离体灌注大鼠心脏中缺血-再灌注损伤的诱导与评估

摘要

离体大鼠心脏是研究缺血再灌注损伤的经典模型。本文描述了通过以下步骤从大鼠体内获取跳动心脏的过程 原位 主动脉插管，心脏的朗根多夫灌注，模拟缺血-再灌注损伤，以及梗死染色以确认缺血损伤程度。

摘要

急性期缺血再灌注损伤所涉及的生化事件对于推进心肌梗死及胸部手术相关心脏并发症的新型治疗策略具有重要意义。某些药物能够对心肌产生缺血预处理作用，从而抵抗缺血再灌注损伤，这一特性已促使多项临床试验的开展，但收效甚微。离体心脏模型可实现对缺血再灌注损伤功能效应的实时急性观察，包括在缺血-再灌注损伤时间窗内任意时间点给予不同药理学干预措施的效果。由于短暂的缺血可使心脏对后续缺血性损伤产生预处理保护作用， 原位 主动脉插管用于对未经预处理的心肌进行功能评估。将一个充满生理盐水的球囊置入左心室，以实现实时压力生成的测量。通过停止灌流液流动来模拟缺血损伤，随后进行再灌注。可根据需要调节缺血和再灌注的持续时间，以在特定时间点检测相应的生化事件。尽管朗根多夫（Langendorff）离体心脏模型无法考虑影响缺血与再灌注的全身性因素，但它非常适合研究缺血-再灌注损伤时间窗内的急性功能与生化变化，以及药物干预对心脏预处理和后处理效应的影响。本实验方案的目标是演示如何执行 原位 主动脉插管与心脏切除，继而在朗根多夫模型中诱导缺血/再灌注损伤。

引言

阐明心肌缺血及再灌注过程中心脏反应的内在机制，对于改进心肌梗死的治疗至关重要¹ 且需要主动脉阻断的心脏外科手术²。尽管 体内 缺血再灌注损伤模型虽然在终点分析方面具有很高的实用价值，但在实时研究缺血再灌注损伤的急性功能效应方面效果有限。此外， 体内 缺血再灌注模型通常会导致梗死面积存在显著变异性，且在再灌注时将药物直接递送至心脏具有挑战性。采用兰格多夫离体心脏系统研究缺血再灌注损伤，可实现对药理学干预的实时功能评估，产生一致的梗死组织区域，并能够将药物瞬时直接递送至心肌。

1895年，Oscar Langendorff 首次描述了离体 Langendorff 心脏模型³，该模型已被用于缺血再灌注损伤研究长达40年，是研究缺血再灌注损伤的可靠模型^4,5。本文对这一模型进行了若干改进，以优化其在功能分析中的应用。在体状态下对跳动的心脏进行主动脉插管，可确保心脏不经历缺血预处理，从而避免对缺血再灌注实验结果造成干扰⁶。为实现这一点，需进行气管切开术，以实现通气并保障大鼠在手术期间的生理稳定性。随后，将心脏连接至一个带有玻璃水套的螺旋柱，通过逆向灌流将 Krebs Henseleit 缓冲液直接注入主动脉。将一个充满生理盐水的球囊插入左心室，并连接至压力传感器，从而可实时测量心室内压力，并计算多种功能参数。实验结束后，用心冰冷的生理盐水灌流心脏以终止收缩，并将心脏迅速浸入液氮中速冻，以便后续进行 DNA、RNA 和蛋白质水平的分析。经过上述改进后，Langendorff 灌流心脏系统可作为在缺血再灌注损伤过程中任意急性时间点直接监测药物干预生理效应的有效平台。

方案

此处列出的所有操作步骤均已获得南卡罗来纳医科大学机构动物照护与使用委员会的批准。本文所述实验为急性、非存活实验，因此无需使用眼药膏，也不需要无菌手术环境。动物处死通过心脏采血时放血完成。

