利用基于活动的厌食啮齿类动物模型研究神经性厌食症的神经生物学基础

摘要

本文介绍了一种在雌性青春期小鼠中诱导活动性厌食症（ABA）的实验方案。ABA 是指在可接触跑轮的啮齿类动物中，通过施加食物限制而引发的一种过度活动状态。该现象被用作研究神经性厌食症潜在神经生物学机制的模型。

摘要

神经性厌食症（AN）是一种精神疾病，其特征是热量摄入严重受限以及体力活动水平异常升高。由于对潜在神经生物学机制缺乏了解，该病治疗困难，且在所有精神疾病中死亡率最高。为应对这一需求，神经科学家正在利用动物模型研究神经回路如何影响个体对神经性厌食症的易感性，以及这些回路如何受到该疾病的影响。活动性厌食症（ABA）是一种在啮齿类动物中描述的生物行为现象，可模拟神经性厌食症的核心症状。当能够自由在转轮上进行自主运动的啮齿类动物经历食物限制时，它们会表现出过度活跃行为——其运动量超过可自由进食的动物。本文描述了在青春期雌性C57BL/6小鼠中诱导ABA的实验操作流程。出生后第36天（P36），将小鼠饲养在配备可自由使用的转轮装置的笼具中。经过4天对转轮的适应期后，在P40日移除笼内所有食物。随后连续3天，每天将食物重新放回笼中2小时（允许动物自由进食）。在食物限制的第四天后，恢复自由进食，并从笼中移除转轮，使动物进入恢复阶段。连续多日对转轮活动的分析显示，小鼠在食物限制开始后24小时内即出现过度活跃行为。即使在短暂的食物可获得期间，小鼠仍持续在转轮上奔跑。此外，食物限制还会破坏转轮活动的昼夜节律模式。我们已能够将神经生物学变化与动物转轮行为的不同方面相关联，从而揭示特定脑区及神经化学改变在食物限制诱导的过度活跃中的抗性与易感性作用。

引言

神经性厌食症（AN）是一种精神疾病，其特征为过度限制食物摄入、过度运动以及对体重增加的非理性恐惧。作为最致命的精神疾病之一¹，截至目前，神经性厌食症尚无被广泛接受的药物治疗方法，且该疾病的神经生物学机制及其影响仍不甚清楚。我们正在研究一种神经性厌食症的动物模型，以探索与该疾病典型症状相关的神经生物学和神经化学变化。

活动性厌食症（ABA）是一种在啮齿类动物中描述的生物行为现象，可模拟神经性厌食症（AN）的某些特征^2,3。当能够自由在跑轮上进行自主运动的啮齿类动物受到食物限制时，其中许多（但并非全部）会表现出过度活跃行为——即在食物限制开始后跑动量超过此前水平^3,4。对于ABA动物和AN患者表现出的过度运动行为，已有多种解释被提出：可能是觅食行为的一种形式⁵，可能是应对食物限制压力的机制⁶，可能是试图在饥饿导致代谢下降期间提高体温的尝试⁷，或为低瘦素血症的结果⁸。该啮齿类动物模型可重现AN的症状，包括体重下降、过度活跃、在有限进食时间内选择跑步而导致的自主性食物摄入减少、与焦虑特质的相关性^9,10，以及早期生活经历对易感性的影响¹¹。尽管啮齿类动物的ABA模型被视为一种应激模型，但这可能无法准确反映人类AN患者表现出免疫功能增强的现象¹²。在啮齿类动物和人类患者中，部分个体表现出更高的易感性。虽然流行病学研究致力于阐明AN的风险因素，但相对较少的研究尝试揭示啮齿类动物对ABA诱导易感性个体差异的神经生物学基础。

需要注意的是，ABA范式被广泛使用，其作为神经性厌食症动物模型的应用已得到充分综述^6,13-15。本研究的贡献在于详细阐述在青春期雌性小鼠中诱导ABA的具体方法，并说明为提高幼鼠存活率而对现有啮齿类动物模型所作的必要修改。此外，我们还讨论了可与ABA行为范式结合使用的多种技术，以研究该动物模型的其他方面。

小鼠ABA模型可用于严格探究神经性厌食症（AN）的神经生物学机制，该机制可独立于社会文化因素的影响，尽管后者无疑会增加个体的易感性。ABA模型还可用于研究反复食物限制或其他形式的压力与转轮活动相结合对AN复发某些方面的模拟作用¹⁶。利用电子显微镜技术已对大脑焦虑中枢中抑制性神经递质系统的功能进行了研究^4,16,17。通过Neurolucida辅助的神经元示踪及分析海马CA1区^18,19和杏仁核¹⁷中的锥体细胞，研究人员已对树突分支结构进行了研究。 食物限制和转轮活动对焦虑行为的影响已通过高架十字迷宫等行为学测试方法进行了评估¹⁰。利用不同近交系小鼠可研究个体易感性的遗传基础⁹。在开展人体试验之前，可在动物模型中测试药理学干预的效果^20-24。通过使用基因修饰动物或瞬时基因敲低技术，可研究特定分子通路的调控如何影响ABA范式中的行为表现。早期生命阶段所经历的压力对ABA易感性差异的影响，也是该模型可进一步探讨的科学问题。

