Sulfidogenic污泥海洋沉积物和三氯乙烯减少在上流式厌氧污泥床反应器开发

摘要

微生物硫酸盐还原是环境生物技术中非常重要的过程。除其他因素外，产硫反应器的成功还取决于污泥的微生物组成。在这里，我们提出了一种方案，用于在 UASB 反应器中从热液喷口沉积物中开发产硫化污泥，用于还原脱氯目的。

摘要

微生物硫酸盐还原的重要性取决于它在环境生物技术中提供的各种应用。工程硫酸盐还原用于工业废水处理，以去除高浓度的硫酸盐以及化学需氧量 （COD） 和重金属。该工艺最常见的方法是使用厌氧生物反应器，其中通过使主要产甲烷颗粒污泥适应产硫而获得产硫污泥。这个过程可能需要很长时间，并且由于污泥中存在产甲烷菌，并不总是能消除对基质的竞争。在这项工作中，我们提出了一种获得产硫化污泥的新方法，其中热液喷口沉积物是微生物的原始来源。在硫酸盐和挥发性脂肪酸存在下形成的微生物群落足够宽，可以长时间维持硫酸盐还原，而不会因硫化物而表现出抑制。

该协议描述了在上流式厌氧污泥床 （UASB） 类型的反应器中从沉积物中产生污泥的过程。此外，该协议还提出了证明污泥通过还原脱氯去除三氯乙烯 （TCE） 等剧毒有机污染物模型的能力的程序。该方案分为三个阶段：（1） 污泥的形成及其在 UASB 中的硫酸盐还原活性的测定，（2） 通过污泥去除 TCE 的实验，以及 （3） TCE 还原后污泥中微生物的鉴定。虽然在这种情况下沉积物是从位于墨西哥的地点取来的，但如果采用不同的沉积物来源，使用该程序生成硫化污泥可能会奏效，因为海洋沉积物是微生物的天然库，可能富含硫酸盐还原细菌。

引言

一对环境生物技术的最重要的贡献是生物反应器，其中使用（接种物）的污泥能够硫酸盐还原条件下进行的设计。硫酸盐还原（SR）允许含有除同时除去COD，重金属和有机污染物，这一事实使SR中的污泥^1的期望特性的高浓度硫酸的废水流的治疗。废水污染硫酸的一些例子来自制革，造纸，医药，化工等制造行业^1。然而，大多数的文献是指sulfidogenic污泥时产甲烷颗粒污泥已适应sulfidogenesis ^2。这种适应是通过操纵COD / _^SO 4 2-比在生物反应器和添加的化学品，以抑制在污泥^2,3甲烷通常达到。除了长的时间是m唉要求sulfidogenic颗粒的形成中，甲烷和硫酸盐还原和污泥的高浓度硫化物的公差之间的竞争，是一些主要问题，如果是从适应获得在生物反应器中使用的sulfidogenic污泥可能出现主要产甲烷污泥硫酸盐还原条件。在这项工作中，我们描述的方法在上流式厌氧污泥床反应器（UASB），以获得从热液喷口沉积物（蓬美达，纳亚里特，墨西哥）主要为sulfidogenic污泥，然后我们评估它的硫酸盐还原活性随着时间的推移，进行了一个实验以评估其对还原脱氯的应用。被选择的沉积物的位置，因为它已被报道，在该网站有形成硫化物由于通过微生物群落栖息该特定地方⁴呈现的硫酸盐还原活性。

有SEVER人的优势获得沉积物这sulfidogenic污泥在适应产甲烷颗粒污泥sulfidogenesis。其中的一些优点是:（1）这是没有必要以形成颗粒的生物反应器进行操作，（2）将污泥容忍较高浓度硫化物的相比更为UASB与适于甲烷污泥操作，和（3）有用即使乙酸的用量为包含在培养基中以促进污泥的形成挥发性脂肪酸的混合物甲烷为基片没有竞争。

