我们报告一种 体外 一种可定量内皮细胞单层中实际黏附细胞数量的方法。
本文内容
摘要
摘要
炎症的核心过程之一是免疫细胞从血管腔内渗入周围组织。当血管内皮细胞对循环中的免疫细胞（如单核细胞）产生黏附性时，这一过程便会发生。体外对这种黏附性的测定迄今通常通过直接计数或间接测量黏附单核细胞的荧光强度，来量化黏附到内皮细胞层上的单核细胞总数。尽管这类测量能够反映内皮细胞群体的平均黏附能力，但其结果会受到多种因素（如细胞数量）的干扰，且无法揭示实际具有黏附性的内皮细胞所占的比例。本文中，我们描述并演示了一种方法，可对经测试的内皮单层细胞群体中具有黏附性的细胞进行计数。内皮细胞培养于玻璃盖玻片上，经特定处理后与单核细胞（可带有荧光标记）共孵育。孵育结束后，通过多次浸入和排液的洗涤步骤，固定细胞。那些被单核细胞包围的黏附性内皮细胞可被清晰识别并计数，从而获得黏附指数，该指数反映了内皮细胞群体中实际具有黏附性的细胞所占的真实比例。
引言
单核细胞等免疫细胞穿过血管内皮细胞层是炎症过程中的关键步骤1。这一过程使得免疫细胞（免疫细胞）能够迁移至损伤部位。在其他情况下，例如在冠状动脉和颈动脉中，单核细胞穿过内皮层可能导致这些细胞在动脉壁内长期滞留，进而可能促进斑块的形成2。在所有免疫细胞浸润的情况下，第一步均涉及血管局部区域的内皮细胞被激活。内皮细胞受到TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子的刺激，上调表达VCAM、ICAM和E-选择素等细胞表面蛋白，从而促进免疫细胞的募集及其在内皮细胞表面的黏附3-6。
最初，通过计数黏附于内皮单层细胞上的单核细胞来测定内皮细胞的黏附能力。 7该方法在精确性方面的局限性促使研究人员采用放射性标记的淋巴细胞或单核细胞，随后通过量化与淋巴细胞或单核细胞黏附相对应的放射性物质来进行检测。 4该方法最终被一种基于荧光的方法所取代，即用荧光染料标记目标免疫细胞，并采用与上述相同的步骤进行处理，不同之处在于检测荧光信号而非放射性。 8目前，该方法已成为最便捷的检测手段，并由多家商业供应商以试剂盒形式销售。尽管该检测能够测量对照样本与实验样本之间黏附性的相对水平，但它无法揭示荧光变化是源于整个内皮细胞群体黏附性的均一改变，还是源于细胞亚群之间黏附性差异所致。此外，清洗步骤的严格程度对结果具有显著影响；更重要的是，不同内皮细胞单层之间未结合单核细胞冲洗程度的一致性，将极大影响重复样本间结果的接近程度以及样本间结果的可重复性。近年来，已有若干研究采用在内皮细胞单层上通过培养基泵送单核细胞的系统，以解决这一问题。 9此外，这些流动系统还能重现剪切力对内皮细胞的影响。尽管此类系统的优点显而易见且极具吸引力，但也必须认识到，虽然某些因素（如TNFα）可显著增强内皮细胞的黏附性——正如在急性炎症中所见——但其他一些激活因子，如电离辐射，10 引发的变化不易被轻易检测到 体外 这些极为严格的系统所设定的实验时间范围。尽管内皮细胞黏附性的此类微小变化很容易被忽略或忽视 体外，它并不一定是良性的 体内，这种在生命周期内微小但持续的变化是慢性炎症的特征，却可产生显著的生物学效应。因此，迫切需要一种可靠、灵敏且特异的方法来检测和测量内皮细胞的黏附性。
本文报道了一种直接测量内皮细胞黏附性的方法。该方法不依赖荧光测量作为内皮细胞黏附性的间接替代指标。该方法能够揭示黏附性的变化是源于所有细胞的均一性改变，还是局限于某一亚群细胞。此外，该方法允许对内皮细胞进行共染色，例如与衰老相关β-半乳糖苷酶、细胞活力标记物Calcein AM，以及针对细胞表面和细胞内蛋白的抗体等标记物联合使用，从而可将单个黏附性内皮细胞与特定的细胞状态或特定蛋白的表达相关联。
方案
1. 玻璃盖玻片的准备
- 将直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片浸入70%乙醇中至少10分钟，期间偶尔轻轻振荡，以确保所有盖玻片均完全接触乙醇，从而实现灭菌。将盖玻片与乙醇一同倒入无菌细胞培养皿中（直径可为6 cm或10 cm）。
- 使用无菌精细5B镊子逐个夹取玻璃盖玻片，并将其放入24孔板的各个孔中。注意确保盖玻片不接触孔壁，并大致位于孔的中央位置。
- 将未加盖的含玻璃盖玻片的24孔板置于超净工作台中晾干，约需10分钟。
- 在此期间，通过将10 mg/ml人纤维连接蛋白用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）稀释至0.1 mg/ml，配制包被液。
- 盖玻片完全干燥后，用移液器将100 µl包被液滴加至每片玻璃盖玻片上，使液体仅覆盖玻璃表面，避免在孔外缘积聚。将已加液的24孔板放入细胞培养箱中孵育至少1小时。
- 使用前，移除包被液。同一份包被液可转移至无菌离心管中，最多重复使用三次，且无明显活性损失。
2. 内皮细胞单层的制备