方案

本方案中描述的所有操作均符合纽约大学机构动物护理和使用委员会（动物福利保证编号 #A3317-01）的规定。
注意：本方案已针对青春期雌性 C57BL/6 小鼠进行了优化。动物饲养在温度维持在 72° ± 2°、相对湿度维持在 50% ± 10% 的设施中。房间照明每日从上午 7 点开启至晚上 7 点。

1. 带跑轮的笼具准备

1. 将计算机和USB接口集线器放置在动物饲养室的安全区域，远离水源和人员走动频繁的位置，但需靠近笼架，以确保处于发射器的无线信号范围内。确保计算机和USB接口集线器均通过墙插供电，并使用USB线缆将USB接口集线器连接至计算机。使用电源备份设备为计算机和USB集线器同时供电。
2. 使用跑步轮设备附带的USB线缆将计算机连接至USB接口集线器。 
3. 启动计算机，并通过双击图标运行跑步轮软件。
4. 在每个跑步轮底部安装三节AAA电池，并确认轮控管理软件已识别到发射器。在程序窗口中“轮传感器”标题下列出每个跑步轮。
5. 根据实验的具体要求设置数据采集的配置参数。
6. 为每只实验小鼠准备一个笼子，内含垫料、筑巢材料、自由饮用的水和一个跑步轮。通常，神经解剖学研究每项实验使用8只小鼠。行为学研究可能需要更多小鼠，以确保足够的统计效力。
7. 确保跑步轮能够自由转动，不接触笼壁、食槽或笼盖。手动旋转每个跑步轮数次，并确认软件正在更新每个轮子的转数记录。

2. 驯化阶段

1. 将每只小鼠（雌性 C57BL/6 小鼠；日龄 P36）单独放入带有跑轮的笼子中。
2. 向食槽中加入已预先称重的干饲料（约 100 g），并在笼内放置一个已预先称重的湿饲料容器（约 50 g）。
3. 在程序窗口中，通过选择“文件”菜单中的“开始采集”选项，启动跑轮活动数据的采集与存储。选择数据保存的目录。软件将持续记录跑轮的转动次数，直至实验被手动停止。
4. 每天在房间灯光关闭时，称量动物、湿饲料和干饲料的重量。若干饲料重量低于 50 g，则补充饲料；若湿饲料变干或被垫料污染，则更换湿饲料容器。同时在此时间手动记录当天的跑轮计数，以防数字数据丢失。

3. 开始食物限制

1. 在食物限制的第一天中午（或在房间灯光关闭前7小时），从笼子中移除所有湿粮和干粮。
2. 同一天，在黑暗周期开始时，记录动物体重和跑轮计数。将预先称重的干粮（约50 g）放入饲料斗中，并将预先称重的湿粮（约5 g）放入称量舟内置于笼中。
3. 为每只动物准备一个带有垫料和筑巢材料的新鲜笼子。
4. 2小时后，将跑轮转移到已准备好的新笼子中。此换笼操作可确保动物在下次喂食前持续处于食物限制状态，以防有食物碎屑掉落在垫料中或被储藏。为减少换笼带来的应激，可从旧笼中取出两捧（约500 ml）污染过的垫料加入新笼，并将动物转移至新笼中。
5. 称量剩余的湿粮和干粮重量，以确定动物摄食量。在食物可获取时段结束时记录跑轮计数。

4. 食物限制期间的动物健康监测

1. 每天在暗周期开始时，记录动物的体重和跑轮计数。将预先称重的干粮和湿粮放入笼中。
2. 如果动物的体重在食物限制前降至其初始体重的75%以下，则将其移出实验。
   注意：过度饥饿的其他表现包括弓背姿势、无法在笼内活动。动物触摸时可能感觉冰冷，并且在2小时的食物获取期间未能进食。
3. 为每只动物准备一个带有垫料和筑巢材料的新笼子。
4. 2小时后，将跑轮转移至准备好的新笼中。加入两捧（约500 ml）来自旧笼的污染垫料，并将动物转移到新笼中。
5. 称量剩余的湿粮和干粮重量，以确定摄食量。在食物获取期结束时记录跑轮计数。