此步骤，以促进sulfidogenesis因为海洋沉积物有各种各样，如硫酸盐还原菌，发酵菌和细菌脱卤，只是仅举几例^5,6微生物的天然泳池。财团从海洋沉积物开发利用这一协议的类型可能会出现在硫酸盐还原，因此，高的工作效率 ulfate还原活性随着时间的推移和更高的耐受性硫化物的浓度比报告为有毒的产甲烷菌和硫酸盐还原菌更高。另一方面，它很可能是该脱卤能力由以下此处协议提议的，但它可以取决于原始微生物群落也示于沉积物。这种假设是基于这样还原脱氯可以通过呼吸或共代谢发生的事实完成的，这两个条件，可能会在海洋微生物群落⁷得到提升。沉积物以获得污泥的培养物通过使用乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐的混合物作为底物，因为这些挥发性脂肪酸所使用的几株硫酸盐还原细菌的进行。这些酸也经常发现在海洋沉积物碳化合物的种类，根据在文献中关于碳质材料在海沉积物^5,6-若干报告。

内容">最后，一些被发现在地下水和其他水体，世界各地的最有毒化合物是氯化溶剂，如三氯乙烯（TCE）或全氯乙烯（PCE）。这些化合物是有毒的，不仅对人，而是还对微生物，特别是三氯乙烯，这仍然是在美国被认为是优先的污染物由环境保护局^8。在这项工作中，我们提出，是在一个实验，其中sulfidogenic污泥减少TCE浓度的其能力进行测试系列报道的甲烷条件下^，9,10含氯化合物生物降解性。值得一提的是，大多数的含氯化合物的生物降解研究已经甲烷条件^9,10下进行的。我们认为，实验TCE在该协议提出的是一个的污泥的潜在应用很好的例子。该实验的目的是到e计价污泥的三氯乙烯和对硫酸盐还原活性的三氯乙烯效果的耐受性。考虑到最上氯化化合物的生物降解研究的是甲烷条件下进行的，该协议建议一个油泥的产生可以被用来同时:（1）除去硫酸，（2）除去COD和（3）除去氯化合物。进一步的步骤可以是评价对同时除去三氯乙烯和重金属的污泥（除了硫酸盐和COD），这是不能被甲烷条件下评价两个条件。

方案

图1.方案协议的步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

1.收集海洋沉积物对污泥的形成

1. 确定一个平易近人海底区域或者靠近热液喷口（由于硫化物的存在下，这可能表明较高的硫酸盐还原活性），或者一个区域，其中的有机物质碎片是可检测的。
2. 对于这项工作的目的，需要约3或4千克沉积物和漏水关样品。是在暗塑料袋样品。无需进行制冷。
3. 一旦在实验室中，保持与样品袋在冰箱，如果他们不打算立即使用。对于这项工作，桑普的目的LES可在冰箱几个星期或几个月使用它们之前。
4. 取沉积物样品（即1或2公斤）的很大一部分，并使用适当的筛目（0.2厘米）从沉积物中的大碎片含碳材料可被发现或一些岩石可能存在消除。
   注意:在这种情况下0.20厘米直径（在0.0767）的网眼被用于，但它可以根据样品中的颗粒的尺寸是不同的尺寸。
   1. 传递沉积物通过网后，混合选择，以促进该部分是均匀的部分。
   2. 取分离更小的样品（即，2至3克）通过以下的标准方法^11，以确定挥发性悬浮固体（VSS）的内容。
      注: 参见图2步骤1.2至1.4。

图2.照片中的沉积物样品。（一）沉积物样品刚过上当受骗。（B）沉积物样品通过网格后。（C）样品采取称重之前，挥发性悬浮固体（VSS）的决心。在培养皿中不需要进行消毒。 请点击此处查看该图的放大版本。

