为了研究病理条件下大脑的重组，我们使用微型渗透泵将蛋白质直接递送至大脑，从而绕过血脑屏障。随后注射示踪剂，以研究在该蛋白质影响下大脑连接性的改变。
本文内容
摘要
摘要
在脑部疾病的动物模型中，药物治疗面临重复给药方案的问题，这可能引起动物应激反应，并导致药物在组织中的浓度不稳定。此外，由于血脑屏障（BBB）的存在，药物向脑组织的递送十分困难，使得系统性给药后脑内靶向药物的浓度显著降低。因此，需要一种既能实现持续给药、避免血药浓度峰值，又能绕过血脑屏障的递送系统，以达到足够高的脑内药物浓度，特别是针对那些无法透过血脑屏障的药物。在此背景下，微型渗透泵是一种理想的给药系统，可按照已知的恒定速率持续释放药物，避免动物因每日注射而产生的应激，并可用于药物的直接脑内递送。本文介绍了一种微型渗透泵植入方法及术后动物护理措施，以确保该技术的成功应用。我们将上述实验范式整合到研究C57BL6小鼠脑内神经可塑性的标准流程中。具体而言，我们对动物实施了30分钟的脑梗死造模，并通过导管将微型渗透泵连接至颅骨，用于递送促进神经可塑性的药物。在为期30天的治疗期间进行行为学检测。在治疗结束后，向动物注射顺行性神经束示踪剂，以评估恢复慢性阶段的神经元可塑性。结果表明，所递送药物提供的神经保护作用伴随着投射至靶区结构并跨越脑中线的运动纤维数量增加。这些结果证实了该技术在现代神经科学研究中用于药物递送和脑可塑性研究的重要价值。
引言
将蛋白质和药理化合物递送至大脑是研究脑部疾病机制和评估潜在治疗分子的重要策略1,2。在实验神经科学中，递送质粒或腺病毒等载体已成为研究蛋白质在大脑中长期作用的重要工具3,4。单次注射载体的优势在于，该系统本身可在大脑中维持治疗剂高度稳定的水平4。然而，在需要长期实验的情况下，通过腹腔注射进行纯化药物的全身给药会对小鼠或大鼠造成应激反应，且当需要靶向脑区产生特定反应时并非最佳选择，同时还需使用较大剂量的药物5。微型渗透泵通过绕过血脑屏障导致的药物入脑困难以及药物浓度峰值问题，成为实现长期直接向脑内递送药物的理想系统，因为药物可直接输送到脑内特定部位，并以所选泵型号设定的恒定流速进行释放2,6,7。事实上，我们已成功利用该系统通过递送多种药物（如重组人促红细胞生成素（rhEpo）和血管内皮生长因子）研究中风后的脑功能恢复6,7。
脑可塑性对于脑损伤后神经连接的重新布线至关重要。可塑性是一个广泛的概念，包括突触连接的形成或消除、树突棘的生长，以及长距离连接的延伸或回缩8,9。过去人们认为大脑在发生病灶损伤后无法重建连接，但已有多种研究表明，只要给予适当刺激，大脑便能够重新建立连接6,7,10。其中一种特别适用于研究该过程的技术是示踪束路追踪法。顺行性束路示踪剂是一类能够进入神经元胞体，并沿轴突分布至其靶区结构的化合物，例如级联蓝（cascade blue, CB）和生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine, BDA）。相反，逆行性束路示踪剂（如霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B, CTB）或荧光金（fluorogold, FG））则通过轴突终末进入神经元，并逆向分布至胞体，从而揭示投射至注射位点的神经元的起源位置。
本文介绍了我们用于植入微型渗透泵的方法，该泵可直接递送对神经可塑性具有潜在作用的蛋白质或药物，同时还介绍了注射BDA和FG以揭示运动皮层的输入和输出连接。此外，将以BDA为例，说明其作为示踪剂用于展示在重组人促红细胞生成素（rhEpo）治疗下，卒中后同侧皮层发出的轴突可塑性增强的情况。
方案