1. 实验准备

1. 安装恒压或恒流式朗格多夫灌流装置⁴.
2. 配制 4 L 改良 Krebs Henseleit 缓冲液（单位：mM：112 NaCl，5 KCl，1.2 MgSO₄）₄, 1 K₂HPO₄，1.25 CaCl₂, 25 NaHCO₃，11 D-葡萄糖，0.2 辛酸，pH = 7.4
   1. 配制10倍浓度的储备缓冲液。
      1. 溶解 NaCl、KCl、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O 和葡萄糖，使其在去离子水中终浓度分别为 119 mM、4.7 mM、1.2 mM、2.5 mM 和 11 mM。₄，以及 K₂HPO₄ 在3 L超纯水中。
      2. 溶解 CaCl₂ 在500 ml超纯水中加入40 ml 1 N HCl。
      3. 缓慢加入 CaCl₂ 将超纯水加至1.2.1.1中制备的缓冲液中，定容至4 L。搅拌1小时后，经0.8 µm滤膜过滤。4 °C保存。
      4. 将 NaHCO₃ 溶解于₃ 在4 L超纯水中溶解，搅拌1小时后经0.8 µm滤膜过滤，4 °C保存。
   2. 将400 ml 10倍克雷布斯-亨塞尔特缓冲液与400 ml 10倍NaHCO₃混合₃ 缓冲液。加入超纯水定容至4 L，搅拌下溶解葡萄糖和辛酸。经0.8 µm滤膜过滤。
3. 准备心脏系统。
   1. 将2 L过滤缓冲液加入置于38英寸高处的4 L瓶中 止血钳上方连接主动脉插管处。这将向心脏输送70-80 mmHg的灌注压力，此为推荐的灌注压力⁴.
   2. 将气体分散式鼓泡器插入瓶中的缓冲液内。
   3. 运行缓冲液通过系统，确保清除管路内的任何气泡。
   4. 打开气体（95% O₂）₂/5% CO₂₂至少在心脏放置于系统前30分钟，使用气体流量探头和血气分析仪检测氧饱和度。
4. 准备手术器械和球囊。
   1. 用于心脏采集时，准备6.75英寸手术剪1把、4.5英寸剪刀1把、止血钳2把、卡兰马尔钳2把、带27 G针头的注射器2支、0号丝线2段（每段长约15 cm）、1/16英寸带倒刺套管1个以及气管套管1个。
   2. 组装气管插管时，将一段短的直径为1/16英寸的塑料管连接到Y型接头，并用胶水固定。
   3. 组装球囊装置：将灌胃针连接至一段1/16英寸管路，再将管路连接至压力传感器外壳。在压力传感器外壳的另一端连接一个小型注射器，用于充盈和排空球囊。
      1. 剪一块方形塑料膜，将灌胃针的尖端置于其中心位置，然后将塑料膜包裹在灌胃针周围。
      2. 用生理盐水填充气球，并用两条缝线结扎。充气以确保无泄漏。充胀后气球内生理盐水的体积应约为 200 µl，但可根据大鼠的大小有所变化。
      3. 或者，可使用乳胶指套代替塑料薄膜。将灌胃针插入指套内，注入生理盐水后扎紧。

