类骨模板中微通道的独特毛细作用可增强细胞募集以修复大段骨缺损

摘要

本文介绍了一种逐步构建具有工程化微通道的类骨模板的通用方法。通过微通道的毛细作用，展示了该模板的高吸收和高保留能力。

摘要

如果没有一个活性强、生长旺盛且在植入模板上分布均匀并稳定附着的细胞群体，就无法实现优异的骨再生。传统的模板由于缺乏内部微通道，导致细胞无法深入渗透、分布和定植于模板内部。因此，为克服这些障碍，已开发出一种具有微通道的高孔隙率、均匀相互连通、类似松质骨结构的模板（即生物源性微环境模板，BMT）。这种新型BMT基于创新理念（毛细作用）构建，并采用海绵模板涂覆技术制备而成。BMT包含多个结构组分：相互连通的主孔（300–400 µm），用以模拟松质骨中的孔隙；每根骨小梁内部的微通道（25–70 µm）；以及表面的纳米孔（100–400 nm），以促进细胞锚定。此外，机械性能测试研究已证实，BMT的力学强度与人松质骨相当（约3.8 MPa）¹²。

BMT在桥形（Π形）模板（高3 cm，长4 cm）中表现出对细胞的高吸收性、滞留性和定植能力。最初接种于模板一端的细胞通过BMT对细胞培养基的毛细作用，迅速迁移至另一端（距离10 cm）。4小时后，细胞均匀占据整个BMT，并表现出正常的细胞行为。这种毛细作用促使悬浮在培养基中的细胞浸润并分布（主动迁移）至BMT的各个区域。基于对BMT上述性能的观察，我们推断在生理条件下，BMT能够从周围组织吸收骨髓细胞、生长因子和营养物质。

骨髓移植可能通过快速浸润、均匀分布以及在大体积支架中定植细胞，来克服当前的局限性，从而修复巨大的骨骼缺损。

引言

合成支架用于骨组织工程的最终目标是将支架整合到宿主骨中，由宿主细胞重新定植支架，并重建气体和体液交换，以恢复正常的骨功能。过去十年中，已有大量研究报道了使用聚合物和陶瓷生物材料制备支架的应用^1,2。然而，目前尚未确定最适合骨组织再生的理想材料和制备技术。此外，这些技术在向临床转化方面总体上仍缺乏成功案例，尤其是在大段骨缺损的重建与修复方面。因此，修复临界尺寸骨缺损仍然是临床面临的挑战^1-5。

理想的骨组织再生支架应具备生物相容性，不引发炎症反应或异物/毒性反应，其力学性能应与天然骨组织高度匹配，并具有允许离子和营养物质扩散和（或）传输的机制。此外，支架还应能与宿主骨形成牢固结合，促进动态骨生长、血管长入以及支架自身的生物降解。尽管可生物降解聚合物支架在组织长入方面已显示出一定进展，但其在骨再生中的应用仍存在争议。

尽管付出了大量努力，这些高度有序的结构化合成构建体在克服被动细胞穿透障碍方面仍然潜力有限。大多数此类方法已导致 体外 组织向内生长，横截面小于几个 µ从外表面数毫米处，与宿主骨组织整合不完全，且仅见部分骨再生 体内^6,7先驱细胞由于缺乏在细胞定植开始前将其拉入内部的初始作用力，因此无法深入迁移到支架内部。因此，细胞定植仅发生在支架的周边区域，形成由外周向中心的阻碍。这导致氧气和营养物质向支架内部区域的扩散受到限制。⁸因此，显然支架的结构（孔径、孔隙率、连通性及渗透性）会影响物质在支架内的运输和扩散，对于实现细胞增殖与分化的均匀分布至关重要。^9,10尽管磷酸钙过去已被用于支架的制备，但不同的工艺和操作流程常常导致所得磷酸钙支架具有不同的结构。因此，制造工艺的选择对于决定实现成功骨组织再生所需的支架结构至关重要。

