展示了一种高效、三步合成基于RAFT的荧光糖聚合物的方法，包括糖单体的制备、共聚反应和后修饰。该方案可用于制备具有理想结构的基于RAFT的统计型糖聚合物。
本文内容
摘要
摘要
合成糖聚合物是生化与生物医学研究多个领域中具有重要作用且用途广泛的工具。本文展示了一种基于可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合的简便高效方法，用于制备结构可控的荧光随机糖聚合物。该合成始于含β-半乳糖的糖单体——甲基丙烯酰胺乙基乳糖酰胺的制备，该单体由乳糖内酯与N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺（AEMA）反应获得。2-葡萄糖酰胺乙基甲基丙烯酰胺（GAEMA）则作为缺乏末端β-半乳糖苷的结构类似物使用。随后进行的RAFT介导的共聚反应包含三种不同的单体：N-(2-羟乙基)丙烯酰胺作为间隔单元，AEMA用于后续荧光标记，以及糖单体。反应中所用的RAFT试剂为耐水体系的（4-氰基戊酸）-4-二硫代苯甲酸酯。所得聚合物表现出低分散度（≤1.32）、可预测的共聚物组成以及良好的反应重复性。通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯对糖聚合物中AEMA上的伯胺官能团进行修饰，可获得荧光标记的聚合物。所得糖聚合物与凝集素的结合特异性通过与包被有特异性识别糖表位凝集素的琼脂糖微珠进行结合实验加以验证。由于该方法合成简便、产物组成控制精确且反应重复性好，本实验方案可推广应用于制备其他具有特定结构和组成的RAFT基糖聚合物。
引言
在过去二十年中，合成糖聚合物的研究进展虽缓慢但持续不断，在研究感染机制方面展现出巨大潜力，其中包括聚焦于凝集素识别过程的研究1-3。由于具有多价糖基团的合成糖聚合物相较于单价碳水化合物表现出更高的凝集素结合效率，因此在糖生物学领域备受关注3。在临床研究中尤其引人兴趣的是，利用荧光标记的糖聚合物来表征细菌凝集素介导的、与人类呼吸道细胞表面及黏液糖蛋白上可及碳水化合物的结合。早期的体外研究采用了市售的聚丙烯酰胺基糖聚合物进行细菌结合试验。其中若干探针显示出良好的应用前景，但引发了关于试剂可获得性以及聚合物分子量和糖表位含量在不同批次间存在差异的担忧。为此，已开发出一种经济高效的实验室内部方案，可有效控制靶向细菌凝集素的合成糖聚合物的结构组成、尺寸及纯度。
为了寻找一种合适的糖聚合物合成方法，研究人员测试了一种相对较新的聚合技术，该技术采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）试剂进行可控自由基聚合4。近年来，此类RAFT试剂已在少数糖聚合物的制备中得到应用5-7。与其他糖聚合物制备方法相比，RAFT介导的聚合反应展现出多项优势，包括对多种单体结构和反应条件的耐受性、潜在的水相兼容性，以及目标聚合物产物较低的分子量分散度8,9。尤其值得关注的是基于RAFT的三组分糖聚合物的制备方法，该方法可调控不同单体的组成，而每种单体可能具有不同的功能10-13。然而，此前大多数研究工作要么缺乏异头取代的碳水化合物10，要么采用分步聚合方式生成三嵌段共聚物，即由共价连接的均聚物片段组成的结构，这类嵌段共聚物的功能通常不同于统计型共聚物——后者是指单体残基序列遵循统计规律的共聚物9-13。
最近，在水相环境中使用硫代羰基硫代 RAFT 化合物（4-氰基戊酸）-4-二硫代苯甲酸酯，有研究报道了制备一组基于 RAFT 的线性三组分统计型糖聚合物，这些聚合物带有特定侧链糖基，并可用于凝集素介导的细菌结合实验14。本方法的总体目标以可视化方式展示，即通过 RAFT 控制的共聚反应制备三组分统计型荧光糖聚合物。由于该聚合反应采用一步法，操作简便，可精确调控聚合物的链长和组分，且反应重现性高，因此该方案可便捷地推广应用于其他具有目标结构的 RAFT 基糖聚合物的合成。
方案
1. 糖单体2-乳糖酰胺乙基甲基丙烯酰胺的合成
- 将2 g乳糖酸溶解于3.0 ml无水甲醇中，然后逐滴缓慢加入无水乙醇，直至溶液刚刚变浑浊，随后通过旋转蒸发去除溶剂。
