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方法文章

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

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DOI：

10.3791/52910

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2015年12月3日

 ,  , 
1Primate Research Center, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

本文内容

摘要

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。

摘要

在发育过程中，造血细胞起源于一类特化的内皮细胞，即生血性内皮（hemogenic endothelium, HE）。对生血性内皮发育的建模研究 体外 对于内皮-造血转换及造血特化机制的研究至关重要。本文介绍了一种通过过表达不同组合的转录因子，高效诱导人多能干细胞（hPSCs）生成造血内皮（HE）的方法。使用ETV2与GATA1或GATA2转录因子的组合可诱导具有泛髓系潜能的HE，而GATA2与TAL1转录因子的组合则可生成具有红系和巨核系潜能的HE。在GATA2和TAL1组合基础上加入LMO2可显著加速分化过程，并提高红系和巨核系细胞的产量。该方法为从hPSCs高效、快速地诱导HE提供了有效途径，并可在培养皿中观察内皮-造血转换过程。本方案包括hPSCs的转导操作及转导后对HE和血液前体细胞的分析流程。

引言

人类多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力，并可分化为三胚层来源的细胞，包括血液细胞，因此成为研究造血发育机制、血液疾病建模、药物筛选、毒性研究以及细胞治疗开发的宝贵工具。由于胚胎中的血液生成由生血性内皮（HE）通过内皮-造血转化过程实现1,2，在体外培养中生成HE对于研究调控内皮向造血转化及造血特化过程的分子机制至关重要。目前研究HE的方法主要包括：在添加造血细胞因子的细胞聚集体（EBs）中诱导血液-内皮共同分化3-5，将hPSCs与支持造血的基质细胞共培养6,7，或在含有细胞外基质和细胞因子的二维培养体系中进行诱导8,9。这些经典分化方法依赖于外源信号作用于细胞表面，启动一系列分子通路级联反应，最终激活指导血液-内皮发育的转录程序。因此，这些体系中hPSCs分化的效率取决于这些信号的有效诱导、信号向细胞核的转导，以及特异性转录调控因子的继而激活。此外，在传统分化培养体系中研究HE通常还需通过细胞分选技术额外分离HE细胞。本文介绍一种通过过表达造血转录因子直接诱导HE和血液细胞的简便方案。该方法可在培养皿中高效诱导HE生成，并可直接观察内皮向造血转化过程，无需借助繁琐的细胞分选步骤来分离HE细胞。

通过过表达少数几个转录因子（TFs），可高效诱导人多能干细胞形成内皮-造血双潜能细胞（HE）和血液细胞。能够从人多能干细胞（hPSCs）诱导强效全髓系造血的最优转录因子组合包括ETV2与GATA1或GATA2。相比之下，GATA2与TAL1的组合则诱导红系-巨核系造血10。通过过表达这些因子对hPSCs进行重编程，可直接将其分化为VE-cad+CD43-CD73-的HE细胞，这些细胞随后逐步获得由早期造血标志物CD43表达所定义的造血表型7。这种基于慢病毒的直接重编程人多能干细胞的方法，适用于开展机制研究、内皮细胞向造血细胞转变过程的研究，以及造血发育与命运决定的转录调控研究。尽管当前方案描述的是利用转基因的组成型表达来生成血液细胞，但使用修饰后的mRNA也可获得类似结果10。

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方案

1. 病毒制备与转录因子组合

  1. 使用含有ETV2、GATA1、GATA2、TAL1和LMO2蛋白编码DNA的pSIN-EF1α慢病毒表达质粒制备溶液（表1）。
  2. 通过分光光度计在230 nm、260 nm和280 nm处测定吸光度，测量用于慢病毒生产的质粒制备物的浓度和纯度。注意：A260/280和A260/230值均大于1.8的DNA制备物通常被认为是高质量的。较低的A260/280值可能提示存在蛋白质污染，而较低的A260/230 值则提示存在盐类或苯酚等溶剂杂质。推荐的质粒浓度为1–3 µg/µl。
  3. 按照先前发表的方案11生产用于转导的慢病毒。诱导具有泛髓系潜能的造血内皮细胞（HE）需要共表达ETV2与GATA1，或ETV2与GATA2。诱导具有红系和巨核细胞潜能的HE则需要GATA2与TAL1。在GATA2和TAL1存在的情况下，加入LMO2可显著提高人多能干细胞（hPSCs）向红-巨核细胞系分化细胞的产量10。

