用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

摘要

细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。

摘要

细胞迁移在人类生命发育过程中具有重要意义。当细胞迁移时，会产生力学力并将这些力传递到周围环境，从而导致细胞的移动和迁移。为了理解能够改变或影响细胞迁移的机制，可以对这些力学力进行研究。理论上，阐明细胞迁移背后的基本机制和力学因素，有望为疾病治疗和促进细胞移植提供有效策略。然而，目前开发的现代趋化性小室通常局限于二维（2D）环境，且具有复杂的扩散梯度，使得实验结果难以解释。为此，本文介绍并描述了一种用于趋化性研究的直视型小室，该装置能够在三维（3D）环境中克服现有趋化性小室的障碍，实现对细胞受力情况以及小室内特定浓度的测量，从而研究细胞的三维迁移行为。更重要的是，该方法能够成功模拟化学趋化因子在三维胶原基质中的扩散过程，并计算其在不同浓度胶原基质中的扩散系数，同时保持系统结构简单、操作便捷，适用于牵引力显微镜（TFM）和数字体相关（DVC）分析。

引言

细胞向浓度梯度方向迁移的偏好行为，即趋化性，在机体的病理和生理过程中起着重要作用。例如皮肤和黏膜伤口愈合¹、形态发生²、炎症反应³以及肿瘤生长^4,5。研究还表明，癌细胞可通过单个细胞迁移和集体细胞迁移两种策略进行移动⁶。此外，扩散不稳定性机制可促使单个或成簇的细胞从肿瘤组织/物体中分离，并向营养源迁移，从而侵入更广泛的区域和组织⁷。

此外，由于黏附分子的作用不同，已在研究中发现多种迁移机制在二维（2D）和三维（3D）环境中均可发挥作用⁸。因此，转向具有生理相关性的体外（in vitro）检测方法，以可测量且简便的方式研究细胞运动性，对于理解细胞运动现象具有重要意义⁹。然而，由于细胞迁移分析存在困难，全面且可量化的趋化性检测通常需要依赖耗时且繁琐的方法，这些方法建立在无偏细胞运动性测量和物质输运现象模型的基础之上。

过去研究细胞趋化性的实验方法包括Boyden小室¹⁰和琼脂糖下趋化试验¹¹。然而，在这些早期实验中，细胞迁移实验并未对细胞运动的时间过程进行监测。更重要的是，实验所使用的浓度梯度并不明确或未被充分理解，且信号维持时间通常不超过数小时。此外，早期的趋化性小室实验将细胞迁移限制在二维空间内，无法监测迁移的动力学过程¹²。以Boyden小室为例，其终点检测法无法使研究者直观观察细胞迁移过程，也不能直接区分趋化性（定向运动）与趋化激活性（随机运动）。此外，多种变量——如膜孔径大小和膜厚度的差异——使得该装置难以重复使用，并掩盖了细胞对趋化因子的迁移反应^13,14。

随着对微流控技术的新认识，研究人员已探索了新型腔室和微装置，用于在间质流条件或趋化作用下研究细胞运动^15,16。在这些新型装置中，引入并研究了新的细胞参数，例如剪切应力对细胞的影响^17,18。然而，以往和当前的微流控趋化腔室将细胞迁移研究局限于二维基底，这是一个重要的局限，因为许多生物过程（包括肿瘤细胞侵袭与转移以及免疫细胞迁移）均涉及三维迁移。

已有研究报道了直接观察室——其中趋化因子溶液与含有细胞的三维凝胶直接接触^19,20。这类观察室包含两个并列的腔室，一个含有趋化因子，另一个含有细胞，两者在水平方向上并排连接²¹，或呈同心环状排列²²。这些系统的设计方向正确，但无法长时间维持趋化迁移系统的稳定状态。

