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方法文章

在大孔聚合物整体柱上制备高孔隙配位聚合物涂层以增强磷酸化肽的富集

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DOI：

10.3791/52926

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2015年7月14日

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1The Molecular Foundry, E. O. Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Institute of Chemical Sciences, Bahauddin Zakariya University, 3Department of Chemistry, University of the Balearic Islands, 4Beijing Key Lab of Bioprocess, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology

本文内容

摘要

介绍了一种制备多孔杂化分离介质的方法，该介质由大孔聚合物整体柱构成，其内部涂覆有高比表面积的微孔配位聚合物。

摘要

我们描述了一种在大孔聚合物整体材料内表面制备基于高度多孔配位聚合物涂层的杂化材料的方案。该方法基于制备含有羧酸官能团的大孔聚合物，并在此基础上通过溶液法逐步可控地在聚合物整体材料的孔表面生长一层多孔配位聚合物。所制备的金属-有机聚合物杂化材料具有较高的微孔比表面积。通过在功能聚合物载体的孔表面进行金属-有机配位，可增强三价铁位点的数量。金属位点的增加与涂层过程的循环次数相关。

所开发的制备方案可轻松适配于毛细管柱形式。功能化多孔聚合物在毛细管内被制备为一个独立的单块式多孔整体柱，从而形成一种具有优异流动通透性和适中反压的流通式分离装置。该金属-有机聚合物杂化柱在从消化后的蛋白质中富集磷酸化肽段，并继而通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行检测方面表现出优异性能。本研究所提供的实验方案具有高度的通用性，可轻松应用于多种有机聚合物载体和涂层，并可与大量多孔配位聚合物及金属-有机框架材料结合，用于多种纯化和/或分离应用。

引言

多孔配位聚合物（PCPs）是一类基于金属中心与有机配体通过重复的配位单元连接而成的配位化合物，其结构可在一维、二维或三维方向上延伸，且可以是无定形或结晶态1-3。近年来，这类多孔材料因其高孔隙率、广泛的化学可调性以及良好的稳定性而受到广泛关注。PCPs已被探索用于气体储存、气体分离和催化等多种应用3-6，而最近，PCPs的首批分析应用也已被报道7。

由于具有增强的化学功能性和高孔隙率，多孔配位聚合物（PCPs）在提升纯化工艺和色谱分离方面的巨大潜力已受到广泛关注，关于这一主题的多项研究已有报道7-13。然而，目前PCPs的性能尚无法与现有的色谱材料相媲美，这可能是由于这些固体材料的颗粒或晶体通常具有不规则的形貌，导致在填充柱中颗粒间存在较大的空隙，从而引起快速扩散。这种不均匀的填充状态会导致分离性能低于预期，并产生较高的柱背压以及不理想的峰形特征14,15。

为了解决分析应用中多孔配位聚合物（PCPs）因颗粒间孔隙导致的快速扩散问题，同时提升其性能，开发一种基于大孔聚合物整体柱16的杂化材料将具有重要意义，该材料可使PCP分布在大孔表面。聚合物整体柱是一种自支撑的单块材料，其孔道允许对流流动，因而成为颗粒填充材料最高效的替代方案之一，并已被多家公司成功实现商业化17,18。 多孔聚合物整体柱通常通过单体与交联剂在致孔剂存在下聚合制备，致孔剂一般为有机溶剂的二元混合物。所得整体材料具有微球状结构，兼具高孔隙率和高流动渗透性。

一种将这些材料统一并制备含有多孔配位聚合物（PCP）的整体柱的简单方法，是将合成后的PCP直接加入整体柱的聚合混合物中。然而，该方法导致PCP大多被包埋在聚合物支架内部，无法在最终材料的后续应用中发挥活性14,15。显然需要采用不同的合成策略，例如，以制备均匀的PCP薄膜或结晶型金属有机框架（MOFs），使得晶体内部大多数孔道能够与整体柱的宏观孔隙相通。

