不同杂草物种中抗除草剂性检测的可靠方案

摘要

本文介绍了一种用于确认杂草种群除草剂抗性的可靠且灵活的方法。该方案可通过少量调整，推断除草剂抗性水平，并适用于多种杂草物种和除草剂。

摘要

在整株植物水平上验证潜在除草剂抗性杂草种群的可靠方案对于确认其抗性状态至关重要。本文所述方案基于在温室中进行的整株生物测定法，可通过适当调整，便捷地适用于多种杂草种类和除草剂。从经田间除草剂处理后存活的植株上采集种子样品，干燥后于低温条件下保存备用。萌发方法需根据杂草种类及种子休眠类型进行调整。将处于相似生长阶段的幼苗移栽至温室，在适宜条件下培养，直至植株达到适合进行除草剂处理的生长阶段。配制除草剂溶液时需确保精确，以避免无法核实的误差。其他关键步骤，如施用体积和喷雾速度，亦需进行评估。与仅使用单一除草剂剂量的整株生物测定法相比，本方案的优势在于更高的可靠性以及能够推断抗性水平。该方法更为快速且成本较低 体内或体外 已提出多种诊断性筛选方法（如培养皿生物测定法、分光光度法），但这些方法仅能提供定性信息，且由于某些物种可能需要繁琐的准备工作，限制了其广泛应用。对于常规抗性检测，所提出的整株植物生物测定法可仅在单一除草剂剂量下进行，从而降低检测成本。

引言

除草剂是最广泛使用的杂草防控措施，占全球植物保护市场高达50%的份额¹。除草剂是一种相对廉价的工具，可避免劳动密集且耗时的土壤耕作实践，最终实现经济高效、安全且盈利的食品生产²。然而，许多杂草物种存在显著的物候和遗传变异性，加之对除草剂使用的过度依赖，常常导致除草剂抗性杂草种群被筛选出来。具有高度特异性代谢靶标的選擇性除草剂的引入^3-5，多年来显著增加了抗性案例的数量。迄今为止，全球已有240种杂草（140种双子叶植物和100种单子叶植物）对不同的除草剂作用位点（SoA）进化出抗性⁴。这对杂草管理构成了重大挑战，更广泛而言，也对可持续作物生产带来了严重影响。

基于可靠检测方法在温室中频繁开展的抗性早期检测，是管理除草剂抗性杂草的关键步骤。根据具体目标、所需准确度、可用时间与资源，以及所涉及的杂草种类，已发展出多种不同的检测方法。 ^6-12。然而，当需要确认一种新杂草生物型的抗性状态时（即， 一群个体具有若干共同的生理特征，包括能够耐受通常可防除它们的某一特定类别除草剂中一种或多种除草剂的剂量，针对此类情况，需在受控环境中进行可靠的整株植物生物测定 ^{4, 11}.

一种生物型通常不会仅对一种除草剂产生抗性。因此，每种生物型都具有特定的抗性模式，即 其对不同作用机理（SoA）除草剂的抗性种类和数量，以及对每种除草剂的特定抗性水平¹³。早期且可靠地确定交叉抗性或多重抗性模式^{5, 14}，对于田间抗性管理至关重要。

需要指出的是，除草剂抗性与某些杂草物种对某些除草剂表现出的天然耐受性无关，例如，双子叶物种对乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制类除草剂的耐受性、单子叶物种对2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的耐受性，以及问荆（Equisetum arvense）对草甘膦的耐受性。

本文介绍了一种针对田间采集的疑似除草剂抗性生物型进行检测的可靠方法，这些田块曾报告除草剂防治效果不佳。文中提出了与所涉杂草物种相关的标准实验方案的若干改进之处。相较于仅使用单一除草剂剂量的整株植物生物测定法¹⁵，或在培养皿中处理种子的方法⁸，本方法的优势在于实验中采用了两种除草剂剂量，从而提高了结果的可靠性，并可推断抗性水平。然而，在常规抗性检测中，也可仅采用单一除草剂剂量进行相同操作，以降低检测成本。

