在此，我们通过用高度保守蛋白家族中各成员差异最大的区域免疫动物，随后通过预吸附去除交叉反应性抗体，从而选择性地靶向针对该家族中某一特定成员的抗体。
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本文内容
摘要
摘要
核受体亚家族4（NR4A）由3种相关蛋白组成，这些蛋白共享一个DNA结合域（DBD）和一个配体结合域（LBD）。核受体相关蛋白1（Nurr1或NR4A2）在多巴胺能系统的维持中发挥关键作用。与Nurr1基因相关的多巴胺功能障碍包括帕金森病、精神分裂症和躁郁症等。此外，最近的研究证据表明，Nurr1也在其他脑区如海马体中表达，并在学习和记忆过程中发挥重要作用。该家族的其他成员包括神经生长因子IB（Nur77或NR4A1）和神经元源性孤儿受体1（NOR1或NR4A3）。为了深入研究Nurr1在多巴胺能及其他脑区相关神经功能障碍中的精确功能，需要获得不与Nur77和NOR1发生交叉反应的抗体。由于这些蛋白的LBD区域比其DNA结合域更具差异性，因此使用纯化的LBD进行免疫应答，理论上可产生对Nurr1特异、且对Nur77和/或NOR1交叉反应最小的抗体。尽管已成功制备了抗Nurr1抗体，但这些抗体仍表现出对家族其他成员显著的免疫反应性。通过在固定化Protein A上进行亲和层析，随后在固定化的Nur77和NOR1 LBD上进行预吸附，最终获得了无交叉反应性的Nurr1特异性抗体。本文中，我们通过使用高度保守蛋白家族成员间差异最大的区域进行动物免疫，并结合预吸附去除交叉反应性抗体，从而选择性地获得针对特定成员的抗体。本实验方案的目标是通过针对交叉反应性抗原的预吸附步骤，提高多克隆抗体的特异性。
引言
转录因子 Nurr1 及其同源物（Nur77 和 Nor1）属于核受体 4A 亚家族（NR4A）1。它们也属于孤儿受体，因为其内源性配体尚未被鉴定出来。Nurr1 于 1992 年首次被克隆，尽管已知其在脑中表达2，但其在中脑多巴胺能神经元发育和维持中的关键作用是通过基因敲除小鼠研究揭示的3。此外，近期一项条件性基因敲除研究进一步证实了其在维持中脑多巴胺能神经元中的重要作用4。由于这些精巧的研究揭示了 Nurr1 在中脑多巴胺能神经元中的关键功能，后续大量研究主要集中于中脑多巴胺能神经元以及与多巴胺相关的神经退行性疾病——帕金森病（PD）5。
值得注意的是，Nurr1不仅在中脑多巴胺（mDA）神经元中表达，还在多种脑区中表达2，提示其可能在许多非多巴胺能区域中具有功能作用，这一观点得到了近期研究的有力支持，表明Nurr1在多种脑功能中发挥重要作用。例如，已有研究显示，学习等记忆诱导活动或其他依赖海马体的任务均可导致海马体中Nurr1表达上调6,7。此外，敲低海马体中Nurr1的表达足以损害长期记忆和/或突触可塑性8-11，强烈提示Nurr1在多个脑区中具有多样化功能。因此，为了进一步理解Nurr1在特定细胞类型及亚细胞结构中的表达情况，理想的方法是使用对Nurr1特异且不与其同源蛋白Nur77或Nor1发生交叉反应的抗体。本文描述了一种制备Nurr1特异性抗体的预吸附方案，并提供了证明其特异性的附加数据。
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方案
注意：以下提及的所有溶液的组成均可在材料/设备表中找到。
1. 蛋白A柱抗体纯化
- 在开始操作前，将蛋白A离心柱及所有所需缓冲液平衡至室温，放置15分钟。
- 用蛋白A IgG结合缓冲液将免疫血清按1:1比例稀释。（建议使用5 ml血清）。
- 轻轻敲击蛋白A离心柱的管帽，使可能卡在帽内的树脂脱落。取下顶部管帽，轻轻折断底部封口，将柱子放入15 ml收集管中，使保存液自然流出。
- 加入5 ml蛋白A IgG结合缓冲液，待其完全流尽。
- 将稀释后的免疫血清上样至柱子中，并收集穿流液。为获得最佳效果，加入的样品体积应使抗体浓度低于柱子抗体结合能力的80%。
- 用15 ml蛋白A IgG结合缓冲液洗涤柱子，或持续洗涤至280 nm处的吸光度低于0.1。
- 向五个已标记的收集管中各加入100 µl中和缓冲液。
- 向蛋白A柱中加入5 ml IgG洗脱缓冲液，并将洗脱液以每管1 ml的体积分别收集至含有100 µl中和缓冲液的各收集管中。
- 测定每管洗脱液在280 nm处的吸光度，合并吸光度大于0.5的组分。合并后的组分置于冰上，直至进行透析。
- 通过加入8 ml IgG洗脱缓冲液再生柱子，并使溶液流过柱体。