5. 结束实验

1. 经过三天的食物限制后，结束ABA实验。处死动物以收集脑组织，或让动物恢复后再进行其他行为学测试。
2. 在程序窗口的“文件”菜单下，点击“结束采集”选项。
3. 从笼子中取出跑轮，并从跑轮底座中取出电池。
4. 若允许动物恢复，将预先称重的定量干饲料放回饲料槽，并让动物自由进食 随意摄取 恢复期间的食物获取。

6. 数据分析

1. 将实验的所有转轮数据保存在实验开始时选定目录中的 .wls 文件中。
2. 通过在“文件”菜单中选择“导出”选项，将数据导出至电子表格。在“源数据文件”选项中选择所需的 .wls 文件，设置起始和结束日期与时间，并在“转轮传感器”列表中选择每个需要导出的转轮传感器。

结果

为了在与人类神经性厌食症相似的群体中研究 ABA 的影响，这些实验在雌性青春期小鼠中进行。因此，转轮适应从小鼠青春期开始后不久的第 P36 天启动。适应期为 P36 至 P40 天，食物限制则在 P40 至 P43 天期间进行。

青春期小鼠仍在持续生长，其体重随着接近完全成年而继续增加。在跑轮适应期间，小鼠体重通常会轻微下降或保持稳定。食物限制开始后，限制性进食伴跑轮组（ABA）动物的体重迅速下降（图1）。可将ABA组动物的体重与对照组（CON）动物进行比较，后者未接触跑轮且未经历食物限制。

每只动物的转轮活动可通过多种方式进行分析：（1）可绘制限食-暴食（ABA）动物每日（24小时）的转轮活动图，显示动物在开始食物限制后即出现过度奔跑行为（图2）。（2）可使用分析软件对每只动物的转轮活动进行更精细的观察，以揭示其转轮活动的昼夜节律模式（图3）。（3）在每日2小时的食物可获得期间的转轮活动反映了动物的自愿性食物限制，因为动物选择奔跑而非进食。（4）食物限制开始后，部分动物在喂食前的一段时间内活动量增加，这种每天在食物呈现前出现的运动活动增强被称为“食物预期性活动”（图4）。（5）可比较动物奔跑的速度，因为系统持续监测其在转轮上奔跑的距离和停留时间。这些参数的变化可能反映了动物在转轮上奔跑的学习阶段。

动物在转轮活动、摄食行为和体重减轻方面表现出个体差异。尽管这种个体差异通常使得难以获得具有统计学意义的组间平均值差异，但它为相关性分析提供了可能。例如，ABA 小鼠的体重变化与其每日转轮跑动量的变化呈正相关，即转轮活动更多的动物体重下降也更多¹⁶。在同一项研究中还发现，在第二次经历 ABA 时表现出活动减少的动物，其海马 CA1 区锥体细胞的 GABA 能神经支配有所增加。在一项使用 ABA 大鼠的研究中发现，表达含 α4 亚基 GABA 受体的水平与活动减少或对 ABA 的抵抗性相关²⁵。

图 1. ABA 期间的体重变化。数据来自一组五只青春期雌性小鼠。在整个实验的 7 天中，小鼠均可自由接触跑轮。前四天为适应期，随后进行三天的食物限制。第 0 天表示食物限制的开始。误差条表示平均值的标准误差。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2. 食物限制开始前后每日转轮活动量。显示一只小鼠的每日（24 小时）转轮活动情况。第 0 天表示开始食物限制。食物限制开始后，每日总转轮活动量几乎增加了一倍。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 八天实验期间持续监测的转轮活动情况。图中显示的是Wheel Analysis软件的截图，展示了单只小鼠在八天内（横轴为时间）接触转轮时的转轮活动情况（纵轴为转轮计数）。活动曲线图下方叠加了实验室光照周期的明暗时段。在食物限制开始之前，动物在光照周期内的活动极少。第一条垂直虚线表示食物限制的开始，随后的三条垂直虚线表示每天2小时的进食开始时间，红色箭头表示在光照阶段出现了进食预期性活动。请点击此处查看该图的高清版本。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 4. 转轮活动在全天各个时段均有所增加，但在食物可获取前的时段增加最为显著。图中显示了一天中四个6小时时段的转轮运行情况。“禁食前”（Before FR）的柱状图表示适应阶段最后两天期间转轮平均计数。“禁食期间”（During FR）的柱状图表示食物限制阶段的前两天。“恢复期”（Recovery）表示动物在移除转轮后至少恢复6天后的活动水平。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

ABA 模型的关键要素包括：（1）动物可自由地在跑轮上进行自主运动；（2）食物摄入受限，仅在限定的时间段内提供食物。提供跑轮使动物能够自主选择是否运动，从而反映食物限制对其运动动机的影响。 相反，限时进食（而非单纯限制热量摄入）使实验者能够通过监测动物在有限进食时段内主动奔跑的程度，来评估其自发性食物限制行为。因此，ABA 模型是研究神经性厌食症（AN）中自我饥饿现象的理想模型。