2. hPSCs 培养方案

  1. 在传代前，将多能干细胞培养至70-80%融合度，形成边缘清晰的紧密克隆。传代前标记并去除自发分化的克隆。
  2. 根据制造商说明稀释商用细胞外基质凝胶（见表2），并在使用前于4 °C过夜包被6孔板，或于37 °C孵育至少1小时。细胞传代前，吸除基质，每孔加入2 ml新鲜的商用完全培养基（见表2），将培养板置于37 °C、5% CO2 环境中，直至细胞准备接种。
  3. 传代hPSCs
    1. 吸除含hPSCs的6孔板中一个融合孔的培养基，加入1.5 ml预热的Dispase II溶液（2 mg/ml，溶于DMEM/F12，经0.22 µm滤器过滤除菌）。在37 °C、5% CO2 条件下孵育5-7分钟，直至克隆边缘开始从表面脱离。
    2. 吸除Dispase II溶液，用2 ml新鲜DMEM/F12培养基轻柔洗涤克隆两次（加入后立即吸除）。随后使用5 ml玻璃血清移液管，加入3 ml新鲜商用完全培养基（见表2），反复吹打数次以解离hPSCs。
    3. 将0.5 ml细胞悬液加入含有1.5 ml商用完全培养基（见表2）的6孔板各孔中。将培养板前后、左右轻轻摇晃数次，以确保细胞均匀分布，然后放入培养箱。于37 °C、5% CO2 条件下培养18-24小时。
    4. 次日更换为新鲜商用完全培养基（见表2），并观察hPSCs形态。成功传代应形成小而贴壁良好、保持hPSC形态的克隆。hPSCs需每日每孔补充2.5-3 ml新鲜培养基，并在每4-5天、融合度不超过70-80%时进行传代。
      注意：若hiPSCs原在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上维持培养，则需转移至无饲养层条件，并传代2-3次后再进行转导，以确保高效分化。

3. 从人多能干细胞诱导造血内皮前体细胞（第0天，人多能干细胞的转导）

  1. 制备反应体系时，将1.3 ml商用完全无血清培养基（参见 表 2），病毒，polybrene，以及Y27632 ROCK抑制剂（表1加入1.3 µl 10 mM ROCK抑制剂至1.3 ml培养基中，终浓度为10 μM，并加入polybrene至终浓度6 µg/ml。
    1. 按每种病毒每个细胞0.5–1.0 MOI（感染复数）的终浓度，加入适量的病毒浓缩液。在单细胞悬液准备好之前，将反应液置于冰上或4 °C保存。
      注意：在 GATA1/ETV2、GATA2/TAL1 和 GATA2/TAL1/LMO2 反应体系中，每种病毒使用相同 MOI 值对于诱导分化最为理想。然而，在 ETV2/GATA2 转导的培养物中，相对于 ETV2 将 GATA2 的 MOI 值加倍可增强分化效果。因此，对于这些培养物，推荐 ETV2 与 GATA2 的 MOI 比例为 1:2（ETV2 为 1 MOI，GATA2 为 2 MOI）例如 若病毒浓缩液的浓度估计约为 6.8 x 107 颗粒/ml，向 0.68 × 10⁶ 个细胞中加入 10 µl ETV2 和 20 µl GATA2 病毒浓缩液6 每个ETV2/GATA2反应使用一个6孔板中的35 mm孔，每孔细胞数
  2. 将hPSCs制备成单细胞悬液。
    1. 在无饲养层条件下培养人多能干细胞（hPSCs），具体操作如第2节所述。在末次传代后的第4天，在倒置显微镜下观察细胞密度和形态。hPSCs应形成边界清晰、排列紧密的克隆，无自发分化现象，并在转导当天达到约60–70%的融合度。
    2. 吸弃培养基，加入 1.5–2 ml 商业细胞解离试剂（表1每孔加入，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 5-7 分钟。
    3. 将细胞收集到等体积的商用完全培养基中（参见 表2) 加入10 µM ROCK抑制剂，计数细胞并测定活力。以200 × g离心5分钟沉淀细胞，然后将细胞重悬于含10 µM ROCK抑制剂的商用完全培养基中，调整细胞浓度至3.4–5 × 106 每毫升细胞数
      注意：细胞活力对于成功的病毒转导及后续分化至关重要。通常，转导前的细胞活力应超过90%。
  3. 加入200 µl细胞悬液，其中含有0.68–1×10⁶6 细胞，加入到3.1中制备的1.3 ml反应液中
  4. 从2.2步骤中准备的过夜包被的6孔板中吸出基质溶液，将反应混合物转移至6孔板的一个孔中，并均匀分布细胞。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 孵育24小时。24小时后，至少80%的细胞应贴附于基质上。