- 将步骤1.1所得残余物溶于3.0 ml无水甲醇中，再次缓慢加入无水乙醇至溶液刚出现浑浊，然后通过旋转蒸发除去溶剂。重复此步骤3次，得到乳糖酸-1,5-内酯（1.94 g，98%产率）。该产物纯度足以用于后续反应。
- 将1.0 g乳糖酸内酯加入3.0 ml甲醇中 N(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺（AEMA，0.58 g）和对苯二酚单甲醚（MEHQ，1.0 mg，作为自聚合抑制剂）溶于2.0 ml甲醇中，随后加入1.0 ml三乙胺，室温下搅拌48小时。
- 加入 20 ml 去离子 H2O (dH2将甲醇和游离的三乙胺通过旋转蒸发至干燥除去。
- 为去除残留的乳糖二酸，加入 20 ml dH₂O2然后将水溶液通过阴离子交换柱（OH⁻）- 将10 mm × 20 mm的成型材料放入含有1.0 mg MEHQ的接收烧杯中。
- 通过旋转蒸发将第1.5步中产生的三乙胺蒸发至干燥而除去。
- 加入 20 ml dH₂O2O，并通过缓慢加入1 mg等份的阳离子交换树脂（H+ 直至检测不到与茚三酮反应的物质为止。每次加入树脂后，取1 µl溶液样品点于薄层色谱板上，用含2%茚三酮的乙醇溶液喷雾显色，以监测去除效果。当薄层板在90 °C加热1分钟时不出现深蓝色斑点时，即达到终点。
- 通过烧结玻璃漏斗过滤溶液，将滤液转移至试管中，在 -80 °C 下冷冻样品，然后进行冻干。
- 通过将冻干物溶于最小量的甲醇（约0.5 ml）以去除MEHQ，然后加入冷的无水丙酮（-20 °C，15 ml）使产物沉淀。使用烧结玻璃漏斗过滤收集沉淀物，再将沉淀物在真空干燥器中干燥，得到类白色粉末状的2-乳糖酸胺乙基甲基丙烯酰胺（LAEMA）（0.94 g，产率68%）。该产物纯度足以用于后续反应。
2. 单体2-葡萄糖酰胺乙基甲基丙烯酰胺的合成
注意：2-葡萄糖酰胺基乙基甲基丙烯酰胺（GAEMA）的制备方法不包含侧链糖基，该方法改编自已发表的文献方法15。
- 将2.0 g AEMA溶于10 ml甲醇中，加入到1.6 g D-葡萄糖酸内酯溶于30 ml甲醇的溶液中，在搅拌下缓慢加入1.6 ml三乙胺。
- 在室温下搅拌反应24小时。
- 使用烧结玻璃漏斗过滤析出的产物，用异丙醇每次10 ml洗涤沉淀三次，然后用10 ml无水丙酮洗涤。将析出的产物置于真空干燥器中干燥。
3. RAFT 糖聚合物合成
- 为了去除商业 N-(2-羟乙基)丙烯酰胺（HEAA）中存在的抑制剂 MEHQ，将 1 ml HEAA 加入 2 ml 微量离心管中，随后加入 0.5 g 氧化铝纳米颗粒。在 300 × g 条件下离心 30 秒，取上层 HEAA 用于后续反应。
- 将 32.8 mg LAEMA（70.0 µmol）、1.7 mg AEMA（10.5 µmol）和 27.5 µl HEAA（270 µmol）溶解于 0.4 ml dH2O 中，小心加入一个清洗干净的 1 ml 施伦克管中，使单体摩尔比为 20:3:77。
- 在平行反应中，为制备不含任何侧链糖基的对照聚合物，在步骤 3.2 中不使用 LAEMA，而是用 21.4 mg GAEMA（70.0 µmol）替代进行反应。
- 向相应的施伦克管（i.e.，3.2 或 3.3）中依次加入 50 µl 含 0.53 mg (4-氰基戊酸)-4-二硫代苯甲酸酯（1.9 µmol，RAFT 试剂）的 DMF 溶液，以及 50 µl 含 250 µg 4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸)（0.9 µmol，引发剂）的 DMF 溶液。轻轻敲击管壁混合均匀。
- 将施伦克管中的内容物置于干冰:乙醇浴（75 g 干冰加入 100 ml 乙醇）中冷冻，抽真空至 10–50 mTorr，然后关闭施伦克阀，使溶液缓慢升至室温。重复此冻–抽–融循环共三次。确保最后一次融化后所有试剂均完全溶解。
- 将施伦克管放入可密封的塑料袋中，抽出袋内空气后密封。将装有施伦克管的袋子转移至预热至 70 °C 的水浴中，孵育 24 小时。
- 小心将施伦克管中的溶液转移至预先准备好的透析袋（截留分子量 = 3,500）中，在 dH2O 中透析 24 小时（共 10 次，每次 2 L），前 8 小时每小时更换一次 dH2O。透析结束后，将样品从透析袋转移至试管中，在 -80 °C 冷冻，然后冻干。