2.生物反应器设置

1. 对于这项工作的目的，使用的UASB反应器中的玻璃带3 L的总工作容积或者，使用1或2升容积玻璃反应器中。
2. 基于所述沉积物的VSS含量计算沉降物的数量被用作接种物，得到5克的VSS在1升
3. 考虑到，如果沉积物计算后的量太大时，生物反应器的再约25％至30％的体积应当由沉积物代替占据。
   1. 记录，因为它的VSS内容将改变时，微生物群落富集的生物反应器。需要在VSS含量为硫酸盐的计算降低生物反应器中的活性。
4. 确保生物反应器中的基础培养基和缓冲溶液的最终浓度是类似于所报告的格雷罗哈斯等 。 ^{（2014）12。}
   1. 确保沉积物，基本培养基，缓冲溶液和挥发性脂肪酸的最终体积是等于反应器中的最终工作体积。基础培养基配方^12含有适当浓度的痕量金属和维生素溶液。
   2. 制备基础培养基和缓冲液的储备溶液在适当的浓度为反应器所用的工作体积（即，2，3或4倍比报道的步骤2.4更浓缩的），以确保当它被稀释，它是在报告的格雷罗-巴拉哈斯等的浓度。 （2014年）^12）。
      注意:储备溶液的基础培养基是总是必要的，然而，缓冲溶液时，才需要在启动时。它没有必要在此时间后添加缓冲溶液。
   3. 制备的挥发性脂肪酸的原液:在2.5乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐:1:1比例的COD。考虑到为计算的乙酸钠包括在基础培养基。在反应器中的最终的COD浓度必须2.7克/升。
      注意:准备这个解决方案在通风橱中。穿腈手套和护目镜此溶液的制备。考虑到硫酸与挥发性脂肪酸的反应， 示于图3的化学计量。
   4. 制备的硫酸钠在适当浓度的储备溶液（ _用 Na 2 SO _4），可提供到反应器中的4000毫克/升的硫酸根离子^_（SO 4 2-）的终浓度。可替代地，包括第硫酸盐在基础培养基所需的，而不是只要由一个储液加入其作为最终硫酸盐电子量^_（SO 4 2-）的浓度是合适的。
5. 放置在反应器中与基础培养基的一部分混合，沉积物，以确保它们到达反应器的底部。
   1. 添加与挥发性脂肪酸溶液和硫酸溶液混合的基础培养基和缓冲溶液的其余部分。确保的挥发性脂肪酸的溶液倒入液体。注意:进行这个步骤在通风橱中。
   2. 设置的连接和该反应器的管道，以再循环泵。设定再循环流速为60毫升/分钟。在34°C在设定温度室的生物反应器。定期检查温度变化小（ 即 34±1.7°C）
   3. 设置连接到气体位移列。
      注: 参见图4的步骤2.1至2.5。

图3.化学计量硫酸盐还原VFA（乙酸，丙酸和丁酸）的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4. UASB反应器。（A）初始时间。（B）连续政权在300天的运行中。 请点击此处查看该图的放大版本。