本文报道了一种基于大孔聚合物载体的金属-有机聚合物杂化材料（MOPH）的简单制备方案，该载体具有适合固定多孔配位聚合物（PCPs）的官能团，可方便地以整体式单片聚合物柱的形式用于流通型应用，并具备理想的性能。在完成聚合物合成后，采用一种简单的室温溶液法 在整体柱孔道内表面生长PCP涂层19-20。作为首个示例，我们描述了在大孔聚（苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸）整体柱内制备铁(III)苯三甲酸盐（FeBTC）配位聚合物薄膜的方法。该方法不仅适用于体相粉末材料的制备，也可用于毛细管柱的构建，且所述方案可便捷地推广至其他PCPs的制备。为展示MOPH作为流通型功能材料的应用潜力，我们将所制备的含有高密度Fe(III)中心的FeBTC MOPH用于从酶解蛋白质混合物中富集磷酸化肽段，利用磷酸化肽段与Fe(III)之间的特异性结合亲和力实现分离富集。本研究建立的方案21主要包括三个部分：大孔有机聚合物整体柱载体的制备；在整体柱孔道表面生长PCP涂层；应用于磷酸化肽段的富集。

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方案

注意：实验开始前，请查阅所有相关材料的安全数据表（MSDS）。合成与应用步骤中使用的多种化学品具有毒性。请遵循所有适当的安全操作规程，并使用充足的个人防护装备（实验服、长裤、封闭式鞋头的鞋子、护目镜、手套）。在进行氮气吸附测量操作液氮时，请务必使用所有必要的低温个人防护装备（隔热手套、面罩）。

1. 整体式多孔聚合物柱在块状材料和毛细管柱中的制备

  1. 用于表征的整体聚合物整体材料
    1. 通过碱性氧化铝柱纯化苯乙烯、二乙烯基苯和甲基丙烯酸，以去除聚合抑制剂。将10 g碱性氧化铝装入一支25 ml的一次性塑料注射器中，并在注射器尖端填充玻璃棉作为塞子。使约10 ml单体溶液通过该柱体进行过滤。
    2. 将单体（50 mg苯乙烯、100 mg二乙烯基苯和50 mg甲基丙烯酸）以及致孔剂（300 mg甲苯和300 mg异辛烷）加入一个1 ml玻璃小瓶中。加入聚合引发剂，即4 mg的2,2’-偶氮二异丁腈（AIBN，占单体总质量的1%）。
    3. 超声处理10分钟以实现均质化。通入氮气鼓泡10分钟以除去溶解氧。用石蜡膜密封瓶盖，并将小瓶置于60 °C水浴中反应6小时，使混合物完成聚合。
    4. 冷却至室温后小心敲碎玻璃瓶。将聚合物整体材料转移至纤维素提取套管中。将提取套管放入索氏提取装置的提取室中，并连接至含有甲醇的圆底烧瓶，甲醇体积至少为提取室体积的三倍。在提取室上端连接冷凝管。加热回流甲醇16小时，确保完全去除未反应的单体和致孔剂。
    5. 在60 °C真空烘箱中干燥过夜。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认羧基官能团的存在，以便后续连接PCP。采用氮气吸附孔径分析法测定比表面积。
  2. 用于制备整体柱的硅胶毛细管功能化
    1. 截取一段2 m长、内径为100 µm、外涂聚酰亚胺的熔融石英毛细管。将其连接至0.25–0.50 ml玻璃注射器，并用丙酮冲洗毛细管。随后用水冲洗以去除残留丙酮。
    2. 为活化毛细管内壁的二氧化硅表面，使用注射泵以0.25 µl/min流速泵入0.2 M的水相NaOH溶液，持续30分钟。再用水冲洗至流出液呈中性。
    3. 使用pH试纸检测流出液pH值。为使硅醇基质子化，以0.25 µl/min流速泵入0.2 M的水相HCl溶液，持续30分钟。用水冲洗至流出液呈中性，再用乙醇冲洗一次。
    4. 以0.25 µl/min流速泵入20%（w/w）的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯乙醇溶液（用乙酸调节pH至5），持续1小时。此步骤使硅胶毛细管内表面引入乙烯基官能团，以便后续将聚合物整体材料键合至毛细管内壁。
    5. 用丙酮冲洗，氮气流干燥，并在室温下静置过夜后备用。将毛细管切割成每段20 cm的短管。
  3. 整体式毛细管柱的制备
    1. 在带有橡胶隔垫的1 ml玻璃小瓶中，配制与整体聚合物材料相同组成的聚合混合液（参见第1.1节）。按单体总质量的1%加入AIBN作为引发剂。超声处理10分钟以实现均质化。
    2. 通过连接一段未功能化的石英毛细管至氮气源，对聚合混合液进行氮气除氧。
      1. 将通氮气的毛细管穿过小瓶的橡胶隔垫并浸入聚合混合液中，使氮气在液体中鼓泡。瓶盖应略微松开，以防压力过高。持续通氮10分钟。
      2. 将通氮毛细管从聚合混合液中提起至小瓶顶部气相空间，并拧紧瓶盖。再将一段已功能化的毛细管穿过隔垫插入聚合混合液中。由于氮气进入顶部空间产生压力，推动聚合混合液进入功能化毛细管中。
      3. 从毛细管出口收集数滴液体，确认毛细管已完全填充后，用橡胶隔垫封住出口。极其小心地将毛细管从小瓶中取出，并用橡胶隔垫封闭其入口端。
    3. 将装有混合液的毛细管置于60 °C水浴中聚合6小时。冷却至室温后，切去毛细管两端各数毫米。使用HPLC泵以3 µl/min流速用乙腈冲洗色谱柱30分钟，以去除未反应的单体和致孔剂。检测毛细管柱的背压。