动物实验经政府批准 （G1361/13，AZ84-02.04.2013.A192 和 G1362/13，AZ84-02.04.2013.A194；杜塞尔多夫行政区）进行，依据《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》。
1. 微型渗透泵的制备
- 在无菌环境（即，细胞培养罩内），取出待使用的泵、导管、流速调节器、脑内灌注套管及间隔片（图1）。
- 若需将药物直接递送至脑室，使用一片间隔片，使套管针尖端仅与脑室接触。用镊子夹住套管，倒置固定，滴加两滴氰基丙烯酸酯胶（C.A.），插入一片间隔片。
- 将套管针尖朝上平放于平坦表面，使间隔片与套管之间的胶水充分干燥。
- 将导管切成约2.5 cm的节段。
- 每只泵需准备至少300–350 µl的目标溶液，用于完全充满泵体，排出内部所有空气，防止导管内形成气泡。气泡会阻碍溶液向脑内的输送。
- 小心地将导管连接至流速调节器。
- 使用脑内灌注试剂盒提供的针头连接2 ml注射器，向泵内注液，直至有少量液体从泵体溢出，以确保泵内无气泡残留。
- 小心填充流速调节器和导管，注意避免导管内残留任何气泡。
- 将流速调节器插入泵体内。
- 填充完成后，小心将套管连接至导管末端。若发现形成气泡，应取下套管，用溶剂或药物溶液小心重新填充导管，再重新连接套管。
- 将泵置于含无菌生理盐水的容器中，37 °C过夜孵育。
- 植入前重新检查是否形成气泡。如有必要（即，观察到气泡），取下套管并重新填充导管，再重新连接套管。此过程仅需数微升溶液。
2. 微型渗透泵的植入
注意：本实验中动物采用1%异氟烷（30% O2，70% N2O）进行麻醉。但如果条件不允许，也可使用腹腔注射麻醉剂的方法11。
- 在麻醉状态下将动物固定于立体定位仪中，并在眼睛上涂抹保护性软膏以防止麻醉期间角膜干燥。通过用手指或镊子轻压后肢足垫，观察是否无反应来确认麻醉效果。在动物完全进入睡眠状态前，不得进行后续操作。
- 使用剪刀或剃毛器将头部的毛发剪除，尽可能剪净毛发，但避免损伤皮肤。
- 用70%乙醇清洁皮肤，并使用具有抗菌和抗真菌特性的消毒剂进行消毒。
- 使用手术刀在颅骨中线稍偏右侧处做一约1 cm的切口，暴露颅骨。
- 用棉签清洁颅骨表面，蘸取70%乙醇并擦拭颅骨，以促进颅骨干燥。
- 若颅骨出现轻微出血，使用电灼器清除出血点。血液会影响骨表面在植入套管后氰基丙烯酸酯（C.A.）的正常干燥。
- 利用立体定位仪在颅骨上标记套管植入位置。若需对左侧脑室进行灌注，定位坐标为前囟后方-0.2 mm，旁侧0.9 mm（图2A）。
- 以45°角轻柔钻颅，以防止钻头意外进入脑组织。每次钻几秒钟后即检查钻孔深度，当颅骨已磨薄但尚未完全穿透时即停止钻孔。
- 用无菌针尖轻柔刺破脑膜，直至完全暴露脑组织。操作时应避免损伤脑组织。
- 使用棉签蘸取70%乙醇再次清洁颅骨表面。
- 将直血管钳沿动物皮下从前向后方向插入，用以在背部皮下开辟容纳泵体的空间。将泵体植入背部，导管和套管保留在外侧（图2B）。泵体将保持在此位置直至被取出，无需额外固定。
- 在套管针周围小心滴加四小滴胶水。
- 小心将针头垂直穿过颅骨，避免横向移动。保持针头位置15–30秒，直至套管完全固定（图2C.1）。若使用一个垫片，套管在背腹方向将深入2.5 mm。若固定良好，套管将牢固附着于颅骨，直至实验结束。
- 用一根手指按住可拆卸标签，另一只手持剪刀将其颈部剪断（图2C.2）。
- 使用5-0缝线缝合皮肤切口，并在伤口表面滴加数滴聚维酮碘溶液（PVP-I），以预防感染（图2D）。
- 将动物转移至新的笼具中。不得将术后动物与未手术动物同笼饲养。在药物给药期间，应将植入泵的动物单独饲养。
- 在动物苏醒并恢复胸卧位之前，不得使其无人看护。
3. 泵的移除
注意：实验通常会在泵允许的给药时间结束时终止，但也可以移除泵以进行后续的二次实验，作为药物递送的补充。因此，若要进行示踪剂注射，则必须移除泵。
