心室功能指标，例如压力上升速率（dP/dt_max）、压力下降速率（-dP/dt_max）以及心率-血压乘积（.......

讨论

离体灌注大鼠心脏可成功用于研究药物干预对缺血再灌注损伤中心脏预处理的影响⁹然而，该实验流程中有一些关键步骤必须标准化，以确保结果的可重复性。维持系统内温度为37.4 °C至关重要，因为即使轻度的低体温或高体温也可能引发心脏预处理效应。^10,11从注射麻醉剂到切除心脏的整个过程必须尽可能缩短，因为长时间暴露于氯胺酮可能干扰心脏的预处理保护效应。¹²及时进行主动脉插管 原位 对于防止心脏在摘取前出现缺氧或动物失血过多至关重要。总体而言，从开始切口到取出心脏的时间不应超过6-8分钟。每次实验前必须检查左心室球囊是否漏液，必要时予以更换。系统须进行细致维护，每次运行后需用蒸馏水彻底冲洗整个装置，并根据需要更换磨损的管路，以防止管路内部发生泄漏或污染。

离体心脏可用于多种创新用途，包括荧光成像¹³、核磁共振波谱分析⁷以及光学标测¹⁴等。该系统还可进行改造，以灌注来自不同动物的心脏，包括小鼠。这一改造尤为重要，因其使得利用转基因小鼠开展实验成为可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541
硫酸镁	Sigma Aldrich	203726
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	RES20765-A7
二水合氯化钙	Sigma Aldrich	C8106
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G8270
辛酸	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma Aldrich	T8877
医用压力传感器	MEMSCAP	SP844
Masterflex 蠕动泵	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex 易装泵头	Cole Parmer	EW-07518-10
加热循环水浴槽	Lauda	M3
管路流量模块	Transonic	TS410
模块化研究控制台	Transonic	T402
在线流量传感器	Transonic	ME2PXN
PowerLab 数据采集装置	AD Instruments	PL3508
LabChart 数据采集软件	AD Instruments	MLU60/8