2. 铁-苯三甲酸盐（FeBTC）多孔配位聚合物的生长

  1. 用于表征的块体聚合物整体柱上 FeBTC MOPH 的生长
    1. 使用研钵和研杵研磨先前干燥的整体柱。
    2. 将 100 mg 整体柱粉末浸入 5 ml 含 2 mM FeCl3·6H2O 的乙醇溶液中，持续 15 分钟。使用尼龙滤膜（0.22 µm）进行真空抽滤，并用乙醇洗涤粉末。将整体柱粉末浸入 5 ml 含 2 mM 1,3,5-苯三甲酸（BTC）的乙醇溶液中，持续 15 分钟。使用尼龙滤膜（0.22 µm）进行真空抽滤，并用乙醇洗涤粉末。
    3. 根据需要重复第 2 步。最终金属有机涂层的生长程度由所进行的循环次数决定。通常进行 10 至 30 个循环。通过氮气吸附孔径分析法确认新孔隙的存在。通过热重分析（TGA）测定新增金属位点的数量。
  2. 毛细管整体柱上 FeBTC MOPH 的生长用于磷酸化肽的富集
    1. 使用注射泵。以 2 µl/min 的流速用含 2 mM FeCl3·6H2O 的乙醇溶液冲洗毛细管整体柱 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用乙醇洗涤 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用含 2 mM BTC 的乙醇溶液冲洗毛细管整体柱 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用乙醇洗涤 15 分钟。
    2. 根据需要重复第 1 步。最终金属有机涂层的生长程度由所进行的循环次数决定。

3. 蛋白质消化与磷酸化肽段的富集

  1. 蛋白质消化
    1. 将0.5 ml脱脂牛奶溶于1 ml水中，并分装为每份200 µl。
    2. 进行蛋白质消化时，向每份样品中加入160 µl 1 M碳酸氢铵和50 µl 45 mM二硫苏糖醇，以断裂二硫键。在50 °C下于恒温混匀仪中孵育15分钟。
    3. 待溶液冷却至室温后，缓慢加入50 µl 100 mM碘乙酰胺水溶液。碘乙酰胺可防止新的二硫键形成。
    4. 避光孵育15分钟，室温条件下进行。加入1 ml去离子水。加入2 µg胰蛋白酶，在37 °C下于恒温混匀仪中消化蛋白质14小时。
    5. 加入10 µl 1%三氟乙酸酸化以终止消化反应，并在室温下于恒温混匀仪中继续孵育5分钟。将消化后的蛋白质产物储存于–20 °C。
  2. 使用毛细管MOPH柱富集磷酸化肽段
    1. 以流速1 µl/min，用100 µl含0.1%三氟乙酸的乙腈-水4:1混合液冲洗柱子10分钟。随后以2 µl/min的流速将蛋白质消化液泵入柱中，持续30分钟。
    2. 再次以流速1 µl/min，用含0.1%三氟乙酸的乙腈-水4:1混合液冲洗10分钟，以去除未磷酸化的肽段。再以1 µl/min流速用水冲洗10分钟。
    3. 使用250 mM、pH 7的磷酸盐缓冲液以1 µl/min流速泵入15分钟，洗脱磷酸化肽段。收集洗脱液至样品瓶中，并依据标准方案19进行脱盐处理。配制2 mg/ml的2,5-二羟基苯甲酸溶液，作为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的基质。吸取2 µl 2,5-二羟基苯甲酸至移液枪尖端，用于洗脱磷酸化肽段，并直接点样至MALDI靶板上。
    4. 通过MALDI-TOF-MS分析样品点，随后用大量水冲洗柱子，再用甲醇冲洗，以再生柱子。