- 将动物置于立体定位装置中并实施麻醉，用保护性软膏覆盖眼睛，以防止麻醉期间眼睛干燥。通过用手指或镊子按压后肢足垫并观察其无反应来确认麻醉效果。在动物完全入睡之前，不得进行下一步操作。
- 沿植入泵当日所做的切口小心切开皮肤。
- 使用手术钳夹住套管并将其拔出，应可轻松从颅骨中取出。由于可能出现轻微出血，可用棉签按压止血，并等待1-2分钟。
- 通过导管将泵体拉出，同时可轻推泵体以增加皮肤压力，协助其排出。
- 使用5-0缝线再次缝合伤口，并滴加数滴聚维酮碘（PVP-I）。
- 将动物转移至新的笼具中。不要将已手术动物与未手术动物同笼饲养，但已接受手术的动物之间可以合笼。
- 在动物苏醒并恢复胸卧位之前，不得使其无人看护。
- 在进行示踪剂注射前，让动物恢复10天。
4. 在右侧运动皮层以45°角进行压力示踪剂注射
- 将动物置于立体定位仪上并实施麻醉，同时用保护性眼膏覆盖眼睛，以防止麻醉期间眼睛干燥。通过用手指或镊子按压后肢足垫并观察无反应来确认麻醉效果。在动物完全入睡之前不得进行下一步操作。
- 切开头部伤口。
- 使用棉签蘸取70%乙醇清洁颅骨表面。
- 将一支5 µl玻璃微量注射器（26S规格）安装至设备的垂直固定架上。确保玻璃固定架的下端精确地位于夹持部件处。注射器不可过于低于该位置，否则将无法将其调整至与垂直方向成45°角，从而无法完成注射。
- 将注射器对准前囟点正上方，随后定位目标坐标。若需向运动皮层注射，则坐标如下：第1点：相对于前囟点，+0.5 mm 头侧，2.5 mm 外侧；第2点：相对于前囟点，+1.34 mm 头侧，2.5 mm 外侧。
- 确定坐标后，使用细头标记笔在颅骨表面标出其位置。仅在颅骨上标记一个点，避免墨水过多导致正确坐标被遮盖。
- 以45°角小心钻开颅骨。与步骤2.8类似，需频繁检查颅骨钻孔情况，避免完全穿透颅骨，以防钻头损伤脑组织。使用注射器针尖确认所有骨质已被清除。
- 向注射器中装载600 nl示踪剂稀释液。
- 将注射器垂直位置调整为向动物右侧倾斜45°角。在显微镜下，将注射器针尖准确置于钻孔前方。
- 将针尖垂直进针1.5 mm。在进行压力注射前，让针尖在此位置稳定停留30秒至1分钟。
- 分三次注射共300 nl示踪剂稀释液，每次100 nl，间隔30秒。最后一次注射完成后，将注射器继续留置原位30秒至1分钟，以防止示踪剂从脑组织中回流。
- 缓慢抽出注射器，将其移至第二个钻孔位置，并使用注射器中剩余的300 nl示踪剂重复相同操作。
- 完成第二次注射后，取出注射器，使用5-0缝线缝合伤口，并滴加数滴聚维酮碘（PVP-I）进行消毒。
- 将动物转移至新的笼盒中。已手术动物不可与未手术动物同笼饲养，但已接受手术的动物之间可以合笼。在动物苏醒并恢复胸卧位之前，不得使其无人看护。
- 让动物术后恢复10天后再进行处死取材。
5. 示踪剂观察
- 根据机构指南对动物实施完全麻醉。通过用手指或镊子按压后肢足垫并观察其无反应来确认麻醉效果。在动物完全入睡之前，不得进行下一步操作。
- 按照标准方案6，使用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（pH 7）对动物进行灌注。
- 取出脑组织，并在4%多聚甲醛中浸泡过夜以进行后固定。
- 将脑组织置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，直至脑组织沉底。随后取出脑组织，浸入液氮中冷冻10秒。将脑组织保存于-80 °C，直至切片制备。
- 使用冷冻切片机切片，用于逆行纤维束示踪分析的切片厚度为20 µm，用于顺行纤维束示踪分析的切片厚度为40 µm。