此外，研究人员还研究了透析池中胶原膜的扩散性，以及在静水压力作用下示踪分子在胶原样品中的扩散过程^23-25。一些在胶原凝胶中进行的扩散实验依赖于利用磁场和化学掺杂对凝胶进行物理和化学修饰²⁶。一种常用的模拟胶原组织中扩散性的方法是连续点光漂白荧光成像法。该方法揭示了在取向胶原组织中大分子扩散系数的各向异性。然而，光漂白技术此前仅应用于关节软骨，而未用于胶原基质。尽管两者相似，但仍需针对胶原凝胶的扩散系数开展专门的建模实验。更重要的是，现有系统并未采用可测量细胞力生成的方法。

遗憾的是，大多数系统似乎缺少理想系统所需的某些关键要素：无法实现细胞追踪，难以理解趋化因子通过基质形成的扩散梯度，缺乏相对简单且易于重复的设置，难以最小化细胞间相互作用，以及无法测量具有量化意义的空间维度参数。即、速度、力、比浓度）。Moghe 等²⁷ 提出了一种满足其中大部分要求的系统，该系统最初将细胞分散在凝胶中，而非集中在滤膜表面，但难以测量细胞产生的力。

为此，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有基于延时显微镜并结合图像分析技术以测量三维环境中细胞受力的检测方法中扩散室的现代局限性。本方案提供了一种简单而创新的方法，用于构建可研究不同细胞三维趋化性的简易三维扩散室。

方案

1. 3D模具设计与部件

1. 模具制备
   1. 操作前准备硅橡胶试剂盒、活细胞成像室、22 mm 玻璃盖玻片以及尺寸为 10.07 mm × 3.95 mm × 5.99 mm 的精密加工铝金属块。按照供应商说明，将盖玻片放入活细胞成像室的底座中，并组装其余部件，完成成像室的 molding 前准备。
   2. 接着，使用镊子将精密加工铝金属块放置在活细胞成像室腔体中央、盖玻片上方，然后静置备用。
   3. 根据制造商说明书混合硅橡胶溶液，制备 5 ml 弹性体。
   4. 使用一次性实验刮刀，将硅橡胶溶液倒入已组装好的活细胞成像室装置中，注意避免移动已放置的铝金属块。将整个装置置于实验台安全位置，过夜（O/N）固化。
   5. 次日早晨，按照制造商建议拆卸活细胞成像室，并用镊子取出模具。再用镊子小心地从模具中取出铝金属块。前往水槽，用去离子水冲洗模具，随后将模具置于纸巾上晾干。
   6. 待模具完全干燥后，使用 hobby 用美工刀在硅胶模具内部沿纵向两端间隔 2.34 mm 切出切口。确保模具在干燥安全处保存，直至准备进行实验系统构建。
2. 亲水性与疏水性玻璃盖玻片的制备
   1. 为使胶原基质能够附着于表面，需制备亲水性盖玻片：
      1. 使用一次性移液管量取 150 µl 3-aminopropyl-trimethoxysilane，倒入 50 ml 离心管中。再用另一支一次性移液管加入 30 ml 100% 乙醇至同一离心管中，盖紧管盖。涡旋混合 2 min，确保充分混匀。将溶液倒入玻璃培养皿中，静置备用。
      2. 在第二个培养皿中倒入 15 ml 100% 乙醇，静置备用（务必标记各培养皿）。
      3. 使用一支新的一次性移液管量取 30 ml 去离子水，倒入 50 ml 离心管中。再用另一支新移液管量取 1,875 µl 戊二醛，加入同一离心管中，盖紧管盖。涡旋混合 2 min，确保充分混匀。将混合液倒入第三个培养皿中，静置备用。
      4. 使用镊子取出一片 22 mm 圆形玻璃盖玻片，用一次性移液管吸取 100% 乙醇溶液冲洗其两面。
      5. 将冲洗后的盖玻片放入含 3-aminopropyl-trimethoxysilane 与 30 ml 100% 乙醇的溶液培养皿中，浸泡 5 min。
      6. 用镊子取出盖玻片，再次使用一次性移液管以 100% 乙醇溶液冲洗。
      7. 将冲洗后的盖玻片浸入含 1,875 µl 戊二醛与 30 ml 去离子水的混合液中，静置 30 min。
      8. 30 min 后，用镊子取出盖玻片，用去离子水冲洗，置于干燥纸巾上，室温过夜（O/N）干燥。
      9. 根据实验所需数量，使用相同配制的溶液重复上述盖玻片浸渍与转移操作。
   2. 按照给定方案制备疏水性盖玻片：
      1. 在 50 ml 离心管中加入 500 µl tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl、100 µl 乙酸和 19.4 ml 己烷，涡旋混合 2 min。将溶液倒入玻璃培养皿中，静置备用。
      2. 使用洁净镊子取出一片盖玻片，浸入已配制的混合溶液中 2 min。2 min 后，用镊子取出盖玻片，用一次性移液管以去离子水冲洗，置于干燥纸巾上，室温过夜（O/N）干燥。干燥后将盖玻片储存于塑料培养皿中，待用。
      3. 根据实验所需数量，使用相同配制的溶液重复上述盖玻片浸渍与转移操作。

