在实验视神经脱髓鞘模型大鼠视觉诱发电位记录

摘要

使用溶血卵磷脂显微注射在视神经中诱导局灶性脱髓鞘。通过植入视觉皮层的颅骨电极记录视觉诱发电位，以检查体内沿视觉通路的信号传导。该协议详细介绍了电极植入和视神经显微注射的外科手术。

摘要

视觉诱发电位 （VEP） 记录在临床实践中广泛用于评估急性期视神经炎的严重程度，并监测随访期的病程。 VEP 参数的变化与视神经的病理损伤密切相关。该协议详细描述了视神经显微注射的啮齿动物模型，其中在视神经中产生部分脱髓鞘病变。还讨论了 VEP 录音技术。使用颅骨植入电极，我们能够获得可重复的会话内和会话间 VEP 轨迹。可以在一段时间内记录个体动物的 VEP，以纵向评估视神经的功能变化。视神经脱髓鞘模型与 VEP 记录方案相结合，提供了一种研究与脱髓鞘和髓鞘再生相关的疾病过程的工具，并有可能用于评估新的髓鞘再生药物或神经保护疗法的效果。

引言

视神经炎是最常见的视神经病变形式之一，会导致完全或部分视力丧失¹。在组织学上，它的特征是炎性脱髓鞘、视网膜神经节细胞轴突丢失和视神经不同程度的髓鞘再生²。视神经炎通常是多发性硬化症的表现性发作。视觉诱发电位 （VEP） 是一种用于研究视觉系统功能的非侵入性工具。它反映了从视网膜到初级视觉皮层的视网膜后功能，并在许多视神经疾病中受到影响³。VEP 主要用于视神经炎患者，以评估视觉通路的完整性⁴。

VEP 的潜伏期反映了信号沿视觉通路传导的速度，被认为是对视神经髓鞘相关变化水平的准确测量⁵;而 VEP 的振幅被认为与视网膜神经节细胞 （RGC） 的轴突损伤密切相关⁶。使用溶血卵磷脂诱导的视神经脱髓鞘的大鼠模型，这一假设已经得到了相当充分的确立⁵。

在这里，我们阐述了啮齿动物视神经显微注射技术的综合方案，该技术可以最大限度地减少与手术作相关的对神经本身以及眼外肌和血管等邻近组织（如眼外肌和血管）的损伤。此外，颅骨电极植入手术已被描述用于动物的 VEP^{记录 7}。VEP 记录可以在一段时间内对动物重复进行，以评估脱髓鞘/髓鞘再生相关变化以及对视神经轴突完整性的影响。

方案

伦理声明:所有涉及动物的程序是按照实践的护理和使用动物用于科学目的和ARVO声明的动物在眼科和视觉研究中使用的指导方针的澳大利亚准则进行的，并经麦考瑞大​​学动物伦理委员会。

1. VEP植入电极

1. 麻醉动物通过腹膜内注射氯胺酮（75毫克/千克）和美托咪定（0.5毫克/千克）。
   注意:按照麻醉诱导，停药观察反射（捏测试，角膜和眼睑反射等）和它们的不存在作为指示开始手术。持续监测动物在整个手术和管理附加麻醉剂药物（每补足初始氯胺酮剂量的10％），如果反射都存在。成年大鼠（> 12周）中使用的实验。
2. 剃手术区的皮肤上。放置在一个加热垫（37℃）的动物的手术过程中保持体温。通过聚维酮碘局部应用准备的皮肤。应用手术铺巾。应用外用眼药膏，以防止在全身麻醉下角膜干燥。通过使用无菌器械无菌维持。
3. 做一个纵向切开皮肤上的头部皮肤的中线。清除结缔组织达到颅骨良好的曝光。
4. 仔细，钻小毛刺的孔手动用微型手钻在前囱后方7毫米和3mm横向于中线。
5. 通过头骨向皮质（区域17）的植入物螺旋电极，穿透皮质到大约0.5mm的深度。植入螺钉参考电极上的中线3毫米延髓前囟门。应用牙科水泥包住并固定螺丝（并不总是需要）。
6. 缝合头部的皮肤上，给予抗生素软膏在皮肤上，并允许动物RECO从版本上麻醉变暖垫。
   注意:可替换地，电极可被暴露在外面，以便皮肤不需要在每个记录被重新打开。时立即停止手术，但前麻醉恢复，管理一个非甾体抗炎药（NSAID）（如果不施用预可操作）或阿片类镇痛剂。监测动物不断，直到从麻醉剂，并充分卧床完全恢复。
7. 允许至少1周为动物从手术VEP记录之前恢复。

2.视神经注射

1. 麻醉动物，备皮和应用悬垂如上（1.1和1.2）。
2. 作为1〜1.5厘米的切口在一个随机选择的眼睛的轨道上方的皮肤上。打开皮下组织，达到用细虹膜剪刀眶腔。打开结膜和前在手术显微镜下Tenon囊。
3. 收回眼肌肉和眶内泪腺以露出视神经大约3毫米的长度。纵向使用眼用刀片打开视神经周围硬脑膜和蛛网膜物质层。
4. 将玻璃吸管进入视神经处到地球的距离为2毫米后。在玻璃微附着于Hamilton注射器。
5. 注射1％溶血卵磷脂（0.4 - 1.0微升，0.02％Evan的蓝不具有对髓鞘形成的影响）慢慢进入神经大约过了一段30秒。
6. 缝合皮肤切口。应用抗生素软膏以防止感染。对侧眼可作为电生理学记录的内部控制。
7. 上放置一个变暖垫动物从麻醉中恢复。