总之，骨组织工程仍存在两个主要缺陷需要解决：一是细胞在附着和定植之前向支架内最初的募集，二是物质流入和流出支架的质量。

方案

1. 聚氨酯（PU）海绵模板的制备

1. 使用聚氨酯（PU）海绵制备含有相互连通孔隙的羟基磷灰石模板。利用每块海绵为模板支柱的形成提供主要小梁结构，并在小梁内部形成微通道。
2. 将80 ppi（每英寸孔数）的海绵切割并修整成2个桥形，尺寸为高3.5 cm、长5 cm、宽1.5 cm。
   注意：可根据所需的主孔尺寸选择不同的尺寸和形状：100 ppi、80 ppi 和 60 ppi。
3. 使用150 ml 烧杯配制100 ml 4% (w/v) 的NaOH溶液；然后将制备好的海绵浸入其中，并反复挤压直至完全浸透。
4. 浸泡后，将装有海绵的烧杯放入超声波清洗仪（42 kHz）中。
5. 在无加热条件下对聚氨酯（PU）海绵进行15–20 min 的超声预处理，以改变其表面性质。
6. 用蒸馏水冲洗5–10 min。冲洗过程中反复挤压海绵并使其膨胀5至7次，以去除海绵内部残留的NaOH。
7. 用纸巾挤压海绵以去除多余水分，然后在60–80 °C的烘箱中干燥。

2. 涂层用羟基磷灰石（HA）浆料的制备

1. 配制HA浆料前，称量带有磁力搅拌子的烧杯重量。该数值将用于计算粉液比。
2. 称取10 g纳米级HA粉末。
3. 向50 ml 烧杯中加入20 ml 蒸馏水，在120–140 °C下加热，并使用电热板磁力搅拌器进行搅拌。
4. 在300–400 rpm搅拌条件下，按每份粉末加入0.3 g（3% w/w）聚乙烯醇（PVA）（分子量89,000–98,000）至蒸馏水中。
5. 持续搅拌直至PVA完全溶解。PVA完全溶解后，溶液应呈透明状态。
6. 关闭加热，继续在400–500 rpm搅拌条件下，按每份粉末加入0.1 g（1% w/w）羧甲基纤维素钠（CMC）（超低粘度）。PVA完全溶解后，溶液应呈透明状态。
7. 持续搅拌直至CMC完全溶解，并冷却至室温（RT）。
8. 在300–400 rpm搅拌条件下，按每份粉末加入0.3 g（3% w/w）丙烯酸铵聚合物分散剂，搅拌至完全溶解。
9. 在300–400 rpm搅拌条件下，按每份粉末加入0.2 g（2% w/w）甘油，搅拌至完全溶解。
10. 在600–900 rpm搅拌条件下，缓慢将HA粉末分散至溶液中，并继续搅拌5分钟。
11. 使用超声波破碎仪超声处理5 min ，以确保HA粉末的任何团聚体均被充分分散。
12. 在600–900 rpm搅拌条件下，向混合物中额外加入5 ml 蒸馏水，并在90–100 °C下加热。
13. 使用磁力搅拌器在90–100 °C、600–800 rpm条件下持续搅拌混合物，以蒸发水分。
14. 定期称量包括烧杯和混合物在内的总重量，直至达到1.75–1.8的粉液比。
15. 粉液比的计算方法：将粉末重量除以混合物总重量（2.14），即粉末、试剂和水的总重减去烧杯和搅拌子的重量（2.1），再减去HA粉末重量（2.2）。
    注：例如：若A（含粉末、试剂和水的全部混合物）为49.05 g，B（含搅拌子的烧杯）为33.5 g，C（HA粉末）为10 g。
    C/(A-B-C) = 10/(49.05-33.5-10) = 1.80
16. 将浆料冷却至室温后再用于涂覆。

3. HA 涂层、干燥与烧结

1. 使用不锈钢刮刀将制备好的HA涂层浆料均匀涂覆在PU海绵上，直至浆料在整个PU海绵中均匀分布，并将其置于玻璃板上。
   注意：由于浆料黏度较高，在去除多余浆料后，部分孔隙可能仍会被浆料堵塞。
2. 为确保孔隙的连通性、均匀性及开放性，使用空气压缩机轻轻吹扫已涂覆HA的模板。该过程可确保PU海绵的内表面和外表面均被均匀涂覆。
   注意：若未能实现均匀涂层，HA涂层模板在烧结过程中可能发生坍塌，且由于机械强度较低，在操作过程中也可能出现裂纹。此外，均匀涂层对于在骨小梁内部形成微通道至关重要。
3. 将涂覆HA的模板在冷却条件（20–25 °C）下、轻柔通风环境中干燥至少5小时 。然而，应根据模板尺寸适当延长干燥时间。
   注意：干燥后，涂覆HA的模板在每个维度上通常会收缩约8%至10%。
4. 干燥完成后，将涂覆HA的模板放置于氧化铝坩埚中，随后放入高温炉中，并采用以下8步烧结程序：
   1. 以2 °C/min升温至230 °C。
   2. 以1 °C/min升温至280 °C。
   3. 以0.5 °C/min升温至400 °C。
   4. 以3 °C/min升温至600 °C，并在600 °C保温1小时。
   5. 以5 °C/min升温至1230 °C，并在1,230 °C保温3小时。
   6. 以5 °C/min冷却至室温。
      注意：烧结过程将使涂覆HA的海绵模板在每个维度上进一步收缩约22%–25%。