2. 收集心脏

1. 使用断头器或其他手动固定装置固定一只Sprague Dawley大鼠。称重大鼠体重。
2. 通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮0.85 mg/kg，赛拉嗪0.15 mg/kg）以麻醉大鼠。  此剂量的麻醉剂可提供20–40分钟的充分麻醉，但应在确认麻醉成功后尽快完成操作。
3. 通过测试足趾夹捏反射确认麻醉深度是否合适。
4. 气管切开术
   1. 使用止血钳提起从前肢中部至下颌基部的皮肤，用剪刀做切口以去除毛皮。保持皮肤抬高，使其与下方肌肉分离，以便沿皮肤剪开并完整去除。
   2. 使用止血钳提起腺体组织，并在腺体组织下方的筋膜上做一横向切口。用止血钳将切口撑开，注意避免损伤颈静脉。
   3. 使用止血钳夹住气管上方的肌肉，用剪刀在止血钳尖端稍下方的肌肉上做一横向切口。再用止血钳将组织分开，暴露气管。
   4. 小心将止血钳插入气管下方，边缓慢推进和回撤止血钳，边轻柔地分离筋膜。
   5. 当止血钳成功置于气管后方时，用止血钳夹住0-0丝线，并用小型锐利剪刀将气管横向剪开一半。
   6. 将气管插管插入已半切开的气管中，将丝线绕至气管后方，用外科结将丝线绑紧在插管处的气管上，并将结固定于插管的Y形槽内以锚定插管。
   7. 使用27 G针头，向颈静脉注射1,000 U/kg肝素，使其循环30秒。
5. 开胸术
   1. 用止血钳夹起腹部中段至前肢中段区域的皮肤，用剪刀剪除毛皮。
   2. 在膈肌稍下方的腹壁肌肉上做一长约¾英寸的横向切口。
   3. 沿胸骨方向在腹壁和胸壁上做一纵向切口。
   4. 双侧剪开膈肌，然后撑开肋骨，暴露心脏，并用止血钳夹住肋骨以保持其张开状态。
   5. 使用止血钳轻轻移除胸腺，暴露升主动脉。
   6. 将止血钳尖端穿过主动脉环，通过反复推进和回撤止血钳，并轻柔撑开筋膜，使止血钳尖端顺利通过。
   7. 用止血钳将0-0丝线绕至升主动脉后方，将丝线打成一个松散的半方结。
   8. 转动三通阀以开始灌注液流动，将主动脉半切开，立即插入灌注插管。迅速收紧半方结并完成打结，确保牢固结扎。
   9. 用剪刀将心脏从大血管处解剖分离，取出心脏并连接至灌注柱。
   10. 修剪多余肺组织，将心脏固定于灌注柱上，以10–20 ml/min的正常流速用灌注液冲洗约15分钟，待其平衡后再插入球囊。

3. 兰根多夫灌注与缺血再灌注损伤

1. 左心室压力球囊的放置
   1. 将球囊放气，同时卷成圆锥形，并转动三通阀以确保球囊保持放气状态。
   2. 使用小型剪刀切除左心房，以暴露二尖瓣的通路。
   3. 将球囊经左心房和二尖瓣插入左心室。
   4. 启动压力监测软件（LabChart Pro）。
   5. 打开三通阀，缓慢向球囊内注入生理盐水，使微型压力计显示的舒张压读数超过零。
   6. 为检测长度-张力反应，缓慢充盈球囊至舒张压达75 mmHg，再缓慢放气，重复一次。
   7. 通过调节球囊内生理盐水量，将舒张压设定为10 mmHg。转动三通阀以在此充盈水平下封闭球囊，并维持左心室球囊与压力传感器之间的密闭压力系统。
   8. 将心脏放入加热腔室中，并用塑料膜覆盖腔室。
2. 缺血-再灌注损伤的实施
   1. 堵塞加热腔室底部，使腔室内充满灌流缓冲液。
   2. 当缓冲液完全浸没心脏后，转动三通阀以停止向心脏灌注缓冲液，从而诱导全心缺血。缺血时间可根据实验目的进行调整。
   3. 缺血30分钟后，转动三通阀以恢复向心脏灌注缓冲液，启动再灌注。
   4. 再灌注持续1小时后终止实验。可根据实验目的采用不同的再灌注时间。
3. 实验终止与组织取材
   1. 通过三通阀的侧端口，以10 ml/min的速度向心脏内注入10 ml、4 °C的磷酸盐缓冲盐水，使心脏停搏。
   2. 将心脏从灌流柱上取下，修剪掉残留的心房组织。
   3. 将心脏置于不锈钢组织切片模具中，用Parafilm膜覆盖后，放入-80 °C冰箱中冷冻8分钟，或直至心脏组织呈棉花糖样质地。
   4. 从冰箱中取出组织块，将剃刀片插入切片模具，将心脏切成2 mm厚的切片。也可购买其他切片厚度（非2 mm）的商用组织切块。
   5. 逐片取下切片并迅速投入液氮中进行速冻，用于后续生化分析。保留从心尖起的第三个心室切片用于梗死染色。
   6. 将组织从液氮中取出，保存于-80 °C冰箱中，待进行生化实验时使用。
4. 梗死染色
   1. 将第三个心室切片置于10 ml、1% w/v的氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，37 °C孵育15分钟。
      注：TTC孵育时间可为15或30分钟，染色效果无显著差异¹⁵。
   2. 将组织切片从TTC溶液转移至10%缓冲福尔马林中，室温孵育过夜。为获得最佳结果，应在24小时内取出心脏并完成成像⁴。
   3. 对染色后的切片进行拍照，并使用ImageJ等软件按照制造商说明书估算梗死面积。固定后应尽快拍照，因染料会随时间逐渐褪色。