- 在 37 °C 和 5% 二氧化碳条件下，用培养基培养人冠状动脉内皮细胞（EC）。
- 吸除培养基，用 10 ml HBSS 冲洗 EC 单层细胞。
- 吸除 HBSS，加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶和 0.2% EDTA 溶液。在室温下孵育约 5 分钟。
- 当轻敲培养瓶侧面可使 EC 脱落时，加入 5 ml 大豆胰蛋白酶抑制剂，并用移液器冲洗培养瓶表面，以进一步解离细胞。
- 将细胞转移至 15 ml 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将 EC 沉淀重悬于 5 ml 培养基中。用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至每毫升 EC 培养基含 50,000 个 EC。
- 将 1 ml 细胞悬液加入含有包被玻璃盖玻片的 24 孔板的每一孔中。在 37 °C 和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中过夜孵育。
- 当形成融合单层细胞时，细胞可在 3 天内用于实验。
3. 单核细胞的制备
- 将悬浮培养于添加了10%胎牛血清的RPMI培养基中的HL-60细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，用5 ml培养基重悬细胞，并用培养基将细胞浓度调整至200万个细胞/ml。如需对HL-60细胞进行荧光标记，则将细胞重悬于不含血清的RPMI培养基中，并按第4节所述步骤操作。
- 向含有内皮细胞单层的24孔板每孔加入0.5 ml HL-60细胞悬液，将培养板置于37 °C、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育1至3小时之间的固定时间。在1小时和3小时时间点之间观察到的差异较小，此时结合已达到饱和。
- 准备细胞洗涤/收获：取120 ml离心管加入100 ml HBSS。向一个新的24孔板的每孔中加入1 ml甲醛溶液。
- 孵育结束后，使用一对尖头镊子从孔中取出玻璃盖玻片，垂直持握，并将盖玻片边缘在实验台上的纸巾上轻蘸3秒，注意不要让纸巾接触盖玻片上有细胞的一面。
- 用镊子牢固夹住盖玻片，在HBSS中浸入和提出5次。
- 在第5次浸入HBSS后，将盖玻片边缘在纸巾上轻蘸3秒。
- 重复步骤3.6和3.7中所述的浸洗和轻蘸操作，共完成三组，每组5次浸洗后接一次轻蘸。
- 将盖玻片转移至含有10%甲醛的孔中，在室温下固定细胞。盖玻片即可用于细胞计数，或长期保存，或进行下文所述的其他操作。
4. 使用 Cell Tracker 标记 HL-60 细胞（可选）
- 计数并转移适量的 HL-60 细胞（例如，将1000万个细胞加入15 ml离心管中。以200 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 在无血清的RPMI培养基中重悬细胞沉淀，细胞浓度为100万细胞/ml，并加入Cell Tracker。将细胞置于细胞培养箱中孵育1小时。
- 以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至 200 万细胞/毫升。
- 将0.5 ml Cell Tracker标记的HL-60加入每个含有生长于玻璃盖玻片上的内皮细胞的孔中。继续进行步骤3.3。
5. 黏附性内皮细胞的计数
- 使用DAPI复染剂将盖玻片固定在显微镜载玻片上，以识别单个细胞。
- 利用倒置显微镜配备4X或10X物镜，获取多个视野（例如， 5个视野）的图像，并计数在未受照射的内皮细胞上聚集的单核细胞的最大数量（通常应为3-5个）。
- 将上述计数结果的两倍设为定义单个内皮细胞上单核细胞簇的阈值。根据实验的具体情况，必要时可采用其他标准来定义细胞簇。
- 计数视野中细胞簇的数量以及内皮细胞的数量，将前者除以后者得到黏附性内皮细胞的百分比。对多个视野进行计数，以获得计数结果的平均值和标准差。
6. 使用抗体进行复染
- 在黏附实验后，将盖玻片上的细胞在室温下用10%福尔马林固定15分钟，随后按照标准流程10并选用适当的抗体对盖玻片进行免疫荧光染色。
- 添加和移除各种溶液时应极其轻柔，以避免使黏附在内皮细胞上的单核细胞脱落。
7. 衰老相关β-半乳糖苷酶活性的复染
- 在黏附实验后，将盖玻片上的细胞用甲醛固定15分钟，然后按照染色试剂盒附带的说明书所述方法进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性染色。添加和移除各种溶液时应非常轻柔，以避免使黏附在内皮细胞上的单核细胞脱落。
结果