4. 细胞进入模板并定植

1. 在含有5% CO₂的湿润环境中，于37 °C下，使用由α-MEM组成、添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（链霉素和青霉素）的非成骨诱导培养基培养前成骨细胞MC3T3。
2. 将密度为2 × 10⁶的细胞悬液10 ml 加入6孔板中的单个孔内。
3. 将尺寸为3 cm × 4 cm × 1 cm的桥形模板垂直放入6孔板中，使模板的一条腿置于含有细胞悬液的孔中，另一条腿放入相邻的空孔中。
4. 让模板吸收细胞悬液10分钟。
5. 随后向最初加入细胞悬液的孔中添加5 ml 培养基。
6. 每2至3天更换两个孔中的培养基，持续7天。
7. 通过苏木精-伊红染色法评估细胞迁移能力¹¹。
   1. 将细胞与支架浸入100%乙醇中固定20–30分钟。
   2. 用苏木精染色1–2分钟。
   3. 用蒸馏水冲洗1–2分钟，重复两次。
   4. 依次浸入70%、95%和100%乙醇中各1–2分钟进行脱水。
   5. 用伊红染色20–30秒。
   6. 用蒸馏水冲洗12分钟，重复两次。
   7. 依次浸入70%、80%、90%和100%乙醇中各1–2分钟进行脱水。
   8. 将支架包埋于丙烯酸树脂中，用于切片和成像。
8. 在第3天和第7天，采用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）细胞活力检测法以及活/死细胞染色试剂盒（Live/dead cell staining kit MPTP）测定细胞活力¹¹。
   注：类骨模板制备流程的示意图见“代表性结果”部分。

结果

BMT的整体结构呈现出具有类似小梁骨内部结构的独特三维模板。BMT包含大孔、微通道和纳米孔。通过扫描电子显微镜（EVO-40；ZEISS）以及显微CT断层扫描，已证实其完全相互连通的大孔（平均尺寸为320 µm）、微通道（平均直径为50 µm）和纳米孔（平均尺寸为100 nm）具有清晰的构型。

图1展示了构建骨髓模拟物（BMT）的逐步详细方案。通过精确控制从聚氨酯（PU）海绵制备到烧结过程的各个步骤（P1–P7；图1），可实现以下特征：经羟基磷灰石（HA）涂层和干燥后形成高度致密且表面光滑的结构；获得形状和尺寸精确的三维模板；形成类似于松质骨的完全相互连通的多孔小梁网络；以及在每根小梁内部具有模拟骨内通道（如哈弗斯管和沃尔克曼管）的微通道（图2和图3）。此外，通过压缩强度测试测得其具有相对较高的机械强度（约3.8 MPa），与人松质骨相近。显微CT分析证实，其组织形态学参数与人腰椎松质骨高度相似¹²。通过计算模拟，在图4中展示了不同毛细管直径所表现出的不同强度的毛细作用。这些模拟结果表明，BMT在主要孔隙（300–400 µm）和微通道（25–70 µm）中的吸收速率将因直径不同而有所差异，较小的毛细管表现出更强的吸收能力。本实验结果如图5所示，验证了这一假设。

BMT 通过微通道结构的毛细作用表现出高效的液体吸收和保留能力；使用亚甲蓝染料作为流体介质以方便追踪流动过程（图5）。根据计算机模拟结果，具有这些结构的 BMT 可在 10 秒内吸收并保留细胞悬液，最大传输距离达 8.5 cm。由于内部结构引发的强毛细作用，染色介质在 1 分 40 秒内即到达尺寸为 3 cm（高）× 4 cm（长）× 1 cm（宽）的桥状模板的另一端。此外，观察到细胞主动迁移并整合进入 BMT 的现象（图6）。随后，细胞均匀迁移与附着导致细胞增殖和基质形成显著增强，并呈现均匀分布的结构。此外，在 BMT 被细胞悬液完全饱和后，立即验证了细胞通过 BMT 实现长距离（约 10 cm）迁移的能力。接种的细胞在暴露于空气中且未浸没于培养基中的模板区域仍能存活。在本实验中，培养基仅通过与支架腿部接触的孔提供。微通道表现出的毛细作用使得新鲜培养基能够输送至支架顶部的桥接部分。培养 3 天后，模板区域已被快速增殖的细胞占据。培养 7 天后，每根小梁均被细胞外基质包裹，并嵌入有细胞¹³。