结果

左心室球囊装置可实现对收缩左心室所产生的压力进行实时监测（图1）。如先前所述⁷，该压力曲线可用于计算多种心室功能参数。这些参数可在基础状态阶段以及再灌注阶段进行计算，对每组内多条曲线取平均值后进行比较，以判断药理学干预是否引起心脏预处理效应，正如我们此前所开展的工作⁹。其中一项参数为发展压（developed pressure），其定义为收缩压与舒张末期压之间的差值。在正常灌注的大鼠心脏中，发展压的范围通常为70至130 mmHg（图1A）。在发生缺血损伤后，发展压降低，同时舒张末期压升高（图1B）。当在取出心脏前给予大鼠已知的预处理药物（如I类和IIb类HDAC抑制剂SAHA（vorinostat））¹⁸，则缺血-再灌注损伤所引起的发展压降低和舒张末期压升高现象会得到缓解（图1C）。其他左心室功能指标，例如压力上升速率（dP/dt_max）、压力下降速率（-dP/dt_max）以及心率-血压乘积（...

讨论

离体灌注大鼠心脏可成功用于研究药物干预对缺血再灌注损伤中心脏预处理的影响⁹然而，该实验流程中有一些关键步骤必须标准化，以确保结果的可重复性。维持系统内温度为37.4 °C至关重要，因为即使轻度的低体温或高体温也可能引发心脏预处理效应。^10,11从注射麻醉剂到切除心脏的整个过程必须尽可能缩短，因为长时间暴露于氯胺酮可能干扰心脏的预处理保护效应。¹²及时进行主动脉插管 原位 对于防止心脏在摘取前出现缺氧或动物失血过多至关重要。总体而言，从开始切口到取出心脏的时间不应超过6-8分钟。每次实验前必须检查左心室球囊是否漏液，必要时予以更换。系统须进行细致维护，每次运行后需用蒸馏水彻底冲洗整个装置，并根据需要更换磨损的管路，以防止管路内部发生泄漏或污染。

离体心脏可用于多种创新用途，包括荧光成像¹³、核磁共振波谱分析⁷以及光学标测¹⁴等。该系统还可进行改造，以灌注来自不同动物的心脏，包括小鼠。这一改造尤为重要，因其使得利用转基因小鼠开展实验成为可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541
硫酸镁	Sigma Aldrich	203726
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	RES20765-A7
二水合氯化钙	Sigma Aldrich	C8106
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G8270
辛酸	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma Aldrich	T8877
医用压力传感器	MEMSCAP	SP844
Masterflex 蠕动泵	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex 易装泵头	Cole Parmer	EW-07518-10
加热循环水浴槽	Lauda	M3
管路流量模块	Transonic	TS410
模块化研究控制台	Transonic	T402
在线流量传感器	Transonic	ME2PXN
PowerLab 数据采集装置	AD Instruments	PL3508
LabChart 数据采集软件	AD Instruments	MLU60/8