4. 从人多能干细胞诱导造血内皮前体细胞（第1-7天）

  1. 转导后24小时，移除含病毒的培养基，并用商品化的不完全细胞培养基（见表1）洗涤贴壁细胞，然后每孔加入3 ml含有造血细胞因子的商品化不完全细胞培养基：SCF 100 ng/ml、TPO 50 ng/ml、bFGF 20 ng/ml（以下简称3F培养基）。
  2. 在第2、3和第4天更换全部培养基为新鲜的3F培养基，以去除死亡细胞和碎片。第4天后，当出现悬浮的造血细胞时，每隔一天更换一半的3F培养基，同时保持总体积为4 ml。
    注意：pSIN-EF1α慢病毒表达质粒含有嘌呤霉素抗性基因，因此可用于转导细胞的阳性筛选。可在分化开始的前1–2天在培养基中加入1 μg/ml嘌呤霉素，以清除残留的未分化hPSCs。
  3. 第4天在倒置显微镜下观察细胞形态：开始出现具有典型内皮细胞形态的紧密细胞簇（图2A、图3A）。圆形血细胞从分化第5天至第7天出现，而某些区域可能仍保留hPSCs形态。按以下方法分析HE细胞及造血分化情况。
    注意：成功的造血内皮分化会产生折射性强的圆形细胞，这些细胞松散地附着于底层扁平的内皮细胞上。这些细胞活跃增殖并形成小的细胞团，最终脱离并悬浮于培养基中（图2A和图3A）。活的血细胞可根据其在培养条件下对光线的反射能力以及细胞扩张状态，与死亡或濒死细胞进行肉眼区分。

5. 血源性内皮（HE）分化阶段的分析。

  1. 通过显微镜观察细胞内皮样形态，在分化第3至第4天检测造血内皮（HE）的形成。在此分化阶段，培养物中无悬浮的血细胞。可通过使用VE-cadherin、CD73、CD226和CD43抗体进行免疫荧光染色及流式细胞术分析，确认HE的存在。
    1. 为通过流式细胞术分析评估HE形成，取自同一实验的第3天和第4天的细胞。将培养物在37 °C、5% CO2条件下，用商业细胞解离试剂（见Table 1）孵育5–10分钟以收集细胞，每项染色反应使用最多1 × 105个细胞（流式细胞术染色步骤详见12）。
      注意：VE-cadherin+的HE细胞表达早期造血标志物CD226，但不表达CD73和CD436。相反，非HE细胞表达CD73（图2B、图3B）。
  2. 人多能干细胞（hPSC）来源的HE的免疫荧光染色。
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁的单层细胞，然后在室温下用4%多聚甲醛固定30至60分钟。
    2. 再次用PBS洗涤细胞，然后在室温下用含0.1% Triton X-100的PBS通透20分钟。
    3. 用PBS洗涤细胞2至3次，随后在阻断缓冲液（含10%胎牛血清（FBS）的PBS）中孵育30至120分钟。
    4. 配制含两种一抗的染色液：将小鼠抗人CD43和兔抗人VE-cadherin抗体按1:1,000稀释于含5% FBS的PBS中（Table 1）。
    5. 吸除细胞上的阻断缓冲液，每孔加入1 ml含一抗的染色缓冲液；在室温下孵育3小时，或4 °C过夜。
    6. 用含5% FBS的PBS洗涤细胞三次。
    7. 配制第二步染色缓冲液：将驴抗兔二抗（绿色荧光染料标记）和抗小鼠二抗（红色荧光染料标记）按1:500稀释于含5% FBS的PBS中（Table 1）。每孔加入1 ml二抗染色缓冲液，在室温下孵育1小时。
    8. 用不含血清的PBS洗涤三次。用dH2O中300 nM DAPI工作液染色10–15分钟。
    9. 用PBS洗涤细胞两次，每孔加入2–3 ml PBS。使用绿色、红色和蓝色显微镜滤光片观察荧光信号。