除了能够确认抗性状态外，所获得的信息还可用于优化后续研究步骤和/或制定合理的抗性管理策略。

方案

1. 种子取样与保存

1. 监测农田中除草剂效果不佳的异常情况， 即， 并非由不利的气候条件或低质量的除草剂处理所致。
2. 一次采集一个物种的种子样品，并赋予唯一编码。通常在作物收获前，从经受除草剂处理后仍存活的植株上采集成熟种子。需及时监测，观察种子成熟后是否由母株散落。
3. 为每个样本填写一份表格，注明分配的唯一编码、物种名称、采集日期、GPS坐标、所属市镇、农户姓名、田块面积、虫害程度、作物种类、当季使用过的除草剂以及该田块的历史记录。
4. 从至少30株随机选取且能代表田间侵染状况的植株上采集种子。确保种子样品包含不少于5,000粒成熟种子。对于专性异交杂草物种（例如， 羊茅属 种或 苋属 spp.），将植株数量减少至10-15株，使种子总数保持在约5,000粒 ¹¹.
5. 若杂草斑块分散在较大区域（超过一公顷），则需对田间进行分区域取样，因为不同抗除草剂生物型可能已被筛选出来。
6. 将种子存放在未密封的纸袋中，并用分配的唯一代码标记。
7. 让水分蒸发，但不要将种子暴露于高温下（即， 避免将其置于阳光下的汽车中或经历剧烈的温度变化，以防止次生休眠的诱导。
8. 清洁（去除杂质、脱去种壳）， 等等。）并在干燥室中于室温下保存。完成首次抗性检测后，将种子长期储存在4 °C的暗室中，最好置于真空密封的塑料袋内。通过这种方式，种子的活力可保持更长时间。

2. 打破种子休眠

注意：种子休眠为杂草提供了灵活且高效的机制，使其能够适应并长期存在于农业生态系统中。为了打破休眠并促进种子萌发，需根据不同杂草种类采用不同的处理方案。 即， 休眠类型 ¹⁶.
打破休眠主要有三种方法：

1. 春化作用
   注意：为了获得同步的种子萌发和幼苗出土，许多物种的种子需要经过数天至一周的春化处理，以解除生理休眠状态。 例如， Amaranthus retroflexus, 藜科菠菜属植物藜（Chenopodium album）, 羊茅属 种（spp.），野燕麦，红蓼，奇异鸭茅^17-19. 需要长达15天的较长时间 Papaver rhoeas, 碎米莎草 和 Ammania coccinea 最长可达30天 Schoenoplectus mucronatus²⁰.
   1. 在塑料培养皿中加入一些去离子水。剪取两层滤纸并浸入水中，去除多余水分后，将风干的种子放置于滤纸上。将塑料培养皿转移至4 °C冰箱中，冷藏所需时间。
2. 划痕
   注意：由于机械休眠，某些杂草物种比其他物种更难萌发。 即 种皮特性，需使用硫酸进行化学刻蚀以促进萌发 ²¹.
   1. 准备一个烧杯，装入浓硫酸（95-98%）。另准备一个盛满水的烧杯。将种子放入无纺布袋中。
   2. 浸泡 例如， 稗属 spp. 或 Sorghum halepense 分别在浓硫酸中处理种子20分钟或5分钟。
   3. 用镊子将信封从烧杯中取出，放入盛满水的另一个烧杯中。打开信封，将种子倒入一个小滤网中，在流动水下彻底冲洗。
   变体： A. plantago-aquatica 需要不同的实验方案 ^{22, 23}
   1. 将种子在氯仿中浸泡2分钟。用去离子水冲洗种子，并用吸水纸吸干。将种子浸入80%的硫酸中5分钟。
   2. 将种子放入一个小滤网中，在流动水下彻底冲洗。
3. 采后种子成熟
   注意：无论采用何种方法打破休眠，其他杂草物种的种子在成熟后的数月内完全不会萌发。
   1. 将种子在室温及低湿度条件下储存至少3-4个月，然后按照上述方案进行打破休眠处理例如， Oryza sativa 变种 sylvatica 或 P. rhoeas).