3.操作反应器的促进Sulfidogenesis微生物和生长

注意:允许用于接种物消​​耗购买Volatile脂肪酸和硫酸。为了这个目的，等待一个星期进行为硫酸盐，硫化物和COD消耗首次分析。

1. 后孵育1周采取的5至7毫升液体的样品进行分析，化学需氧量，硫酸盐和硫化物含量和pH下述标准方法^11,13。
   1. 通过以下亚甲蓝方法¹³分析硫化物在液体分光光度计（在670纳米的波长（λ））。
      1. 放置5毫升乙酸锌溶液（2％w / w的）在25毫升容量瓶中，加迅速加入200μl样品到醋酸锌溶液。
      2. 加入2.5毫升N，N-二甲基对苯二胺草酸（DMP）溶液（0.2％w / w的20％ _的 H 2 SO _4）和125微升铁（III）硫酸铵溶液（10％重量/的瓦特在_2％的H 2 _SO 4）并完成与蒸馏水25毫升的容量瓶中。等待30分钟的反应发生，时间在其中蓝色颜色是稳定的^。13。
         注:等待至少15分钟，但不超过60分钟，以测试样品中的分光光度计。进行在分光光度计蓝色最终溶液的读数。
   2. 根据标准方法¹¹分析干燥。这里，通过使用比浊法量化硫酸硫酸钡。
      1. 放置5毫升的调理溶液（盐酸盐酸1:1）在25毫升容量瓶中，加入1毫升先前离心样品（在11320×g）中，完成将25ml量瓶中，用蒸馏水和加1克氯化钡。
      2. 混合在一涡旋1分钟的溶液中。等待4分钟的硫酸钡，以形成与读取在分光光度计的样品在420纳米¹¹一个波长（λ）。
   3. 根据标准方法分析¹¹的COD。或者，使用COD Determina的化套件。
      1. 在此之前的COD测定，彻底离心样品（在11320 XG）除去剩余的硫化物，可能会干扰测定。如果需要的话，离心两次:第一次立即服用样品和第二时间之后等待6或8小时，然后进行分析的COD。
      2. 加2ml样品与COD测定试剂盒的反应小瓶中，密封该小瓶并均化通过温和搅拌该混合物。制备一个空白加入2毫升蒸馏水至另一个反应瓶中并均化混合物。
      3. 放置在消化反应器中的小瓶，在150℃进行2小时。取出小瓶，让他们在黑暗中冷却下来。采取在分光光度计小瓶的读数在620纳米的波长。
   4. 获得从气体置换柱的气体体积。
2. 最多等待另一个5到7天，直到硫酸的消耗。硫酸和COD必须在被消耗前pproximately 85％至90％，开始一个新的补料分批。
3. 一旦硫酸（和COD）的消耗，完全重复步骤2.4。供应新鲜培养基和营养物的新为每批次。
4. 重复步骤3.1和3.2。在这一点上每批次之间应该7天和10天持续。
5. 当3〜4批已全部完成，重复步骤2.4，但会增加COD浓度为4克/升。
6. 重复步骤3.1和3.2的步骤。
   1. 重复步骤3.3，但增加的COD浓度，以6克/升。
   2. 重复3.6和3.6.1逐渐增加COD浓度，直到它为10克/升。
      注意:请呈现硫酸浓度（mg / L）与时间（d）该曲线图。
7. 当硫酸盐消耗量是80％以上，不到24小时，出现这种情况的一个多星期，开关在反应器的操作，以连续模式。对于连续模式中设置的水力停留时间（HRT），在24小时，并保持硫酸盐浓度在4克/升和COD的以10克/升。
   注:随着时间的推移硫酸盐消费量应 速度更快。

4.硫酸盐还原活性测试

1. 在此之前，测试确保连续制度下，生物反应器呈现在硫酸盐浓度剩余小于10％的变化。
2. 在任何给定的一天后，其中HRT周期和行为的步骤2.4停止反应器。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
3. 一旦在生物反应器被供给，需要5到7 ml的样品的液体和化学需氧量，硫酸盐，硫化物（步骤3.1）和pH每小时执行分析。记录产生的气体量。
4. 计算硫酸根据文献¹⁴还原活性。
   
   

SRA =硫酸盐还原活性（毫克COD-H _{2 S）/} gVSS量* D

米_H 2 2 S

VSS =挥发性悬浮固体浓度

T =时间（D或小时）

5. 作出这样的显示硫酸盐消耗量与硫化物浓度的百分比随时间以mg / L对应的图形。使该显示的COD消耗随时间的百分比的曲线图。制作，显示随着时间的推移pH值变化的曲线图。