6. 诱导造血前体细胞的分析

  1. 维持分化培养，直至悬浮细胞显著扩增，持续培养 10–14 天，每两天更换一半的 3F 培养基（更换方法见 3.1 节）。
  2. 使用商用细胞解离试剂（见表 1）在 37 °C、5% CO2 条件下处理细胞 5–10 分钟，以解离并收集正在分化的单层细胞。
  3. 使用抗 VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）、CD43 和 CD45 抗体进行流式细胞术，以评估培养物中的造血情况12。需注意，大量细胞（高达经 ETV2 和 GATA2 转导的细胞的 40%）共表达 VE-cad 和 CD43。以下抗体可用于检测诱导产生的血细胞前体扩增或分化后特定细胞谱系的表达：CD235a（红系细胞）、CD41a（巨核细胞系）、CD32（所有类型的髓系细胞）、CD66b（中性粒细胞）和 CD163（巨噬细胞）。
  4. 根据制造商说明书，使用商用克隆形成培养基（表 1）进行集落形成细胞（CFC）实验。
    1. 将 1–2 × 104 个细胞转移至 3 ml 商用克隆形成培养基中（见表 3），以评估集落形成细胞的数量及造血集落的类型。最佳接种密度应能确保识别和分离独立生长、互不重叠的单个集落。接种密度可根据分化效率在不同实验间有所调整，但每 1 ml 商用克隆形成培养基中接种的细胞数不应超过 1 × 104 个。
    2. 用轻柔涡旋混匀细胞与商用克隆形成培养基的混合液，将 3 ml 悬液分装至两个 35 mm 超低吸附培养皿中用于 CFC 实验，每皿加入 1.5 ml 悬液。均匀分布培养基后，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 14 天。避免扰动培养皿，并在实验第 7 天和第 10 天观察集落形成情况。
    3. 在第 14 天根据集落形态识别并计数造血集落。

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结果

过表达转录因子诱导人多能干细胞分化为造血细胞和血液细胞的示意图如图所示 图1. ETV2 与 GATA1 或 GATA2 联合可诱导泛髓系造血，而 GATA2、TAL1 联合或不联合 LMO2 则主要诱导红系-巨核系造血。这两种转录因子组合均可直接诱导生成造血内皮（HE）细胞，随后转化为具有不同造血分化谱系的血液前体细胞。人多能干细胞（hPSCs）从多能状态分化为产血的造血内皮细胞平均需要 4 天。圆形血细胞最早在分化第 5 天出现。随后，大量悬浮血细胞在培养体系中出现并持续扩增。为最大化悬浮血细胞数量，转导后的培养可延长至 10–14 天。目标谱系细胞可在低黏附条件下，通过添加适当的造血细胞因子组合进行扩增。 图2 展示利用ETV2与GATA1或GATA2转录因子从人多能干细胞（hPSCs）诱导血液细胞的生成。在转导ETV2与GATA2后，细胞在分化第4天呈现典型的内皮细胞形态，并最终在分化第6至8天转变为圆形的血细胞图2A). 分化第3-4天收集的细胞显示出典型的VE-cadherin+<...

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讨论

上述通过过表达转录因子实现人多能干细胞（hPSCs）向造血方向分化的方案，是一种快速且高效的方法，可用于从人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）生成造血内皮细胞（HE）以及髓系和红-巨核系祖细胞，从而实现由一百万个未分化干细胞产生多达三千万个血细胞10。该方法在多种hESC和iPSC细胞系中均表现出稳定的分化效率10。在ETV2与GATA2、GATA1因子，以及GATA2与TAL1因子诱导的分化过程中，细胞会形成具有造血能力的内皮细胞，即造血内皮（HE），并经历由内皮向造血细胞转变的过程。造血内皮（HE）的形成通常出现在分化第3至第4天。在GATA2与TAL1组合基础上加入LMO2（TAL1的转录共因子），可显著增强分化的稳健性，同时使HE阶段明显缩短。

转录因子介导的人多能干细胞定向分化成功与否主要取决于以下三个因素：（i）将核酸有效递送至细胞内；（ii）基因操作后细胞的存活率；（iii）细胞内外源转录本的有效翻译。

所述方法的关键步骤之一是有效慢病毒颗粒的制备...