- 用蛋白A IgG结合缓冲液冲洗柱子，直至流出液的pH恢复至7.4。
- 加入5 ml保存液（含0.02%叠氮化钠的PBS）以保存柱子。当柱内液体剩余约3 ml时，盖上底部盖子并固定顶部盖子。将柱子于4 °C保存。
- 根据制造商说明确定所需透析袋的长度。使用16 mm平展直径的透析袋时，每毫升待透析溶液需使用5.47 cm长度的透析袋。剪切透析袋，并用pH 7.4的PBS冲洗15至30分钟。
- 将透析袋一端折叠并夹紧，将已合并的含IgG组分转移至已在pH 7.4 PBS中平衡的透析袋中，封闭另一端。
- 在室温下，用200倍体积的pH 7.4 PBS进行透析，持续2小时。
- 更换透析缓冲液（新鲜pH 7.4 PBS），继续在室温下透析2小时。
- 再次更换透析缓冲液（新鲜pH 7.4 PBS），于4 °C过夜透析。
- 透析完成后的抗体溶液置于4 °C保存，待进行后续纯化步骤时使用。
- 通过测定280 nm处的吸光度及抗体在280 nm处的摩尔吸光系数（210,000 M-1 cm-112）来评估抗体浓度。
2. LBD 蛋白与 AminoLink 偶联树脂的偶联
- 准备两根层析柱，分别用于 Nor1 和 Nur77。两种蛋白的操作均遵循相同方案。
- 将待偶联至树脂的蛋白在冰上解冻。使用其摩尔消光系数及在 280 nm 处的吸光度测定蛋白浓度12。
- 也可使用蛋白定量检测方法，如双辛可宁酸（bicinchoninic acid）法13。若蛋白溶解于含胺缓冲液中，需通过透析或缓冲液置换将其转移至偶联缓冲液（Coupling Buffer）中。若蛋白已处于合适缓冲液（无游离胺）中，则用偶联缓冲液稀释 4 倍。
- 每 2 mg 蛋白使用 2 ml 树脂。后续所有步骤均针对装有 2 ml 树脂的 10 ml 层析柱。每 1 ml 树脂最多可偶联 10 mg 蛋白（即 2 ml 的 1:1 悬液）。
- 通过将滤片推至底部并用 pH 7.4 的 PBS 缓冲液冲洗，制备 10 ml 层析柱。封闭柱底，加入 2 ml 偶联缓冲液。
- 向柱中加入所需体积的树脂悬液（加入 4 ml 以获得 2 ml 树脂），移除柱底封帽，使柱体排空。用总共 6 ml（相当于 3 倍树脂床体积）的偶联缓冲液冲洗柱体，并让其排空。偶联缓冲液排尽后，重新封闭柱底。
- 将溶于偶联缓冲液中的目标体积蛋白（2–4 ml）加入柱中（保留一份蛋白溶液样品，用于在步骤 2.11 中通过测定洗脱液在 280 nm 处的吸光度或双辛可宁酸法检测蛋白浓度，以评估偶联效率）。封闭柱体，翻转混匀，使溶液均匀分布。
- 称量一个空的 1.8 ml 微离心管，并移至通风橱内。小心将 NaCNBH3（约 0.05 g）转移至已称重的管中。盖上管盖，再次称量含 NaCNBH3 的管重。切勿在通风橱外打开该管。
- 根据转移至管中的 NaCNBH3 质量，加入 1 M NaOH 配制成 5 M 溶液。NaCNBH3 的分子量为 62.84 g/mol，因此 0.05 g 相当于 (0.05/62.84 = 7.96 × 10-4 mol) 7.96 × 10-4 mol。为配制 5 M 溶液，需加入 (7.96 × 10-4 / 5) = 159 µl 的 1 M NaOH。
- 计算反应总体积（需计入树脂体积），每毫升反应体系加入 10 µl 的 5 M NaCNBH3。
- 例如：对于 4 ml 的反应体积，加入 40 µl 的 5 M NaCNBH3。若使用 1 ml 树脂并加入 3 ml 蛋白溶液，则总体积为 4 ml。
- 封闭柱体，翻转混匀。将柱固定于旋转混合仪上，于 4 °C 过夜反应。
- 次日早晨，将柱移至化学通风橱，小心打开柱帽（可能有气体生成），使柱体排入洁净离心管中，收集流出液，用于通过 280 nm 吸光度法12或双辛可宁酸法测定蛋白浓度，并与步骤 2.6 中的初始蛋白浓度进行比较。
- 用 4 ml 偶联缓冲液洗涤树脂，使柱体排空。
3. 封闭剩余位点
- 用 4 ml 淬灭缓冲液洗涤树脂。排干后更换底部盖子。加入 2 ml 淬灭缓冲液并重悬树脂。
- 通过测量树脂体积和淬灭缓冲液体积来确定总反应体积，然后每毫升反应体积加入 10 µl 的 5 M NaCNBH3。
- 室温下轻轻翻转混匀 30 分钟。30 分钟后，将层析柱移至通风橱中。小心取下顶部盖子，然后取下底部盖子，让层析柱液体流入废液管中。
- 用 5 倍树脂体积的洗涤液洗涤层析柱。通过测定洗脱液在 280 nm 处的吸光度，监测洗涤液中是否存在残留蛋白质。未偶联的蛋白质会被高盐浓度洗脱去除。