5，三氯乙烯（TCE）还原试验

1. 在此之前，测试确保生物反应器正在连续制度下，并提出在硫酸盐浓度剩余小于10％的变化。不启动此测试如果硫酸盐还原生物反应器中低于90％。
2. 制备的三氯乙烯考虑到在生物反应器的液相中该化合物的最终浓度必须为300微米的储备液（TCE）。考虑partitioniNG使用Henry's法因次常数（H'）的TCE在34°C的化合物的顶空。 H'at 34℃，TCE为0.4722。
   
   注意:准备这个解决方案在通风柜和戴手套和护目镜。
   1. 例如，对于一个5000微米原液，计算如下:
      
      TCE气相浓度=（0.4722）*（5000）= 2139微米。包括这个浓度，因为这一数额TCE将是在顶空原液的制备。
      然后，在原液中的液体（水），实际的TCE的浓度将是:5000 + 2139 = 7139μM。 TCE密度=1.43克/毫升。转换7139微米为mg，然后通过使用三氯乙烯的密度计算的TCE为原液的体积。
      注:的TCE原液米浓度唉低于5000微米， 即 3000或1000微米，这取决于如何将该溶液的体积太大，根据其液相体积可以被传递至生物反应器。
3. 制备标准曲线，在气相色谱仪的三氯乙烯， 顺 -1,2-二氯乙烯， 反式 -1,2-二氯乙烯，氯乙烯和乙烯。通过以下在5.2的三氯乙烯原液描述的相同方法制备的顺式 -1,2-二氯乙烯，反式-1,2-二氯乙烯的标准曲线从这些化合物的贮备液。通过从标准（气瓶）稀释每种气体的浓度制备氯乙烯和乙烯的标准曲线。
   1. 制备这些化合物的标准曲线的范围内的20至300微米。使用报告格雷罗-巴拉哈斯等人的方法 。 ^{（2011）15，用于}这些化合物在气相色谱仪的分析。
      注意:这些准备站在通风柜ARD解决方案，并戴上手套和护目镜。
4. 在任何给定的一天后，其中HRT周期和行为的步骤2.4停止反应器。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
5. 一旦在生物反应器被供给，直接添加到三氯乙烯中的液体从在5.2制备的原液的生物反应器，生物反应器中的液相中的最终的TCE浓度必须为300μm。水力停留时间设定为12小时。
   1. 在一个HRT周期结束取液（500〜1000微升）和行为分析的COD，硫酸盐和硫化物的样品（步骤3.1.1，3.1.2和3.1.3）。取的顶部空间（100〜250微升）的样品，并进行分析，三氯乙烯，顺-1,2-二氯乙烯， 反式 -1,2-二氯乙烯，氯乙烯和乙烯在气相色谱仪。
6. 重复步骤2.4。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
7. 不要重复任何TCE还原试验，直到生物反应器中呈现超过900硫酸盐0％减少和较少的10％的变化两者，硫酸盐还原和硫酸中剩余的生物反应器。
8. 重复5.4，5.5和5.6两三次以上。
9. 取沉积物样品（0.5克）只需经过TCE减少测试完成后进行鉴定微生物。经过2或3 TCE减少测试执行此操作。

6.硫酸盐还原TCE实验后还原活性测试

1. 完全重复步骤4。

7.鉴定微生物

1. 取各得到大约0.5g污泥样品，并按照标准方法进行¹²总RNA提取。
2. 扩增16S rRNA基因用反转录，并进行聚合酶链反应（RT-PCR）扩增一个步骤^12。
3. 设计引物扩增或作为初始的方法使用那些在文学¹¹建议。按照amplif在文学¹² ication程序建议。
4. 构建的16S rRNA库。 PCR扩增子可以通过使用克隆杰¹¹被克隆。通常情况下，从各板（各菌落代表一个PCR产物）10个菌落可以克隆。根据在文献¹²提出的程序制备的质粒DNA进行测序。
5. 进行片段的测序。根据在文献中¹²建议的程序重新扩增大约1400 bp的对PCR外部产物与先前描述的方案进行PCR扩增（步骤7.4）和克隆。隔离来自大肠杆菌的质粒大肠杆菌菌落如文献¹²建议。不要进行部分程序进行测序应用M13通用引物^12。
6. 进行序列分析。通过使用Clustal X对齐的核苷酸序列，并在文本编辑器中手动调整。执行NCBI databas的BLAST搜索即^{（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）12。}
7. 得到的核苷酸序列的登录号。沉积下的对应登录号（即，JQ713915eJQ713925从扩增子序列^）12确定在EMBL核苷酸序列数据库（根银行/ EMBL / DDBJ） ​​克隆的核苷酸序列。