注意：在紫外光激发下，荧光素标记的神经元可观察为白色细胞。BDA通过与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物以及含0.4%镍的3,3’-二氨基联苯胺进行过夜孵育来检测，以增强纤维的对比度6,7。
结果
我们采用线栓法对动物进行30分钟的中动脉闭塞，诱导左侧纹状体损伤，随后通过微型渗透泵在脑内直接给予重组人促红细胞生成素（rhEpo），治疗持续30天，自脑卒中后第3天开始（图1、图3）6。图4展示了经CB和BDA注射后示踪的皮质脊髓束示意图以及示踪剂注射的区域。我们发现，在给予rhEpo治疗14天和42天后，动物的抓握力量和运动功能均得到改善（图5）。在左侧纹状体发生脑卒中的动物中，向右侧运动皮层注射BDA后，结果显示在红核和面神经核水平，跨越中线的运动纤维数量增加（图5），表明通过微型渗透泵进行药物治疗后，新生纤维成功被染色。rhEpo治疗还增加了神经元存活率，延缓了弥漫性星形胶质增生，减少了胶质瘢痕形成，并在研究期间促进了血管生成6。通过使用相同的示踪纤维注射技术，我们能够通过逆行示踪剂氟金（FG）注射成功检测到与皮层相连的丘脑核团（图6）。
图1. 本实验方案所用微型渗透泵的组成部件。 可见间隔盘、套管及可拆卸标签、导管、流速调节器和微型渗透泵。完整组装后的泵外观如图2A所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 泵植入关键步骤概述。（A） 小鼠被放置在立体定位仪上，旁边为已组装完成的微型渗透泵。箭头指示选定的植入坐标。（B） 泵体已植入动物背部，仅导管部分露于体外，颅骨已钻孔。（C） 植入后头部外观。（C.1） 导管已就位，但可拆卸标签尚未剪除。（C.2） 可拆卸标签已被剪除，现在可开始缝合伤口。（D） 星号（*）表示刚完成植入的动物，与植入后30天的动物（#）进行对比。若饲养条件适当，伤口应保持闭合直至实验结束，如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. 尼氏染色显示皮层上的植入部位。 可在左侧皮层部分观察到一个小切口（箭头）。穿透区域的宽度约为 50 μm。与相应的对侧区域（*）相比，尼氏染色未显示明显的严重组织改变。R：右半脑。L：左半脑。比例尺 = 300 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 顺行与逆行示踪剂注射策略，如 Reitmeier et al.6,7 之前所发表。(A) 示意图显示在对侧运动皮层注射顺行示踪剂 BDA，而在梗死半球的运动皮层注射 CB。纤维投射路径追踪至红核（未显示）和面神经核（见图 5）。(B) 显示顺行示踪剂 BDA 在运动皮层附近的注射位点。注意红色箭头指示针道，黑色箭头显示少数被 BDA 标记的皮层细胞。Cx：皮层；CC：胼胝体；V：脑室；FN：面神经核。B 图中的比例尺 = 200 µm。图 4A 经许可转载6。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 注射重组人促红细胞生成素（rhEpo）后梗死脑组织的功能恢复。 (A) 在对侧运动皮层注射BDA后，可在面神经核水平（Bregma -5.8 mm 至 -6.3 mm）检测到皮质脑干纤维中的示踪剂信号。在双侧半球上绘制平行于中线的交界线，统计跨越每条线朝向同侧和对侧半球的纤维数量，并以皮质脊髓束中标记纤维总数的百分比表示。促红细胞生成素可增加朝向对侧面神经核的纤维跨越数量。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行最小显著性差异检验进行数据分析；§P<0.05，与溶剂处理的非缺血小鼠相比。 (B) 运动行为学结果显示，在转棒实验中，前肢握力和协调能力均得到改善。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），随后对每个时间点分别进行单因素方差分析/最小显著性差异检验；§P<0.05，与缺血前基线水平相比；*P<0.05，与溶剂处理的缺血小鼠相比。 图 5A 和 5B 经许可转载6。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 6. 荧光金（FG）注射后到达的目标结构。 (A) FG 注射部位位于运动皮层附近，如图 1所示。注意红色箭头指示的针道轨迹，以及白色箭头指示的皮层中少量标记的细胞。(B) 注射于运动皮层附近的 FG 在腹后外侧丘脑核（VPL）中被检测到。Fi：穹窿。IC：内囊。RT：丘脑网状核。VPL：丘脑腹后外侧核。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
多年来，针对缺血性中风或创伤性脑损伤等神经退行性疾病的研究所关注的重点一直是开发神经保护疗法，旨在促进急性中风期神经元的存活。在啮齿类动物模型中被证明有效的绝大多数药物疗法，在转化到临床应用时均告失败。导致这些治疗失败的原因包括但不限于药物效应无法持续，从而难以实现持久的神经功能恢复。因此，开发能够长期促进大脑重塑的策略显得尤为重要。由于仅促进神经元存活不足以实现中风后的成功恢复——大量神经保护临床试验的失败已表明了这一点——近年来，促进神经可塑性的研究在该领域受到了广泛关注。
药物递送方式包括腹腔注射、尾静脉注射、股骨注射、单次立体定位脑内注射载体，以及通过微型渗透泵进行持续恒定递送。后者若泵体无导管，则可实现全身递送；也可实现器官靶向递送，正如我们已展示的脑内递送方式。除微型渗透泵和病毒载体的使用外，所有其他策略均会导致药物浓度波动。因此，在长期实验中，动物需反复接受注射，承受相应应激。血脑屏障（BBB）严重阻碍了蛋白质或药物从血液进入脑组织，导致必须使用极高剂量的蛋白或药物，才能在脑内达到治疗浓度。例如，Pellegrini et al. (2013) 5 通过腹腔注射给予重组人促红细胞生成素（rhEpo），剂量相当于每30 g动物75 IU/天（300 g大鼠为750 IU/天）。相比之下，在本研究中，通过靶向脑内递送rhEpo，我们仅需使用每天10 IU的较低剂量，即可实现有效的卒中后恢复，并能在较长时间尺度上以0.25 µl/hr的固定速率完成递送。
本研究展示了通过植入连接颅骨的导管微型泵，将促进可塑性的蛋白rhEpo直接递送至脑室，从而绕过血脑屏障（BBB）的方法。通过该方法，rhEpo以多种方式促进了神经功能恢复，包括减小梗死体积、减少胶质瘢痕形成以及促进血管生成。rhEpo还促进神经元存活，并增加健侧运动皮层向去神经支配的红核和面神经核的神经投射。通过向运动皮层注射顺行束路示踪剂BDA，揭示了纤维的出芽现象（图4A和5A）。纤维出芽的功能相关性体现在运动技能的改善（图5B）。此外，我们还表明，采用相同的束路示踪剂注射方法，可通过注射逆行束路示踪剂FG揭示丘脑-皮层连接（图6B）。
在制备微型渗透泵时，必须考虑目标注射位点以及间隔片的使用。我们使用一个间隔片将导管针的长度缩短0.5 mm，从而使针尖在指定坐标（相对于前囟：-0.2 mm 尾侧，0.9 mm 外侧，2.5 mm 背腹向）精确接触脑室。然而，如果研究目标是更深的脑区，则无需使用间隔片。同样，如果需要更表浅的给药位点（例如，大脑皮层），则需要增加间隔片的数量。导管的长度必须适中：若过短，泵体过于靠近头部，会限制小鼠活动；若过长，植入后多余长度可能导致导管弯曲，从而增加因小鼠自然活动而导致套管脱落的风险。2 cm长度的导管在植入后的活动性和稳定性方面表现良好（图1和图2）。将泵在37 °C下过夜孵育，可使其在植入瞬间即开始向脑内持续泵送药物。