注意：分别得到含有侧链 4-O-β-D-半乳吡喃糖基-D-葡萄糖酰胺（乳糖酰胺，来自步骤 3.2）或 D-葡萄糖酰胺（来自步骤 3.3）的统计学聚甲基丙烯酰胺/丙烯酰胺（PMA）共聚物。为便于讨论，将这两种糖聚合物分别简称为 PMA-LAEMA 和 PMA-GAEMA。
4. 聚糖聚合物的荧光标记后修饰
- 分别将约含 0.9 µmol 伯胺官能团的 5.0 mg 糖聚合物 PMA-LAEMA 或 PMA-GAEMA 溶解于 0.9 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 M 磷酸钠，0.15 M NaCl，pH 7.5）中。
- 在快速搅拌下，将 0.6 mg 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯溶于 100 µl DMF 后缓慢加入上述溶液中。在避光、室温条件下轻轻搅拌反应 16 小时。
- 在避光条件下，将样品加入预先准备好的透析袋（截留分子量 MWCO = 3,500）中，用 2 L 去离子水（dH2O）透析 16 小时，前 8 小时每小时更换一次透析液。透析完成后，将样品从透析袋转移至离心管中，于 -80 °C 冷冻，随后进行冷冻干燥。
注意：冻干后，分别得到荧光糖聚合物PMA-LAEMA-Fluorescein和PMA-GAEMA-Fluorescein。
5. 糖聚合物的表征
- 使用配备凝胶渗透色谱（GPC）软件、适用于目标分子量范围的GPC色谱柱和折射率检测器的商用高效液相色谱系统，以0.1 M Tris/0.1 M氯化钠缓冲液（pH 7）为流动相，流速为0.6 ml/min，测定糖聚合物的数均分子量 (Mn)、重均分子量（Mw）及分散度（Mw/Mn）14。采用聚乙二醇标准品作为分子量标准（分子量范围：200–1,200,000 g/mol）。
- 定量测定糖聚合物中伯胺官能团的实际浓度16。根据已发表的方法分析所合成糖聚合物的总碳水化合物含量17。
- 通过核磁共振波谱法（NMR）在D2O中对糖单体LAEMA、GAEMA以及糖聚合物PMA-LAEMA、PMA-GAEMA的结构组成和纯度进行检测14。
6. 合成糖聚合物与凝集素包被琼脂糖珠的结合试验
- 向50 µl Erythrina crista-galli 凝集素（ECL）包被的琼脂糖微珠悬浮液中加入1.5 ml PBS，以300 × g离心1分钟，小心移除并弃去上清液。重复此步骤两次，然后将微珠重悬于0.5 ml PBS中。
- 向微珠悬浮液中加入溶于6 µl PBS中的3 µg PMA-LAEMA-Fluorescein或PMA-GAEMA-Fluorescein（阴性对照），避光、室温孵育1小时。
- 用1.5 ml PBS洗涤混合物三次，将微珠重悬于0.2 ml PBS中。取4 µl等分试样加入免疫荧光显微镜载玻片（特氟龙涂层）的一个孔中，盖上盖玻片，使用FITC滤光片（激发波长：467–498 nm，发射波长：513–566 nm）和10倍物镜进行荧光显微镜观察，以检测荧光标记的糖聚合物与微珠的结合情况14。
结果
糖单体的合成
本文以乳糖二酸为例，说明糖单体的制备方法。采用LAEMA合成的初始报道中所述方法11进行制备时，产率波动较大且纯度不理想。采用阳离子和阴离子交换树脂去除未反应原料的改良纯化方法，可获得稳定的产品产率和高纯度，该结果已通过1H和13C核磁共振波谱（图1）确认。
RAFT 糖聚合物合成及糖聚合物与荧光染料的后期修饰
与通过分步RAFT聚合制备的嵌段糖聚合物不同，这种一步共聚方法在整个聚合物主链中实现了糖单体的均匀分布。此处所示的糖聚合物包含20 mol%的糖单体、77 mol%的HEAA作为间隔单元，以及3 mol%的AEMA作为后续修饰的靶点（见图2）。1H和13C核磁共振（NMR）波谱分析证实了PMA-LAEMA和PMA-GAEMA的结构（图3和图4）。如图5所示，与未使用RAFT合成的糖聚合物的凝胶渗透色谱（GPC）洗脱曲线相比，PMA-LAEMA和PMA-GAEMA均表现出较低的分散度，证明了RAFT方法的有效性。正如预期，由于PMA-GAEMA缺乏侧链糖基，其数均分子量（Mn）小于PMA-LAEMA。对RAFT糖聚合物中碳水化合物和伯胺官能团含量的分析表明，产物糖聚合物中单体的比例与RAFT介导聚合反应中所用起始单体的化学计量比一致（表1）。这表明所合成的糖聚合物中单体组成得到了精确控制，符合设计要求。