结果

的生物反应器中硫酸盐还原的典型行为示于图5。注意到，在硫酸操作减少第一周将是缓慢的是很重要的。然而慢，硫酸随时间的90％以上的消耗表明接种物正在开发的微生物群落能够减少干燥并因此，富含硫酸盐还原菌。图中的不同时期表明，硫酸盐还原反应增加其速度随时间。在开始时，批料用了20天的硫酸将减少（期间I）中，那么它的降低率正在增加，这需要大约10天减少进食硫酸盐（第二时期）。时期III中更少的变化在硫酸盐还原并且这实现了在平均10天，因为它被认为是在图5中 。在此期间后，硫酸盐的还原了的4天（周期Ⅳ）的平均和在期间V 4000毫克/升的硫酸被消耗在不到24小时。在生物反应器的性能进行了下连续模式设置经过200天的24小时停留时间。

图5.硫酸盐_^（SO 4 2-）的浓度随时间期间sulfidogenic泥形成生...

讨论

有sulfidogenesis的环境生物技术多个应用程序，硫酸盐还原细菌的代谢的最常用的应用程序在财团与发酵菌是在废水处理中的一个。 UASB反应器是主要的设计方法，以工业废水处理与硫酸盐高浓度之间。在这项工作中，我们提出了一个协议，以获得从海洋沉积物sulfidogenic污泥的UASB反应器。在协议中的关键步骤，以从海洋沉积物获得sulfidogenic污泥是:（1）促进沉积物样品的的同源被放置在反应器中，（2）进料的硫酸盐和挥发性脂肪酸的权利浓度（COD / SO _{⁴ 2-）}的比，（3）分析该硫酸盐，硫化物，COD和pH值周期性地，（4）刷新基础培养基，它包含痕量金属和维生素每一个批次开始时间。考虑到，sludg的发展是非常重要的ê在很大程度上取决于原始样品的微生物群落，在右侧质量平衡（硫酸和COD）。虽然这要花费时间硫酸盐还原活性的发展，生物反应器需要连续监测，以避免泄漏，事故，或颞精神不振可能会停止再循环泵或关闭温度控制。必须特别注意​​在硫化锌，硫酸和COD分析的性能支付。

一般海洋沉积物是各种各样的微生物的天然来源;它很可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三氯乙烯	sigma Aldrich	251402
cis-1,2-二氯特炔	sigma Aldrich
trans-1,2-二氯乙烯	sigma Aldrich	D-62209
氯乙烯 scotty 标准品	supelco		1,000 ppm v/v 在氮乙烯
scotty 标准	supelco		99% 纯度
泵	Masterflex		型号 7553-75
分光光度计	任何
微量离心机	任何
气密注射器	任何		100 和 200 微升
UASB 玻璃反应器	任何		在设计
中的气相色谱仪	任何		FID 检测器
毛细管柱 SPB-624	supelco
pH 计	任何
基础培养基试剂	任何
微量金属试剂	任何
维生素溶液试剂	任何
硫酸钠	任何
挥发性脂肪酸	任何
COD 测定试剂盒	HACH		范围 0-15,000 mg/L
TOPO-TA 克隆试剂盒 pCR®4.0	Invitrogen， 美国
. TM 小量制备试剂盒	Invitrogen，英国
Pure link TM 快速质粒小量制备试剂盒	Invitrogen