2. 模具组装

1. 使用模具前，用一次性移液管在化学废液容器上方以90%乙醇冲洗模具。随后，将模具置于盛有去离子水的培养皿中，静置过夜。
2. 用镊子将模具从溶液中取出，放置在纸巾上晾干，然后开始模具组装。
3. 在模具晾干的同时，使用高精度金刚石刻划工具将方形亲水盖玻片切割成两块略大于3.95 mm × 5.99 mm的矩形。将每块切割好的矩形盖玻片滑入硅胶模具上的槽口中。
4. 将模具翻转倒置，用一次性移液管在硅胶模具底部涂抹真空脂。然后将模具翻回正面朝上，将模具底部压在圆形亲水玻璃盖玻片上，形成密封。
5. 戴上一次性手套，拿起组装好的模具，放入一次性培养皿中，再置于生物安全柜内。打开生物安全柜的紫外灯照射1小时，以在实验前对模具进行灭菌。

3. 胶原蛋白混合物与三维基质

1. 在制备胶原混合物之前，根据标准方案²⁸对细胞进行染色并为成像做好准备。
2. 在生物安全柜中，使用标准实验室技术与方案^29,30，将细胞培养基和趋化因子在15 ml离心管中混合至所需的趋化因子浓度。用移液器吸取5 ml特定浓度的细胞培养基-趋化因子混合液至另一15 ml离心管中，并将其放入预热的水浴中。
3. 使用移液器吸取5 ml纯细胞培养基至第二个15 ml离心管中，并放入预热水浴中，以加热用于显微镜实验的溶液。
4. 在生物安全柜中，用移液器将30 µl 10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）加入微量离心管中。向同一微量离心管中加入6 µl 1 N氢氧化钠（NaOH），并涡旋振荡15秒。
5. 从冰箱中取出I型胶原（大鼠尾部来源）溶液，并使用标准实验室技术与方案²⁹转移至生物安全柜中。确保胶原仍保持低温状态。用移液器吸取168.3 µl胶原加入同一微量离心管中。
6. 接着，用移液器向同一微量离心管中加入18 µl黄色-绿色荧光羧基化修饰微球。将含有所有溶液的微量离心管涡旋振荡30秒。
7. 向微量离心管中加入77.7 µl所需浓度的细胞培养基-细胞混合液（细胞浓度约为2 × 10⁶ 个细胞/ml），并用移液器头混合20秒。根据需要，参照为添加荧光微球及维持细胞活力而定制的胶原混合物密度表（表1）调整基质密度。
8. 用移液器将300 µl胶原-细胞混合物加入已准备好的模具组件的中心孔（第2孔）中。将模具放置于一次性培养皿上，并转移至37 °C、5% CO₂的常规培养箱中孵育20分钟。
9. 从培养箱中取出装置，放回生物安全柜中。使用镊子夹住每个疏水性盖玻片的顶部，向上并远离模具方向拔出，移除两个疏水性盖玻片。
10. 将整个装置转移至目标显微镜下进行成像，以确认胶原模具的侧壁仍然平直，从而保证形成平面扩散梯度。
11. 在显微镜下操作，使用100 µl单通道移液器向第1孔中加入100 µl细胞培养基；随后，使用同一规格的移液器向第3孔中加入100 µl含有目标浓度趋化因子的细胞培养基。
12. 在向两孔中加入溶液后，立即开始成像。