3. VEP记录

1. 麻醉动物，并准备皮肤1.1和1.2。
   注意:麻醉药较低剂量可用于电RECO录制（氯胺酮40毫克/公斤和美托咪定0.25毫克/千克）。
2. 将大鼠在暗室内，并允许它适应黑暗为5 - 30分钟。在某些情况下，老鼠可能分别为暗适应O / N为暗光或适合适光VEP录音^8。
3. 保持体温在37±0.5℃，由homoeothermic毯系统与直肠温度计探针。
4. 扩张1.0％托眼药水的学生。打开上方的皮肤头骨来访问预放置在原位螺钉电极。
5. 连接螺钉在刺激眼睛的对侧视觉皮层和参考螺钉到放大器。插入针电极插入尾部作为接地。测量和保持低于5kΩ的电极的阻抗。
6. 直接放置在眼睑周围皮肤迷你Ganzfeld刺激提供卓越的眼睛隔离^7。需要的刺激器的照明将被事先标定用光度计。
7. 通过闪烁递送光刺激的100倍在1Hz的频率，具有1到100赫兹的低和高带通滤波器的设置，分别。信号采样率是在5千赫。
   注意:信号应取样至少在约250 - 300赫兹，确保更多的两个样本在每个周期期间被收集。
8. 缝合皮肤背部和保持动物在变暖垫从麻醉中恢复。记录可以重复地记录在个别动物以监测在一段时间的功能变化。
9. 在终点，施用过量注射戊巴比妥钠（100毫克/千克，IP）的安乐死的动物。确认安乐死心脏骤停，呼吸停止和降低体温。

4，组织准备和组织学

1. 从实施安乐死的动物中取出视神经显微镜下，修复1％多聚甲醛O / N的组织。
2. 用生理盐水彻底冲洗组织。对待组织在自动组织处理器和嵌入石蜡。使用旋转切片机 - （10微米5）的切断面。
   注:对于免疫组织化学研究，修复组织中1％多聚甲醛，洗净用盐水和孵化与30％蔗糖O / N。在华侨城中嵌入组织包埋剂，用低温恒温器进行冷冻切片。
3. 在孵育0.1％快蓝溶液部分，如Luxol（95％乙醇）O / N为56℃。区分在0.05％碳酸锂的部分30秒，然后70％乙醇中再持续30秒。最后，安装部分之前染液以0.1％甲酚紫溶液30秒。使用快速蓝染色，以确定视神经髓鞘^5。

结果

再现的帧内期间VEP迹线示于图1和N 1延迟一个显著延迟视神经注射后可以看到。脱髓鞘局部视神经病变可使用Luxol坚牢蓝染色⁵的组织学切片中观察到。 图2示出了代表性的部分有一个小焦点脱髓鞘病变视神经的中心。需要注意的是横截面并不代表病变的总体积。脱髓鞘区域可对神经推断病灶体积通过使用三维重建的每个连续的横截面来测量。我们已经证明了使用该模型在我们以前的研究延迟延迟和病灶体积之间有很强的相关性，也没有VEP延迟延迟在注射盐水的对照^5。

据认为，以下的闪光照明早VEP组分是更稳定的⁷ 5与脱髓鞘最强的线性关系。因此，我们建议N1延迟应该用于数据分析和为在评估髓鞘再生疗法的影响纵向VEP监控。 VEP的振幅，虽然相比于延迟更多变，更表示在视神经⁶轴突的功能。脑电图为基础的缩放可以考虑幅度分析^9。

讨论

视神经非常容易受到机械损伤。在 1 秒内的视神经挤压损伤可导致 2 周内约 75% 的 RGC 损失¹⁰。因此，在进行外科手术时需要格外小心。根据作者的经验，采用钝性解剖方法沿着神经方向暴露视神经周围的组织并让路，而不是垂直于视神经穿透要好得多。此外，硬脑膜和蛛网膜应纵向展开，以避免对 RGC 轴突造成任何轴索切开术样损伤。埃文蓝通常用于促进显微注射，因为染料的存在使注射部位的神经呈浅蓝色。

VEP记录的可重复性对于该实验至关重要。不同类型的麻醉剂和麻醉深度会影响 VEP 波形¹¹。我们不建议在VEP研究中使用吸入异氟醚麻醉，因为异氟醚会导致脑电图反应的爆发抑制¹²，这可能是由于GABA能活性，导致更多可变的VEP痕迹¹³。氯胺酮/美托咪定麻醉联合使用可提供稳定的麻醉，可以通过给予 α 受体拮抗剂（如阿替帕马唑 （2.5 mg/kg ip））快速逆转。体温也会对神经传导速度产生重大影响，尤其是在脱髓鞘神经中。在大鼠 VEP 中观察到视觉诱发电位的温度依赖性变化，并且随着体温降低，观察到潜伏期显着...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮 100 mg/ml （Ketamil）	Troy Laboratories	AC 116
美托咪定 1 mg/ml （Domitor）	辉瑞	sc-204073
托吡卡胺 1.0% （Mydriacyl）	Alcon	sc-202371
同温毯系统	哈佛仪器	NC9203819
阻抗计	Grass	F-EZM5
螺丝电极	微型紧固件	M1.0×3mm Csk 槽 M/T 304 S/S
皮下针电极	Grass	F-E3M-72
快速修复	DeguDent GmbH
发光二极管	Nichia	NSPG300A
生物放大器	CWE， Inc.	BMA-400
CED 系统	Cambridge Electronic Design， Ltd.	Power1401
汉密尔顿注射器	汉密尔顿	87930
溶血卵磷脂	Sigma	L4129
Evan's 蓝色	适马	E2129