图1. 从聚氨酯（PU）海绵预处理（P1）到最终热处理（P7）的类骨模板整体制造流程。 在P7之后保持精确的烧结程序对于获得理想的机械强度至关重要。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 代表性体视显微镜（AmScope；SM-2TZ-M）图像（×4）：80 ppi 尺寸的聚氨酯海绵（左）、涂覆并干燥后的 HA-BMT（中）以及烧结后的 BMT（右）。（尺寸：高 3 cm × 长 4 cm × 宽 1 cm）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 生物模板的扫描电镜（SEM）与显微CT图像： (A) 生物模板的整体图像，(B, C, D) 微通道的图像。为了更清晰地显示小梁中的微通道结构，对模板进行了颗粒化处理。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 不同通道直径下毛细作用的计算模拟结果。 在相同时间（0.4 ms）内，最大毛细管（d=300 µm：代表主孔）中的介质（蓝色）上升高度为 0.16 mm，而最小毛细管（d=30 µm：代表微通道）中的介质上升高度达到 0.415 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 图像显示了基于不同尺寸主孔隙和微通道的毛细作用吸收能力的差异（主孔隙尺寸指平均直径：60 ppi ≈ 470 µm，80 ppi ≈ 320 µm，100 ppi ≈ 200 µm）。 黄线表示由主孔隙与微通道共同作用引发的毛细现象。红线表示主要由各支柱内部微通道引发的毛细作用。如图（F）所示，100 ppi 模板引发的毛细作用最强，在浸入后39秒内即实现模板的完全饱和。随后对80 ppi和60 ppi模板进行了测试。分别为：(B) 0秒，(C) 0.5秒，(D) 1.5秒，(E) 17.0秒，(F) 39.0秒，(G) 50.0秒，以及(H) 浸入后1分18秒。（模板尺寸：1 cm × 1 cm × 4 cm，呈长方体形）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 细胞从接种孔（第I部分）通过毛细作用诱导的生物源性模板迁移至未接种孔（第V部分）的过程。 初始接种的细胞在模板完全饱和后立即到达未接种区域（第V部分）的末端。培养3天后，细胞在整个模板范围内形成明显融合。培养7天后，细胞群体内部出现了时空有序的胶原基质形成（H&E染色）。（模板尺寸：高3 cm × 长4 cm × 宽1 cm）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

成功的骨再生及大段临界尺寸骨缺损的功能重建需要一种包含细胞、生长因子、营养物质等多种组分的复合支架模板。在这些影响因素中，具有解剖学适配性的生物学特性至关重要。为实现生物学功能，该支架模板必须具备生物相容性、骨传导性、足够的力学完整性、较大的比表面积、适宜的表面形貌，以及支持氧气和营养物质传输的通道。在细胞层面，以下特征对于大段骨缺损的功能重建尤为关键：促进细胞向支架内部渗透（主动募集）、细胞在支架内均匀分布（滞留）、快速增殖与高存活率（定植）。最后，大量细胞外基质的形成以及基因表达的启动，对于快速血管化和成骨等关键生物学过程至关重要。

人们已提出多种不同类型的合成替代物用于取代自体/异体骨移植材料。然而，目前的支架结构缺乏包含微通道和纳米孔的内部微环境，因此无法主动促进细胞向大于10 mm的合成替代物内部深层渗透、分布和定植。它们未能为先锋细胞提供有效的物理引导，使其无法高效、快速且均匀地迁移到骨支架的深层区域。相反，细胞仅通过有限的被动募集方式进入支架，导致细胞在支架外层与内层之间的分布不均。这不仅加剧了细胞难以到达支架核心区域的初始难题，还阻碍了营养物质的输送以及支架两端细胞之间的相互通讯。这种不均衡的细胞募集与定植最终导致细胞死亡，并在支架植入体内后造成骨组织生长不完全^14,15。