- 用 6 ml 含 0.02% 叠氮化钠的脱气 PBS（pH 7.4）洗涤树脂。将层析柱保存在 4 °C，待用时取出。
4. Nurr1 特异性抗体的纯化
- 用 10 ml PBS（pH 7.4）冲洗 Nur77 LBD 偶联柱，让其自然流干。封闭柱子底部，将流干后的 Nur77 LBD 偶联柱放入新的 15 ml 收集管中。
- 加入 5 ml 蛋白 A 纯化的抗 Nurr1 抗体，封闭柱子两端，置于 4 °C 旋转孵育 1 小时。取下柱子上下端的封帽，收集流出液。将流出液置于冰上保存，待用于 Nor1 LBD 偶联柱。
- 用 10 ml PBS（pH 7.4）冲洗 Nor1 LBD 偶联柱，让其自然流干。封闭柱子底部，将 Nor1 LBD 偶联柱放入 15 ml 收集管中。
- 将来自 Nur77 LBD 偶联柱的流出液加入该柱中，封闭柱子两端，置于 4 °C 旋转孵育 1 小时。取下柱子上下端的封帽，收集流出液。
- 通过测量 280 nm 处的吸光度测定抗体浓度。
5. 基于ELISA的纯化抗Nurr1抗体分析
- 向 96 孔板的各孔中加入 100 µl 蛋白质（2.5 µg/ml）。若同时检测 3 种不同蛋白质，则向 A1 至 H4 孔加入 100 µl 蛋白质 1，向 A5 至 H8 孔加入 100 µl 蛋白质 2，向 A9 至 H12 孔加入 100 µl 蛋白质 3。盖好板子，在 4 °C 下孵育过夜。
- 用 PBS（pH 7.4）洗涤包被孔两次，每次每孔 300 µl，并向所有包被抗原的孔中加入 300 µl ELISA 封闭缓冲液，在室温下孵育 2 小时。
- 在板子封闭期间，用 ELISA 封闭缓冲液配制所需起始浓度的纯化抗 Nurr1 抗体（浓度范围为 10 至 100 µg/ml）。
- 封闭 2 小时后，将 ELISA 封闭缓冲液替换为新鲜 ELISA 封闭缓冲液，每孔加入 100 µl。
- 向 A 行所有孔中加入 100 µl 稀释后的纯化抗 Nurr1 抗体。通过将 A 行孔中的溶液 100 µl 转移至 B 行孔，再将 B 行孔中的溶液 100 µl 转移至 C 行孔，依次转移至 G 行，进行抗体的连续稀释。混合 G 行各孔溶液后，弃去多余的 100 µl。H 行各孔仅加入初始的 100 µl 封闭缓冲液。室温孵育 1 小时。
- 用含 0.05% Tween 20 的 PBS（pH 7.4）洗涤板子三次，每次每孔 300 µl，然后将板子倒置在吸水纸上拍干，去除多余的洗涤液。
- 向所有孔中加入 100 µl 用 ELISA 封闭缓冲液稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（1:8,000 稀释；通常稀释范围为 1:5,000 至 1:25,000）。室温孵育 1 小时。
- 按步骤 5.6 所述方法洗涤板子三次。用去离子水冲洗所有孔，每孔加 300 µl。将板子倒置在吸水纸上拍干，去除多余水分。
- 向所有孔中加入 100 µl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（预热至室温），在室温下避光孵育 15 至 30 分钟 。
- 加入 50 µl 2 N H2SO4 终止反应。
- 在 450 nm 处读取吸光度，并以 650 nm 处的背景值进行校正。
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结果
Nurr1特异性抗体经蛋白A柱纯化与经蛋白A纯化后再通过Nur77 LBD和Nor1 LBD柱纯化的抗Nurr1抗体的比较如图所示 图1如图所示，经Protein A纯化的Nurr1抗体对Nurr1 LBD表现出强结合信号，但也显示出对Nur77 LBD和Nor1 LBD的显著结合。当将Protein A纯化的Nurr1抗体进一步通过Nur77 LBD和Nor1 LBD进行去除交叉反应的纯化后，最终获得的亲和纯化Nurr1抗体仅特异性结合Nurr1 LBD，而对Nur77 LBD或Nor1 LBD均未检测到结合信号，表明其针对Nur77和Nor1的交叉反应性已完全消除。
这种特异性进一步通过Western blot分析得到证实，该分析检测了转染了携带全长Nurr1、Nor1或Nur77与Myc标签蛋白融合的表达载体的CHO细胞提取物（图2）。正如预期，抗Myc抗体显示每种全长蛋白均在其预期的分子量处表达。与ELISA结果一致，经Protein A纯化的Nurr1特异性抗体可强烈检测到全长Nurr1，但也能检测到No...