4. 成像与扩散建模

1. 若要查找特定胶原蛋白密度的扩散系数以计算特定浓度，请遵循以下方案：
   1. 按照上述标题为“胶原蛋白混合物与三维基质”的方案操作，不制备含有目标趋化因子浓度的细胞培养基，而是使用标准计算方法和方案在15 ml离心管中配制5 µM的罗丹明溶液³⁰。
   2. 使用倒置显微镜搭载的共聚焦系统，通过氩离子激光器（488 nm）捕获荧光信号，对三维胶原基质进行成像。每2至3秒成像一次，持续长达7小时。
2. 扩散建模：根据下方所示的数学模型，编写计算软件代码，按以下通用步骤进行数据处理与分析。
   
   1. 将图像导入计算软件，按最大强度进行重缩放和归一化处理。将图像转换为灰度 colormap 以识别边缘。选择穿过图像中心的轴线，并分别选取中心右侧和左侧的区域。
   2. 利用计算软件代码，绘制归一化强度曲线，同时绘制真实强度曲线以及两者之间的差异。
   3. 接下来，输入拟合所需参数（浓度、时间与长度）。
   4. 绘制归一化浓度随时间变化的曲线，以及沿x轴的浓度分布曲线，并对数据进行多项式拟合。
   5. 利用计算软件代码计算扩散系数。

5. 实验测量

1. 回到扩散方程，重写该方程以求得系统内任意位置处的特定浓度，如下所示。
   
   其中：
   L = 胶原基质的长度
   x = 待研究的位置
   D = 扩散系数
   t = 经过的时间
2. 在趋化实验过程中，务必记录趋化因子加入系统的具体时间。一旦观察到细胞迁移运动，应确保进行共聚焦时间推移成像，并记录成像发生时的具体时间以及距边缘的位置。
3. 在数据分析过程中，将记录的经过时间、位置及特定细胞的扩散系数代入方程，以计算在扩散实验和细胞实验中胶原基质内任意点的归一化特定浓度。

6. 利用牵引力显微镜技术追踪细胞迁移

1. 使用 TFM/DVC 技术追踪细胞迁移，请遵循以下方案：
   1. 向 3 号孔中加入所需浓度的趋化因子后，启动倒置显微镜上配备的共聚焦系统对三维胶原基质进行成像，以寻找待观察的细胞。
   2. 一旦发现移动中的细胞，将其置于视野中央，并利用压电马达（用于 Z 轴成像），每 1 或 2 分钟采集一次图像。
   3. 为计算细胞产生的力和形变，编写计算程序，根据 TFM/DVC 方案³¹追踪荧光微珠的位移。

结果

该实验方法准确评估细胞迁移能力依赖于系统的良好构建。因此，必须仔细设计扩散系统模具，并严格按照图1所示，精准放置疏水性和亲水性盖玻片。如果系统设计合理，并在扩散建模阶段确保获得一条良好的线性起始线，则可以获得清晰的荧光图像（如图2所示），用于分析系统的扩散情况。