因此，我们引入了毛细作用这一概念，将其作为解决这些障碍的主要物理信号。我们已在骨髓模拟物（BMT）中精心设计了微通道，以诱导产生毛细作用，该作用将提供主要的牵引力，主动募集细胞深入骨髓模拟物内部。

聚氨酯海绵涂层技术具有若干独特特性。首先，该方法能够简便地制备出结构良好且可控的多孔小梁结构，这些结构本身取决于预先设定的模板结构。即， 每英寸80孔的模板适用于300–400 µm的孔径。这对于优化成骨细胞浸润的孔隙尺寸至关重要¹⁵其次，该技术能够构建相互连通的微通道，这些微通道在启动细胞重定位过程中发挥重要作用。¹¹第三，使用PU海绵在制备模板的定制形状和尺寸方面几乎不受限制。制作者可使用剪刀制作简单形状，也可采用计算机控制的激光切割技术加工复杂几何结构。利用这些精确可控的技术，我们制备了BMT。选择HA作为起始材料，是因其具有良好的生物相容性和骨传导能力。¹⁷.

在本研究中，有几个关键步骤需要特别注意。在制备羟基磷灰石（HA）浆料时，若温度过高而搅拌速度过低，HA浆料会黏附在烧杯底部边缘并干燥。在涂层过程结束后吹去多余HA浆料时，若气压过高，可能导致BMT表面产生裂纹。因此，应保持较低的气压，仅用于吹出多余的HA浆料。最后，烧结过程的第二步和第三步最为关键（以1 °C/min升温至280 °C，再以0.5 °C/min升温至400 °C）。在此温度范围内，聚氨酯（PU）海绵将完全燃尽，同时HA逐渐致密化。若未严格遵循该程序，烧结后的BMT可能发生塌陷或碎裂。

本研究中描述的骨髓支架（BMT）具有多项优势。首先，相互连通的大孔（300–400 µm）模拟了人松质骨的结构，有利于骨髓的顺畅流动。其次，每个骨小梁隔室内均包含微通道（25–50 µm），可通过毛细作用加速骨细胞的初始进入。如计算模拟所示¹³，若支架仅具有300 µm的孔（主孔）而无微通道，则毛细作用不足以使骨髓完全浸润支架，这一问题在需要大尺寸支架的大面积骨缺损修复中尤为明显。微米级通道表现出高效的液体吸收能力，因此我们预期微通道在本研究中主要负责毛细作用。第三，我们的BMT在设计上包含 strategically 分布的纳米孔。文献数据表明，细胞对纳米级结构特别敏感^18,19；因此，我们预期微通道壁上的纳米孔有助于增强细胞附着。松质骨隔室表面的纳米级孔隙（100–400 nm）使固定化的细胞得以锚定。总体而言，这三种内部结构的协同作用显著增强了细胞在整个支架内的迁移与黏附。然而，该制备方案仍存在一些局限性，且制备理想BMT的关键步骤较为严格。例如，由于在涂覆过程中难以维持均匀的黏度，通常需要制备大量羟基磷灰石（HA）浆料。此外，由于涂覆操作时间的限制，支架体积难以超过5 cm³。涂覆层的厚度至关重要，但其控制程度往往依赖于操作者的技术水平。

本研究的结果表明，能够吸收并滞留细胞的BMT材料相较于传统的异体（或合成）支架具有潜在优势。目前正考虑开展一项前瞻性研究，以验证BMT在促进成骨和/或血管生成以及骨相关生长因子表达方面的益处。因此，我们认为，我们所特有的BMT支架可克服合成结构中骨髓浸润不足以及大段骨缺损中骨再生不完全等主要障碍。

本研究的最终目标是通过消除对耗时且耗力的骨髓基质细胞分离与扩增过程的需求，简化当前在大段骨缺损中进行骨组织工程修复与功能重建的研究范式。最终，我们旨在利用具有解剖适配性的三维结构，其包含微通道和纳米孔，可促进细胞快速吸收、均匀分布及定植，从而实现骨组织的有效重建。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚氨酯海绵	Plastifoam	PU-3215
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	167176
羟基磷灰石粉末	Ossgen
聚乙烯醇	Sigma-Aldrich	341584
羧甲基纤维素钠盐	Sigma-Aldrich	360384
丙烯酸铵聚合物	Vanderbilt	DARVAN 821A
甘油	Sigma-Aldrich	G2289