伯胺官能团与活化荧光团的反应是蛋白质标记中广泛使用的技术。本实验采用该技术将纯化的糖聚合物与羧基荧光素进行标记。修饰后，获得了荧光标记的聚合物（图6）。通过凝胶渗透色谱分析未检测到反应过程中荧光素标记聚合物的降解（数据未显示）。
合成糖聚合物与凝集素包被琼脂糖珠的结合试验
为了评估合成的糖聚合物与凝集素结合的特异性，使用了已知碳水化合物结合特异性的凝集素包被琼脂糖珠。实验中采用的Erythrina crista-galli凝集素（ECL）对β-D-半乳糖苷具有结合特异性。图7A清楚地表明，侧链含有β-D-半乳糖苷的PMA-LAEMA-荧光素表现出与ECL凝集素的强结合能力。相比之下，不含侧链糖基的糖聚合物PMA-GAEMA-荧光素对ECL凝集素无结合信号，结果如图7B所示。该结果例证了所合成的荧光糖聚合物的结合有效性及其亲和力。
图 1. LAEMA 的 1H- (a) 和 13C-NMR (b) 谱图 (D2O)。（此图改编自 Wang et al.14） 请点击此处查看此图的放大版本。
图2. 含β-半乳糖苷作为侧链糖基的荧光糖聚合物PMA-LAEMA的合成示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. PMA-LAEMA 糖聚合物的归属 1H- (A) 和 13C-NMR (B) 谱图 (D2O)。（此图经 Wang et al.14 修改） 请点击此处查看此图的放大版本。
图4. PMA-GAEMA 的归属 1H- (A) 和 13C-NMR (B) 谱图（D2O）。（此图改编自 Wang et al.14） 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5. 使用或不使用 RAFT 试剂制备的基于 RAFT 的 PMA-GAEMA 和 PMA-LAEMA 的凝胶渗透色谱（GPC）曲线。 与未使用 RAFT 试剂制备的 PMA-LAEMA（蓝色）相比，基于 RAFT 制备的 PMA-LAEMA（绿色）具有明显更低的分散度（Mw/Mn）。基于 RAFT 的 PMA-GAEMA（红色）与 PMA-LAEMA 具有相似的 GPC 谱图，但前者由于不含侧链糖基而具有更小的 Mn。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. PMA-LAEMA在荧光标记后修饰前后的状态。（A）与左侧未标记的白色糖聚合物（左管）相比，荧光素标记的PMA-LAEMA呈现明显的黄色（右管）。（B）在紫外光下，未标记的PMA-LAEMA（左管，PBS中1 mg/ml）无荧光，呈暗色；而荧光素标记的PMA-LAEMA（右管，PBS中1 mg/ml）则显示出强烈的绿色荧光。请点击此处查看该图的放大版本。
图7. Erythrina crista-galli 凝集素（ECL）包被的琼脂糖珠结合 含 β-D-半乳糖苷的糖聚合物，而非不含悬挂糖基的糖聚合物。 (APMA-LAEMA-荧光素3 µg) 与 ECL 表现出强结合，而 (BPMA-GAEMA-荧光素不含悬垂的β-D-半乳糖苷残基，因此不与凝集素包被的微珠结合。 比例尺 = 100 µm.
表1. 糖聚合物合成参数的目标值a与实际组成。 a) 目标值，即期望产物达到的数值；b) DP，聚合度；c) NA，不可用。请点击此处查看该图的放大版本。
| DPb | 分散度 | 糖单体实际含量 mol % | 伯胺实际含量 mol % | |
| 目标值 | 100 | < 1.3 | 20 | 3 |
| PMA-LAEMA | 99 | 1.26 | 19 | 3.2 |
| PMA-GAEMA | 89 | 1.32 | NAc | 2.7 |
讨论