该方法可用于在细胞群体中检测单个黏附性内皮细胞。例如，未受照射的内皮细胞单层在孵育并洗涤后仅保留少量散在的HL-60单核细胞，而在与单核细胞孵育前接受10 Gy照射7天的内皮细胞单层，则在单个内皮细胞周围形成单核细胞簇状结合（图1）。尽管该现象在相差显微镜下易于观察，但荧光显微镜可提供更为清晰的单核细胞簇图像。
在完成所述黏附实验后，可使用相应的抗体，通过标准免疫荧光方法对细胞膜、细胞质或细胞核（图2）蛋白进行染色。此外，也可进行基于酶的检测，如衰老相关β-半乳糖苷酶检测（图3）。
由于每个单核细胞簇对应一个内皮细胞，因此对细胞簇进行计数即可确定单层内具有黏附性的内皮细胞的实际数量（图4），进而计算出群体中黏附性内皮细胞所占的百分比（表1，图6）。这是迄今为止唯一能够实现内皮细胞黏附性定量分析的方法。值得注意的是，本实验所用的内皮细胞已达到接触抑制状态，在形成融合单层后数量不再增加，从而避免了在后续时间点因内皮细胞数量增加而带来的潜在复杂性。如有需要，可使用0.5%胰蛋白酶-0.2% EDTA溶液处理（替代步骤3.9中的固定操作）将黏附于内皮单层上的单核细胞解离，并利用酶标仪检测其荧光强度，该方法与当前常用技术一致（图5）。
图1. 单核细胞在内皮细胞单层上的黏附。 在未受辐射的内皮细胞上，单核细胞以单个细胞形式零星且随机地黏附（左图）；而在接受10 Gy辐射后第7天的内皮细胞单层上，单核细胞则以簇状形式聚集在个别内皮细胞上（右图）。下方图像是上方图像的荧光图像，证实了相差显微镜下可见的小而明亮的球形细胞确实是经Cell-Tracker Green预先标记的单核细胞。部分单核细胞簇由白色箭头指示。图像使用10倍物镜拍摄。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 黏附实验后内皮细胞的蛋白染色 在完成所述黏附实验后，将玻璃盖玻片上的细胞进行免疫荧光染色，以检测（A) 膜蛋白（CD44）、b) 胞质蛋白（Tubulin）或 c) 核蛋白（γ-H2AX）。左侧面板为（A）和（B)（使用20倍物镜观察）显示用Cell Tracker Green预标记的单核细胞，右侧对应图像显示CD44和微管（红色）以及DAPI染色的细胞核（蓝色）。白色箭头指向（C）指向经照射后用抗γ-H2AX抗体染色的内皮细胞核。单核细胞核经DAPI染色后呈较亮的蓝色，可与内皮细胞的椭圆形细胞核清晰区分。图像使用20倍物镜拍摄。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3. 内皮细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶染色。 黏附实验后，将盖玻片上的细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色，该染色可使衰老细胞的溶酶体呈现蓝色。图中可见一个与大量单核细胞特异性结合的内皮细胞呈现蓝色，单核细胞因其体积小且呈球形而易于识别。图像使用20X物镜观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 单个内皮细胞上单核细胞簇的计数。 黏附实验后，从多个不同位置拍摄细胞图像，并识别单核细胞簇（以绿色圈出）。单核细胞簇定义为黏附在单个内皮细胞上的10个或更多单核细胞的聚集。统计图像中单核细胞簇的数量以及照射后12天的内皮细胞数量（以红色虚线标出），并按表1所示方法计算黏附内皮细胞的百分比。图像使用10倍物镜拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 黏附单核细胞荧光强度的定量分析。黏附实验完成后，用胰蛋白酶消化玻璃盖玻片上的细胞，并使用荧光酶标仪检测预先用CellTracker Green标记的单核细胞的荧光强度，作为内皮单层细胞黏附能力的间接指标。根据照射后指定时间点的检测结果，将数据绘制成上方所示图表。
图6. 表1中黏附实验评分的图示。 在三片玻璃盖玻片的五个不同位置对黏附性内皮细胞进行评分，评分方法如图4所述，上述结果汇总显示，在10 Gy照射后12天，8%至10%的照射内皮细胞变为黏附性。
| 黏附内皮细胞百分比 | |||
| 圆盘1 | 圆盘2 | 圆盘3 | |
| 视野1 | 8.65 | 8.29 | 8.21 |
| 视野2 | 10.44 | 7.27 | 7.21 |
| 视野3 | 9.63 | 9.05 | 8.33 |
| 视野4 | 11.11 | 7.09 | 8.41 |
| 视野5 | 10.55 | 9.4 | 11.61 |
| 平均值 | 10.07 | 8.22 | 8.75 |
表1. 黏附实验评分。在三片玻璃盖玻片的五个不同位置上的黏附性内皮细胞，按照图4所述方法进行评分，上述结果汇总显示，在10 Gy辐射照射后12天，8%至10%的照射内皮细胞表现出黏附性。
讨论