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披露

I.S. 是 Cynata 的创始股东和顾问。

致谢

感谢 Matt Raymond 提供的编辑协助。本工作获得了美国国立卫生研究院（U01HL099773、R01HL116221 和 P51 RR000167）以及 Charlotte Geyer 基金会的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
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表1. 利用转录因子诱导人多能干细胞分化并分析生血性内皮细胞与血细胞

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro Addgene质粒 #61061慢病毒载体
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro Addgene质粒 #61063慢病毒载体
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro Addgene质粒 #61062慢病毒载体
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro Addgene质粒 #61062慢病毒载体
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro Addgene质粒 #61064慢病毒载体
六亚甲基溴化铵（Polybrene） Sigma-Aldrich107689-10G用于提高感染效率的阳离子聚合物
Y-27632（盐酸盐）ROCK 抑制剂STEMCELL Technologies72302RHO/ROCK 信号通路抑制剂 抑制 ROCK
StemPro Accutase 细胞解离试剂Life TechnologiesA11105-01细胞解离试剂
不完全（无生长因子）培养基                                              mTeSR1 定制配方 WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）MCF无 bFGF 和 TGFb 的无血清 mTeSR1 培养基 
人源 SCFPeprotech300-07优质级
人 TPOPeprotech300-18科研级
人碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B优质级别
CD144（VE-钙黏蛋白）FITCBD Biosciences560411内皮标志物（流式细胞术）
CD226 PEBD Biosciences338305造血（FACS）
CD43 PEBD Biosciences560199造血（FACS）
CD73 APCR&D 系统FAB5795A内皮细胞标志物（流式细胞术）
CD45 APCBD Biosciences555485造血（FACS）
7AADLife TechnologiesA1310活细胞/死细胞检测（流式细胞术）
多聚甲醛 Sigma-AldrichP6148-500G细胞固定 
Triton X-100 Sigma-AldrichT9284-500ML 透化 
FBSFisher ScientificSH3007003胎牛血清
小鼠抗人 CD43BD Biosciences551457用于免疫荧光（IF）染色的纯化初级抗体
兔抗人 VE-钙黏蛋白BenderMedSystemBMS158初级（IF）
抗兔 Alexa Fluor 488 标记JacksonResearch715-486-152二抗（IF）
抗小鼠 Alexa Fluor 594 标记JacksonResearch715-516-150 二抗（IF）
DAPI 核酸染色剂Life TechnologiesD1306 活细胞/死细胞检测（免疫荧光）
克隆形成培养基 MethoCult H4435 EnrichedSTEMCELL Technologies4435集落形成细胞实验
Wright染色液Sigma-Aldrich32857染色细胞离心涂片

表2. hPSCs 培养

人类多能干细胞（hPSCs） WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）hESCs（WA01、WA09）人胚胎干细胞；iPSCs（DF-19-9-7T、DF-4-3-7T）无外源基因诱导多能干细胞人多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力，并可分化为三个胚层的细胞
hPSCs 培养用完全无血清培养基                                                    mTeSR1 培养基  WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）M500 无血清  用于无饲养层培养ESC/iPSCs的含生长因子培养基
MatrigelBD 生物科学 / 康宁 356234人ESC/iPSC维持用培养基
DMEM/F-12，粉末 Life Technologies12500-062基础培养基 
HyClone Dulbecco's PBS 粉剂Fisher ScientificdSH30013.04PBS
Dispase II，粉末Life Technologies17105-041中性蛋白酶，细胞解离

表3. 用于检测病毒基因组整合的引物。

引物名称正向（Fwd）  5’ -->3’反向（Rev）5’-->3’描述 
pSIN EF1a FwdTTC CAT TTC AGG TGT CGT GA--EF1a 启动子序列
GATA1 反向引物--TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC 编码区 
GATA2 反向引物--GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG 编码区 
TAL1 反向引物--AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT 编码区 
LMO2 反向引物--GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC 编码区 
ETV2 反向引物--GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC  编码区 

参考文献

  1. Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
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