在微型渗透泵植入过程中，关键是要确保在植入套管前颅骨已充分干燥。通常用70%乙醇清洁即可使骨组织干燥，但如果持续出血，可轻轻使用电灼器接触颅骨以彻底干燥。必须确保针头插入尽可能保持垂直且缓慢。一旦就位，在胶水干燥过程中，用手指按住套管顶部可防止其在颅骨上横向移动。应特别注意切口和套管的放置位置。切口不应正好位于颅骨中线，而应略微偏向右侧。缝合伤口时，若切口位于中线，则皮肤会被过度拉伸，从而增加伤口裂开的风险。将切口略微偏向一侧，可使缝合点远离套管最高处，从而减少缝合点的张力，促进伤口正常愈合。动物术后应单笼饲养，并每天检查，尤其是在植入后的前10至15天内。若发生伤口裂开，必须尽快闭合伤口。如果套管脱落或动物出现感染，实验必须终止。不建议重新植入套管。为了成功植入，使用适量的组织粘合剂至关重要（不可过多！），因为过量会降解骨组织并增加套管脱落的风险。然而，粘合剂用量过少也无法牢固固定套管。微型渗透泵可携带溶解于多种不同溶剂中的药物，唯一的限制是溶剂必须具有生物相容性。此外，由于泵的体积较小（200 µl），必须确定实验所需的药物浓度是否合适，且不会在泵内引起沉淀。
使用顺行或逆行示踪剂进行示踪是研究脑连接性和可塑性的成熟技术。注射时必须使用立体定位仪，以确保准确靶向拟研究的脑区。即，以防止在注射皮层时误注入胼胝体。
对于所有外科手术操作，为减轻疼痛和炎症，应在手术前给予动物0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并在手术后连续三天每天一次给予4 mg/kg的卡洛芬。
总之，该方法为研究蛋白质或药理学化合物在损伤脑组织中的作用提供了合适的工具，是一种非常适合脑可塑性研究的技术手段。
披露
本文所使用的微型渗透泵由 DURECT Corporation 生产，其提供本文的出版与开放获取费用。
致谢
本工作由 Dr. Werner Jackstädt 基金会（资助 Eduardo Sanchez-Mendoza）、德国学术交流中心（DAAD；资助 Jeismar Carballo）、德国研究基金会（HE3173/2-1、HE3173/2-2 和 HE3173/3-1；资助 Dirk M. Hermann）以及 Heinz Nixdorf 基金会（资助 Dirk M. Hermann）提供支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alzet 微渗透泵，型号 2004 | Alzet | 000298 | 药物容器 |
| 脑部输注套件 3，1-3 毫米 | Alzet | 0008851 | 药物脑内递送系统 |
| Loctite 454 Prism 胶 | Loctite | 45404 | 用于套管与颅骨粘附的氰基丙烯酸酯粘合剂 |
| 75N 玻璃注射器 | Hamilton | 87900/00 | 用于示踪剂注射 |
| 生物素葡聚糖胺（10,000 分子量） | Molecular probes | N-7167 | 顺行性纤维束示踪剂 |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | 逆行性纤维束示踪剂 | |
| Quintessential 立体定位注射仪（QSI） | Stoelting | 53311 | 用于坐标定位、泵植入及纤维束示踪剂注射的立体定位装置 |
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