本报告展示了一种简便高效的RAFT法三组分荧光糖聚合物的合成方案，包括含或不含侧链碳水化合物的糖聚合物，及其在凝集素结合试验中的应用。该方案首先制备糖单体LAEMA和GAEMA；通过一步RAFT控制的共聚反应，获得产率可重复、单体组成可预测且分散度低的糖聚合物。随后利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯对糖聚合游戏副本进行后修饰，即可方便地检测所得荧光标记糖聚合物对凝集素结合的特异性。
在后续糖聚合物合成中所用的糖单体的初步制备过程中，采用了易得的乳糖酸和葡萄糖酸内酯。理论上，任何感兴趣的碳水化合物，从单糖到复杂的寡糖，均可通过将目标糖连接至葡萄糖C6位的伯羟基上而转化为糖单体。在还原性葡萄糖残基被氧化并进一步脱水形成内酯后，该产物可迅速与AEMA上的伯胺反应，生成相应的糖单体。此路线的更多实例见于最近的一项报道14。需要注意的是，在进行任何聚合反应之前，必须在使用前立即从所有单体和糖单体的制备物中去除强效聚合抑制剂MEHQ。该过程可通过使用最少量的甲醇溶解含MEHQ的糖单体，随后立即在-20 °C下用丙酮处理，从而以高收率沉淀出不含抑制剂的产物，简便地实现。
在任何自由基聚合反应体系中，细节操作和单体纯度都至关重要。与典型的RAFT聚合体系一样，该体系包含自由基引发剂、RAFT试剂、单体和溶剂。本可视化展示描述了一种一步法RAFT聚合体系，重点在于通过含有三种不同单体的水溶液反应体系制备统计型共聚物。文中展示了两个独立的RAFT介导反应：其中一个使用了一种带有侧链非还原性碳水化合物末端（即 β-D-半乳糖）的糖单体，另一个则使用含有聚羟基但无共价结合碳水化合物残基的单体。这两个RAFT介导反应的共同之处在于，均包含一种带有单一羟基的单体作为间隔分子，以及另一种带有游离氨基的单体，可用于后续与氨基反应性荧光染料进行修饰。
由于反应混合物及环境中氧气的存在对RAFT介导的聚合反应具有不利影响，因此可通过多次冻–抽–化循环，在高真空条件下维持Schlenk反应管，从而将氧气去除至痕量水平。
需要注意的是，反应中不同单体的摩尔比可根据需要进行调整。此外，通过改变所用RAFT试剂的用量，可以控制所得聚合物的长度18。然而，RAFT试剂与引发剂的摩尔比应始终大于2，以确保产物具有较低的分散性。在这些条件下，共聚反应的进程是稳定的，反应的重现性非常高。尽管如此，由于各单体的聚合速率不同，在统计共聚物中获得所有参与单体完全均匀分布的可能性很小。对聚合物内不同单体分布情况的表征仍然极具挑战性。
与已报道的其他糖聚合物标记方法相比，本文所介绍的后修饰方法更为简便，且适用于更广泛的荧光标记物选择2,11。这些标记物包括多种水溶性胺反应性荧光染料、量子点、生物素以及其他类似试剂。通过已知结合特异性的凝集素，可方便地验证所合成的标记糖聚合物的结合特异性。不含侧链糖基的PMA-GAEMA可作为合适的阴性对照。通过该方法制备的带有不同荧光标记的糖聚合物，已成功应用于凝集素介导的细菌结合研究14。综上所述，这种简便高效的统计型荧光糖聚合物制备方法，将在多种糖生物学研究中展现出广阔的应用前景。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由密苏里大学实验站化学实验室以及密苏里囊性纤维化协会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 乳糖酸 | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| D-葡萄糖酸内酯 | Sigma-Aldrich | G2164 | |
| N-(2-羟乙基)丙烯酰胺 (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| 橙色II钠盐 | Sigma-Aldrich | O8126 | |
| 对苯二酚单甲醚 (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | 聚合抑制剂 |
| N-(2-氨乙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐 (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