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结果

有机聚合物整体柱孔表面PCP生长的示意图如下所示 图1在此图中，我们展示了初始的 Fe(III) 原子通过与原始聚合物整体柱孔表面的羧基官能团配位而固定在孔道表面。根据本文所述方案，向表面进一步引入有机配体和 Fe(III) 离子，从而在聚合物整体柱内部构建出多孔配位网络。 图1 还示意性地展示了所制备的毛细管MOPH柱作为流通式载体用于富集磷酸化肽段的应用。对所制备材料采集了比表面积和孔径分布数据、扫描电子显微镜图像（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及热重分析（TGA）结果。图2）。这些表征实验为FeBTC PCP生长后新孔隙的形成情况提供了有价值的信息图2A）。经FeBTC PCP改性后材料的形貌如图所示 图2B根据晶体学模拟，每个MOF层的厚度估计为3和5 Å，具体取决于晶体的生长取向。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了所合成的聚合物整体柱及其经不同循环次数FeBTC修饰后的对应材料中存在官能团。图2C）。热重分析...

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讨论

原始的聚合物整体材料含有能够与金属结合的羧基官能团。通过在原始材料上配位初始金属位点，我们能够生长一层PCP涂层（图1A），引入大量额外的金属位点，形成微孔网络结构。这使得所报道的MOPH材料在涉及金属物种的富集或纯化过程中具有吸引力，例如固定化金属离子亲和色谱（IMAC）技术。使用毛细管柱富集磷酸化肽的一般操作流程如图1B所示。

块体粉末整体材料的制备使得能够对原始整体材料及其改性后的对应物进行表征。我们在77 K下测定了N2吸附等温线（图2A），结果显示，经过30次PCP循环后，低P/Po下的N2吸附量显著增加，表明材料中形成了新的微孔。原始整体材料的比表面积增加了近四倍，从106 m2/g增至389 m2/g。仅进行少量循环（10次PCP循环），材料的孔隙率即提升至比表面积156 m2/g。采用该详细方法制备多孔材料不仅限于基于Fe的PCP。将F...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作在劳伦斯伯克利国家实验室分子铸造厂完成，并得到美国能源部科学办公室基础能源科学局科学用户设施部门的支持，合同号为 DE-AC02–05CH11231。特此感谢美国教育部富布莱特奖学金对 F.M. 的资助，以及巴基斯坦高等教育委员会对 A.S. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚酰亚胺涂层毛细管Polymicro TechnologiesTSP100375100 μm 内径
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯，98%Sigma-Aldrich440159
苯乙烯，99%Sigma-AldrichW323306工业级
二乙烯基苯，80%Sigma-Aldrich414565
甲基丙烯酸，98%MallinckrodtMK150659
甲苯，≥99.5%EMD chemicalsMTX0735-6
异辛烷，≥99.5%Sigma-Aldrich650439
2,2'-偶氮二异丁腈，98%Sigma-Aldrich441090
氧化铝（碱性氧化铝）Sigma-Aldrich199443
三氯化铁六水合物，97%Sigma-Aldrich236489
1,3,5-苯三甲酸，95%Sigma-Aldrich482749
乙腈，≥99.5%Sigma-Aldrich360457
碳酸氢铵，≥99.5%Sigma-Aldrich9830
三氟乙酸，≥99%Sigma-Aldrich302031
乙醇，≥99.8%Sigma-Aldrich2854
碘乙酰胺，≥99%Sigma-AldrichI1149
二硫苏糖醇，≥99%Sigma-Aldrich43819
磷酸二氢钠二水合物，≥99%Sigma-Aldrich71505
磷酸氢二钠二水合物，≥99%Sigma-Aldrich71643
磷酸，≥85%Sigma-Aldrich438081
2,5-二羟基苯甲酸，≥99%Sigma-Aldrich85707
胰蛋白酶Sigma-AldrichT8003牛胰腺来源
β-酪蛋白Sigma-AldrichC6905牛乳来源
ZipTip 吸头Merck MilliporeZTC18S096C18 树脂

参考文献

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