为了尽量减少小鼠行为数据中的噪声，重要的是要尽量减少动物所经历的不可预测的压力。例如，应尽量减少对动物的抓取操作，每天仅在称重时打扰一次。抓取动物的实验人员应经过培训，并熟练掌握动物抓取技术。如果可能，整个实验过程中应由同一个人负责处理动物，以避免额外的压力。应避免使用香味或香水。称重和喂食的时间应尽可能保持规律，以减少任何不可预测性。为防止数据丢失，建议通过备用电源为计算机供电，以防停电；即使短暂的电力中断也会导致计算机重启，从而使数据采集中断。此外，每天监测跑轮发射器的电池寿命非常重要。如果电池电量不足，发射器可能会间歇性地无法向集线器发送数据，从而低估动物的活动量。

此处所述的小鼠实验方案是在已用于大鼠的标准方案基础上进行修改的⁴。青春期雌性小鼠因饥饿导致过度体重下降和死亡的风险更高。因此，为提高小鼠在限制性活动—节食（ABA）模型中至少存活三天的生存率，进行了以下调整：首先，将首次食物限制的开始时间缩短，改为在中午撤除食物，而不是在前一天晚上8点撤除；其次，将每日进食时间从1小时延长至2小时，并额外提供湿粮，以减轻脱水的影响。我们发现，为小鼠提供湿粮显著改善了其在连续三天食物限制期间的身体状况。若不提供湿粮，小鼠体重下降速度明显加快，必须提前将其移出食物限制环境。 上述改进足以使小鼠在连续三天的食物限制过程中存活，并能顺利从ABA状态中恢复。

ABA 实验方案存在一些重要的局限性需要考虑。首先，必须将小鼠单独饲养在带有跑轮的笼子中，以便独立监测每只小鼠的跑轮活动。这会导致动物处于社会隔离状态，而社会隔离是一种已知的应激源，可能影响小鼠在 ABA 期间的行为以及正在研究的某些神经环路²⁶。目前尚无可用设备能够监测同笼饲养小鼠的个体活动，但使用 RFID 技术和附着在每只动物身上的追踪标签似乎可以解决这一问题。在食物限制期间同笼饲养动物的另一个可能无法避免的后果是动物可能对其笼伴表现出攻击性。每次喂食后更换笼子是另一个我们必须引入的应激因素，原因是某只动物会将食物藏匿在垫料下方。为了尽量减少更换新笼子带来的应激，我们会在新笼中加入大量来自原笼的污染垫料。

其他使用ABA模型的研究团队选择了不同的喂养时间表参数。在光暗循环的暗期阶段，喂食时间的选择并无统一标准。我们选择在光照关闭时喂食动物，以提供一个更自然的进食时间，因为夜行性小鼠在此时段通常更为警觉和活跃。一些研究团队在光照开启的白天时段进行喂食^13,27。这可能是出于实验人员操作便利性的考虑，但需要注意的是，在光期提供食物的时间窗口应适当延长，以提高动物的存活率。此外，有研究建议在喂食期间限制动物接触跑轮，可能有助于提高存活率；但我们认为，这样做会消除ABA模型中一个非常有趣的行为特征——即部分动物选择奔跑而非进食，从而进一步加剧自体饥饿现象，而这恰恰反映了与神经性厌食症（AN）相关的人类行为的核心特征。

需要注意的是，本方案已专门针对青春期雌性 C57BL/6 小鼠进行了优化。如果使用不同的小鼠品系、性别或年龄组，该方案的某些参数可能需要调整。此外，已有研究表明，室温（RT）会影响啮齿类动物 ABA 模型的严重程度²⁸。尽管我们在研究中未尝试改变室温（RT），但提高室温（RT）可能会改善 ABA 动物的存活率。

使用人类疾病（如神经性厌食症AN）的动物模型的优势在于，可以在受控环境中研究大脑解剖结构、生理功能以及由自愿运动和食物限制所诱导的变化。在ABA模型中使用小鼠，能够利用转基因动物和病毒介导的基因操作等强大的遗传学方法。未来的研究旨在探讨特定基因在食物限制诱导的过度活动及自体饥饿中的抗性或易感性中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠用无线跑轮	Med Associates	ENV-044
USB 接口集线器	Med Associates	DIG-804
跑轮管理软件	Med Associates	SOF-860
跑轮管理数据分析软件	Med Associates	SOF-861
饮食凝胶 76A	Clear H2O	72-07-5022
小鼠饲料 5001	PMI