| 三乙胺 | Fisher Scientific | BP-616 | |
| 阴离子交换树脂 IRN-78 氢氧型，80目 | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
| 阳离子交换树脂 50Wx8，200目 | Sigma-Aldrich | 217514 | |
| 氧化铝，~150目 | Sigma-Aldrich | A1522 | 型号 WN-6，中性，活性等级 Super I |
| 茚三酮 | Sigma-Aldrich | N4876 | 检测中使用0.2%茚三酮的乙醇溶液 |
| 4-氰基-4-(苯基碳硫基硫代)戊酸 | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT试剂 |
| 4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸) | Sigma-Aldrich | 11588 | 聚合引发剂 |
| 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | Life Technologies | C1157 | |
| 刺槐凝集素包被的琼脂糖珠 | Vector Laboratories | AL-1143 | |
| 溶剂 | |||
| dH2O | 由Barnstead纯水系统制备，电阻率为18兆欧·厘米 | ||
| 异丙醇 | Fisher Scientific | A461-4 | ACS级或更高 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A454-4 | ACS级或更高 |
| 无水乙醇 | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS级或更高 |
| 二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS级或更高 |
| 丙酮 | Fisher Scientific | A929-4 | ACS级或更高 |
| 设备 | |||
| 透析膜（截留分子量：3,500） | Spectrum Labs | 132720 | |
| 聚乙二醇分析标准品 | Sigma-Aldrich | O2393 | |
| 施伦克管，1 ml | Quark Glass | 定制 | |
| TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | 用于糖聚合物的GPC分析 |
| Empower 3 配备GPC/SEC模块 | Waters Corporation | ||
| Waters Alliance HPLC系统 | Waters Corporation | 配备示差折光检测器（Waters 2414）和荧光检测器（Waters 2475） | |
| Avance III 800 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker Corporation | ||
| BX43荧光显微镜 | Olympus Corporation | 糖聚合物结合试验中使用FITC滤光片 | |
| 旋转蒸发仪 | Heidolph | ||
| 砂芯漏斗 | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | ||
| 免疫荧光显微镜载玻片 | Polysciences | 18357-1 | |
| Revco Ultima Plus -80 °C 超低温冰箱 | Thermo Scientific | ||
| 塑料真空袋及手动抽气泵 | Ziploc | ||
| 直驱式真空泵 Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
| 真空计 | Sargent-Welch |
参考文献
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重印与许可