3. 种子萌发

1. 将待萌发的种子置于含有0.6%（m/v）琼脂并添加0.1%硝酸钾（KNO₃）的塑料培养皿中：
   1. 使用去离子水配制含0.6%琼脂和0.1% KNO₃的溶液，用微波炉溶解琼脂。
   2. 将琼脂溶液倒入塑料培养皿中，冷却凝固后放入种子。
   替代方法：塑料培养皿中也可使用土壤作为基质。该方法对Echinochloa spp.、S. halepense和Lolium spp.尤为有效。
2. 将塑料培养皿放入萌发培养箱中，光照和温度条件根据每种杂草物种的最适条件设定，持续约一周。对于大多数冬季生长的物种，昼夜温度设置为15/25 °C，光周期为12小时，使用荧光灯提供15–30 µmol m^-2 sec^-1的光合光子通量密度（PPFD）。对于许多夏季生长的物种，昼夜温度范围为15/30 °C。
   替代方法：某些物种（如S. halepense）需要热处理。因此，在完成破皮处理后，S. halepense种子需在萌发培养箱中经历以下条件：45 °C处理4小时、24 °C处理20小时，循环三天，随后在常规条件下继续培养三天。

4. 幼苗移栽与生长

1. 将15至20株幼苗移栽至装有标准育苗基质（体积比：60%粉壤土、15%沙、15%园艺珍珠岩和10%泥炭）的塑料托盘（325 × 265 × 95 mm）中。
   注意：与直接播种相比，移栽可获得生长阶段一致的均匀植株，这是优化除草剂处理效果的重要前提条件。
2. 使用条形码标记每个托盘，条形码中包含用于唯一识别的全部信息：种群代码、待测试除草剂、重复编号和连续托盘编号。
3. 将托盘放入加热的温室中，并根据需要浇水，以保持基质处于或接近田间持水量。
   注意：生长温度因杂草种类而异。试验常在秋季/冬季/春季进行，因此需使用400 W金属卤化物灯补充光照，提供约150 µmol m⁻² s⁻¹的光合光子通量密度（PPFD）。^-2 秒^-1 12小时光照周期 ^{24, 19}. 夏季杂草物种中的C₄ 光合作用循环通常需要较高的光照强度，因此测试一般在春末至夏季进行，或补充光照强度约为 400 µmol m⁻² s⁻¹^-2 秒^-1 14小时光照周期
4. 对侵染水稻田的某些杂草种类采用不同的处理方案， 例如， A. plantago-aquatica，S. mucronatus 和 C. difformis 如所述 ²².
   1. 将幼苗移栽至装有24个圆形孔穴（直径55 mm，深度64 mm）的聚苯乙烯育苗盘中，孔穴内填充按体积比60%粉壤土、30%沙和10%泥炭混合的基质。
   2. 将托盘置于盛有水的12 cm深塑料容器中，并用带螺纹的不锈钢杆固定，以防其漂浮（图1).
   3. 保持容器中的水位低于土壤表面1-2 cm，并向每个容器（含10-12 L水）中加入1.5 g硫酸铜，以防止藻类增殖。