成功进行细胞趋化性分析的关键在于对扩散过程进行建模，并通过计算软件生成的代码求解通用扩散方程，以确定扩散系数和特定浓度方程。将图像导入计算软件并运行分析（图3）后，可评估扩散系数（表2）。图4展示了罗丹明在五种不同胶原蛋白浓度中扩散的曲线图。扩散曲线的形状符合传统线性扩散模型的特征。可以看出，罗丹明的扩散速率与胶原蛋白浓度呈反比关系——胶原蛋白浓度越低，扩散越快。这是可预期的结果，因为较低浓度的胶原蛋白具有更高的孔隙率。在1.5 mg/ml胶原蛋白浓度下的扩散曲线中出现的水平线（图4B），仅仅是示踪信号过度饱和所致。更重要...

讨论

成功进行有或无细胞的扩散实验最关键的步骤包括：正确组装模具；培养必要的手动技巧，以防止在取出疏水性盖玻片时造成损伤；确保找到一条非常理想的线性起始线，以准确计算扩散系数；正确计算胶原蛋白和趋化因子的实验浓度；正确使用活细胞成像系统，确保基质不会干燥；以及维持无菌、健康的细胞培养环境。

进行扩散实验时，必须确保扩散曲线符合传统线性扩散模型的形状（图4）。

在每个样品的不同x位置进行多次分析，可以计算出罗丹明在各种浓度胶原中的平均扩散系数，如表2所示。这些结果与先前的研究一致：随着胶原浓度降低，胶原凝胶的扩散系数减小，这是由于基质孔隙率增加所致。

根据稳态下的扩散模型方程，预期在 x 值方向上浓度呈线性分布。通过对各数据点拟合线性函数，可以看出它们实际上均呈线性关系。三种胶原蛋白浓度条件下最佳拟合直线的线性趋势线拟合 R² 值均达到或高于 0.92。所有外推图中残差的范数为 0.0227...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	双组分混合物，混合比例为10:1
活细胞成像腔室	Live Cell Instrument	CM-B18-1	适用于18 mm圆形盖玻片的CMB
22 mm玻璃盖玻片	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. 盖玻片 22 mm 1.5
机加工铝金属立方体
hobby 用途刀具	X-Acto	X3201
3-(氨基丙基)三甲氧基硅烷	Sigma-Aldrich	281778-5ML
戊二醛	Polysciences, Inc	00216A-10	戊二醛，电镜级，8%
50 ml 离心管	Fisher Scientific	14-432-22	标准落地式和台式离心机
玻璃培养皿	Fisher Scientific	08-747A	可重复使用培养皿：完整型（60 x 15 mm）
镊子	Fisher Scientific	22-327-379	尖头镊子
盖玻片	Fisher Scientific	12-518-105A	矩形；30 x 22 mm；厚度1号
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基	Gelest	SIT8174.0
乙酸	Sigma-Aldrich	320099	乙酸ACS试剂，≥99.7%
己烷	Sigma-Aldrich	296090	无水，95%
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof，适用于分子生物学
高精度金刚石划线工具	Lunzer	PV-081-3	直头延长尖划针，直径.020"（.50 mm），尖端长度.200"（5.0 mm）
真空润滑脂	Dow Corning	14-635-5C	高真空润滑脂
15 ml 离心管	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml 锥形离心管，具有疏水性、生物惰性表面
10倍磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M 氯化钠，0.027 M 氯化钾，和 0.119 M 磷酸盐缓冲液
1 N 氢氧化钠	Sigma-Aldrich	38215	氢氧化钠浓缩液
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	BD Biosciences	354236	大鼠尾部
微量离心管	Fisher Scientific	02-681-332	体积：2.0 ml； 外径 x 长度：13 x 40 mm； 无菌，单个包装
[header]
羧基修饰微球	Invitrogen	F-8813	羧基修饰微球，0.5 µm，黄绿色荧光（505/515），2% 固含量
罗丹明	Sigma-Aldrich	83689	用于荧光的罗丹明B