上述单核细胞黏附实验已成功应用于研究电离辐射对内皮单层细胞生物学效应的实验中10。尽管评估内皮单层细胞黏附能力的方法并非仅有此一种，但这是唯一能够量化单层内皮细胞中具有黏附能力的细胞比例或百分比的方法。这一点至关重要，因为通过其他方法测得的单核细胞整体黏附性定量变化，可能源于单层内皮细胞中所有细胞的普遍黏附性升高，也可能仅源于单层内皮细胞中某一亚群细胞的黏附性增强，如上文示例所示。能够获得此类信息的重要性体现在：通过量化经辐射后表现出增强黏附性的内皮细胞百分比，不可避免地得出结论——该效应并非由特定基因的遗传突变所致，因为具有黏附性的细胞比例远高于（超过1,000倍）在该剂量X射线辐射下由基因随机突变所预期的比例。
确保结果具有良好可重复性的关键因素是洗涤程序。由于该洗涤过程涉及将玻璃盖玻片浸入洗涤缓冲液中，随后在纸巾上轻拍，从而避免了传统移液方式将洗涤缓冲液加入孔中时不可避免产生的缓冲液湍流所导致的变异。事实上，正是在观察到采用移液方法获得的重复样本之间存在过大变异后，我们才决定设计一种能够消除洗涤步骤中变异因素的洗涤流程。
诚然，该实验方法的局限性在于需要手动计数单核细胞簇，因而难以适用于高通量分析。其次，关于多少个单核细胞构成一个细胞簇的判定标准需半主观地确定，若设定阈值过高，可能导致部分真实存在的细胞簇被排除。此外，该方法缺乏剪切力，在内皮细胞黏附性显著增强的实验条件下，这一特点也可被视为其局限性之一。例如， +TNFα)。然而，在其他情况下，缺乏剪切力则是一种优势，因为它能够检测到较为温和的黏附性增强。单核细胞黏附性的轻度增加可能尤为关键且具有实际意义。 体内，单核细胞在典型的实验时间内不太可能大量黏附于黏附性仅有轻度增加的内皮细胞，这主要是由于剪切力的作用。然而随着时间推移，部分单核细胞最终可能发生黏附，这种情况更可能代表慢性炎症的环境。因此，去除剪切力具有一定优势，因为它能够在典型的较短实验时间范围内揭示内皮细胞黏附性的轻微增强，而这种轻微增强在剪切应力条件下可能因时间过于短暂而难以被观察到。
在本实验之后，可对细胞进行其他分析，如衰老实验和免疫荧光染色，从而提高了该方法的实用性，因为它能够将特定内皮细胞的黏附性与特定细胞蛋白或细胞状态相关联，如上文所示，而这一优势是传统的黏附实验所不具备的。
该方法已用于est2永生化的人冠状动脉内皮细胞，且在原代人冠状动脉内皮细胞中也获得了类似结果10，表明该方法并非仅适用于特定细胞系。此外，采用本方法检测内皮细胞黏附性，并不妨碍对同一批细胞进行标准黏附实验，即通过检测标记免疫细胞的荧光强度来评估黏附能力。综上，本研究报告表明，该方法具有广泛的适用性，可兼容多种实验条件，并能提供比标准黏附实验更丰富的信息。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
我们非常感谢 Simon Bouffler 的全力支持，以及英国公共卫生局在基础设施方面提供的支持。本研究由英国公共卫生局通过国家健康研究所（NIHR）资助项目提供经费支持。本报告系由 NIHR 委托开展的研究工作。本出版物中表达的观点仅为作者观点，不一定代表英国国家医疗服务体系（NHS）、NIHR 或卫生部的观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿撰写过程中均未发挥任何作用。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEPES 缓冲盐溶液（HBSS） | Sigma | H6648 | |
| 圆形玻璃盖玻片，直径 12 mm | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
| 24 孔细胞培养板 | Costar | 3526 | |
| Meso-Endo 细胞培养基 | Cell Applications | 212-500 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4174 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Life Technologies | 17075-029 | |
| Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
| RPMI 培养基 | Sigma | R8758 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10500064 | |
| β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | CellSignaling | 9860 | |
| 纤连蛋白 | Sigma | F0895 |
参考文献
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重印与许可