5. 除草剂处理

1. 萌前除草剂处理：
   1. 在第3节所述的萌发箱中培养约三天后，将正在萌发的种子移栽至装有上述基质的塑料育苗盘中，并覆盖一层土壤（约1 cm）。此步骤至关重要，可确保幼苗的萌发是由于除草剂效应所致，而非因覆土过深所引起。
   2. 将底部带有少量孔洞的托盘置于盛有水的培养皿上，使基质达到田间持水量。
   3. 移植后一天，用萌前除草剂处理育苗盘 ²⁵.
   4. 通过从上方浇水以及从托盘通过毛细作用从下方补水，使基质保持在或接近田间持水量。该操作有利于除草剂在适当深度的持久存留即， 其中为萌发的种子）以确保良好的处理效果。
2. 苗后除草剂处理：
   1. 当植株长至2-3片真叶阶段时进行喷雾处理（即， 扩展BBCH生长发育阶段的第12-13期 ²⁶).
   2. 从处理后的第二天开始，根据杂草种类和季节的需水量设置灌溉系统（例如， 用于 Echinochloa spp. 每日定时供水4次，每次3分钟，时间间隔均匀，从上午9点至晚上9点）。供水通过自动喷灌系统进行。
      变异型：在植物生长阶段BBCH 14–21施用草甘膦。
3. 除草剂的配制与分配
   注意：所有除草剂（播前和播后）均以商品制剂形式施用，并添加推荐的表面活性剂，施用剂量分为两种：推荐田间剂量（1x）和该剂量的三倍（3x）。
   1. 如有需要，根据标签说明批量配制表面活性剂溶液；终浓度通常表示为终体积的百分比（例如， 0.3%）或按单位面积分配的体积（例如， 1 L ha^-1).
   2. 使用表面活性剂溶液作为除草剂（溶质）溶液的溶剂，以维持有效成分的正确浓度。首先配制最高浓度的除草剂溶液（3倍浓度）。根据以下公式计算需溶解于表面活性剂溶液（或去离子水，若无需表面活性剂）中的商品化产品用量：
      剂量_草本植物 = [(剂量_领域 x 剂量_最大值) x V_结束] / V_删除
      剂量_草本植物 = 除草剂剂量（ml），Dose_领域 = 除草剂田间剂量（ml ha⁻¹）^-1），剂量_最大 = 最大递送剂量，V_fin = 溶液的最终体积（L），V_删除 = 台式喷雾器施用体积（L/ha）^-1).
   3. 将除草剂溶液按2:1（v/v）稀释3倍，以制备较低浓度的溶液（1x）。该步骤可减少称量或移液过程中出现错误的可能性。除草剂溶液浓度以单位面积施用体积表示（L/ha）^-1).
   4. 从较低剂量的除草剂（1x）开始处理序列。这样在使用同一种除草剂进行两次处理之间，无需清洗喷雾柜。
   5. 使用精密台式喷雾器将除草剂溶液均匀喷洒，喷洒量为 300 L ha^-1 （±1%），在215 kPa的压力下，以0.75 m/s的速度^-1，配备有三个扁平扇形（扩展范围）液压喷嘴的喷杆。
   6. 更换除草剂时，使用1% (v/v) 次氯酸钠溶液对喷雾柜清洗两次，随后冲洗。
      变体：草甘膦以200 L ha的喷洒量施用^{-1 27}.
      注意：使用生物活性极强的除草剂（如磺酰脲类除草剂磺甲嘧磺隆或氟唑磺隆）时需格外小心。在此情况下，先用次氯酸钠溶液清洗一次，再用氨水（2.5% v/v）清洗一次，随后用清水彻底冲洗。

6. 数据的收集与分析

1. 通过条形码阅读器自动识别每个托盘，记录经处理后存活的植株数量以及目测估计生物量（VEB）。若植株无任何活跃生长迹象，则无论其颜色或其他外观如何，均判定为死亡。
   1. 根据所测试的除草剂，在处理后三到四周进行评估（WAT）例如， 三种用于ACCase抑制剂的WAT，以及四种用于ALS抑制剂或草甘膦的WAT。
   2. 通过在所有实验中纳入敏感群体（检测S）来评估总体治疗效果， 即， 一个从未或极少使用除草剂处理的地点采集的种群。
   3. 以除草剂处理前的处理植株数量为基准，计算植株存活率（百分比），并计算每个平均值（两个重复的平均值）的标准误（S.E.）。
   4. 通过目视比较同一群体中经处理与未经处理的对照植株生物量，获得VEB值 ^{25, 28}对每个处理过的培养皿进行评分，评分为10表示植株未受除草剂影响（与未处理对照相比），评分为0表示植株明显死亡。
2. 根据两种除草剂剂量处理结果，将种群划分为四类：当1x除草剂剂量下存活植株比例低于5%时，归为S类；当1x除草剂剂量下存活植株比例为5%至20%时，归为SR类；当1x除草剂剂量下存活植株比例超过20%时，归为R类；当1x除草剂剂量下存活植株比例超过20%，且3x除草剂剂量下存活植株比例超过10%时，归为RR类。 ¹⁷.