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讨论
该方案的成功依赖于能否获得纯化的蛋白质，以表征针对特定目标蛋白家族成员所产生的抗体。在通过ELISA和Western印迹明确证实存在显著交叉反应性之前，无需使用蛋白A/G纯化抗体。
如文中所述，重要的是避免使用含胺缓冲液（如 Tris 或甘氨酸）溶解待与柱子交联的蛋白质。此外，用于交联的蛋白质最佳浓度必须通过实验确定。柱上蛋白质过多可能导致空间位阻，而过少则会降低吸附效率。因此，建议测试 2 至 10 mg/ml 范围内的蛋白质浓度，并评估所获得抗体的质量。
当该技术未能产生高特异性抗体时，必须考虑多个因素，包括：交联效率、免疫反应性结构域的丢失以及交联蛋白的变性。如实验方案所述，监测交联效率有助于确定固定在柱上的蛋白量是否过多或过少。若怀疑通过活性氨基进行交联会破坏免疫反应性结构域，则应考虑通过羧基或碳水化合物进行固定化。
监测该操作的效率以持续获得高特异性抗体非常重要。为了再生目的，必须在剧烈条件下（高或低 pH）洗脱结合在柱子上的交叉反应性抗体。这会导致越来越多的交...
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：NS070577 和 NS084869）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nurr1、Nor1 和 Nur77 的纯化配体结合结构域 | 柱保存溶液 | ||
| AminoLink 偶联树脂及试剂盒 | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A 离心柱 | Thermo Scientific | 89978 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline） | Corning | 21-031-CV | |
| 96 孔平底板，高边，330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% 正常山羊血清 | KPL | 50-675-69 | |
| 牛奶稀释液/封闭浓缩液 | KPL | 50-82-01 | |
| IgG 洗脱缓冲液 | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23235 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（H+L） | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA 树脂 | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG 结合缓冲液 | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG 洗脱缓冲液 | Thermo Scientific | 21004 | |
| 柱保存溶液 | 含 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液 | ||
| Spectra/Por 7 预处理透析管 | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml 一次性层析柱 | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink 偶联缓冲液 | 0.1M 磷酸钠，0.05% NaN3，pH 7.0 | ||
| 封闭缓冲液 | 1M Tris·HCl，0.05% NaN3，pH 7.4 | ||
| 洗涤液 | 1M NaCl，0.05% NaN3 | ||
| ELISA 封闭缓冲液 | 1% 正常马血清（NHS），1% 正常山羊血清（NGS）溶于 1× KPL 牛奶稀释液中 | ||
| 保存溶液 | PBS pH 7.4 含 0.02% 叠氮化钠 | ||
| 微量移液器：10 μl；20 μl；200 μl；1000 μl |
参考文献
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
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