结果

为了评估假定抗性种群的抗性水平，实验中必须包含一个敏感性对照，以验证除草剂的有效性。以下为一项筛选试验的结果，该试验在 P. rhoeas 种群，一种侵扰小麦田的杂草，在 图2，其中展示了四种苗后除草剂对敏感对照种群（09-36）和疑似抗性种群（10-91）的防除效果。种群09-36可被ALS抑制剂碘磺隆完全控制，而在另两种测试的ALS类除草剂氟唑磺隆和甲磺隆的1倍剂量处理下，仅各有一株植株存活。图2）。相反，种群10-91中约有60%的植株在碘磺隆和甲基二磺隆两种除草剂剂量处理下仍能存活，约50%的植株在1倍剂量的氟唑磺隆处理下存活。这些结果证实，种群10-91对碘磺隆和甲基二磺隆具有高度抗性（RR），对氟唑磺隆具有抗性（R）。而对于具有不同作用机制（SoA）的2,4-D除草剂，则观察到不同的反应。即， 它模拟内源性生长素），广泛用于控制小麦中的双子叶杂草。在1倍剂量下，S对照植株中仅有33%被该除草剂杀死，VEB值为 > 20% (图2）。对照群体缺乏药效并不能确认10-91群体是否对该除草...

讨论

在对种群进行除草剂抗性评估时，实验方案中的多个步骤至关重要：1）应从经除草剂处理后仍存活的植株上采集成熟种子。种子在母株上充分成熟，对于避免后续种子萌发困难尤为关键；2）建议妥善保存种子，以防止霉菌滋生而影响萌发；3）应按照除草剂产品标签上注明的适宜时期，在正确的幼苗生长阶段进行处理。需注意确保待处理植株的生长阶段基本一致；4）配制和使用除草剂溶液时应精确操作，确保喷洒到植株上的活性成分浓度准确，从而避免无法验证的实验误差；5）每次除草剂处理后，建议彻底清洗喷雾柜及用于配制溶液的玻璃器皿，以防止后续处理过程中发生交叉污染，尤其是在使用生物活性较高的除草剂时更应格外注意。

本文所述方案可轻松适用于多种杂草物种，只需根据具体研究的物种和除草剂进行必要的调整。特别是打破种子休眠及种子萌发的方法，针对每一种新的杂草物种均需重新评估（参见第2和第3节）。当使用不同除草剂时，喷洒设备有时也需要进行调整。 例如， 草甘膦需要设置不同的喷雾柜参数（参见第5.3节），且施药时植物的生长阶段通常晚于大多数其他除草剂的处理时期。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纸袋	Celcar SAS
塑料培养皿	ISI plast S.p.A.	SO600	透明塑料
硫酸 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
无纺布	Carretta Tessitura	Art.TNT17	克重 17 g m-2
氯仿 >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296
硝酸钾 >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
塑料容器	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
塑料托盘	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
聚苯乙烯托盘	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm，24 个圆形孔（6x4）
硫酸铜	Sigma-Aldrich	451657
农用珍珠岩	Blu Agroingross sas	AGRI100
泥炭	Blu Agroingross sas	TORBA250
种子发芽箱	KW	W87R
喷嘴	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	第二种喷嘴仅用于草甘膦
条形码生成器	Toshiba TEC	SX4
带条形码的标签	Felga	TT20200	圆角贴纸标签
条形码阅读器	Cipherlab	8300-L	便携式数据终端
台式喷雾器			自制
结果中包含的除草剂：
商品名	有效成分	公司	备注
Altorex	咪唑乙烟酸	BASF
Azimut	氟唑磺隆	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	需与 Hussar WG 配合使用的表面活性剂
Dash		BASF	需与 Altorex 配合使用的表面活性剂
Granstar	甲磺隆	Dupont
Gulliver	双氟磺草胺	Dupont
Hussar WG	碘磺隆	Bayer Crop Science
Nominee	双嘧达克钠	Bayer Crop Science
Roundup	草甘膦	Monsanto
Trend		Dupont	需与 Granstar 和 Gulliver 配合使用的表面活性剂
Viper	五氟磺草胺	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-二氯苯氧乙酸	Isagro