人类共感染难以复制 体外然而，人类疟原虫可被轻易地进行体外培养 体外，新鲜分离的自然感染HIV的人类外周血单个核细胞亦可如此。这为研究HIV共感染背景下疟原虫的早期免疫应答提供了一个极佳的模型。
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摘要
摘要
疟疾与艾滋病共同感染已成为日益重要的公共卫生问题。然而，目前大多数关于疟疾或艾滋病的研究主要分别针对每一种感染。尽管独立研究每种病原体的疾病动态至关重要，但同时也有必要对这些病原体之间的相互作用进行探究和理解。
我们开发了一种多功能的 体外 HIV-疟疾共感染模型用于研究HIV感染背景下宿主对疟疾的免疫应答。该模型可用于检测细胞上清液中的分泌因子、细胞表面及细胞内蛋白标志物，以及RNA表达水平。实验设计与所用方法可减少变异，提高数据的可靠性与可重复性。
本模型中使用的所有病原体均为天然的人类病原体（恶性疟原虫 以及HIV-1），所有感染细胞均为自然感染并新鲜使用。我们使用被寄生的人类红细胞 P. falciparum 并保持连续培养 体外 培养。我们从慢性 HIV 感染的志愿者中获取新鲜分离的外周血单个核细胞。每种实验条件均设有适当的对照（P. falciparum 受感染红细胞与正常红细胞），且每位HIV感染者均有与其配对的HIV未感染对照供者，其细胞于同日采集。该模型为研究在HIV感染背景下疟原虫与人类免疫细胞之间的相互作用提供了接近真实的环境。
引言
共感染，即同时感染多种病原体，在自然环境中是普遍现象。共感染可能对疾病病理学以及每种感染的临床管理产生重大影响。在共感染的情况下，疫苗和药物的有效性以及诊断检测结果均可能受到负面影响（详见文献1综述）。然而，尽管共感染具有重要意义，目前大多数病原体研究仍仅关注单一感染。
疟疾和人类免疫缺陷病毒1型（HIV）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。疟疾与HIV流行区域在地理分布上存在广泛重叠，使数百万人面临共感染的风险，进而增加罹患更严重临床疾病的可能性2–10。这两种疾病存在负面相互作用。在HIV感染者中，疟疾感染期间可观察到HIV病毒载量升高以及CD4+ T细胞计数暂时性下降；而在共感染个体中，疟原虫负荷以及临床疟疾和重症疟疾的风险均更高2,3,5,7,8,10。HIV加剧疟疾严重程度的机制尚未完全阐明，有待进一步研究。
在此，我们介绍一种可用于研究疟疾与艾滋病病毒共感染的方法 体外 具体而言，该方法可用于在 HIV 感染背景下检测疟疾特异性免疫应答。本方案描述了一种多功能共培养体系，使用从慢性 HIV 感染供体中新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMCs） 体外 培养的 P. falciparum 被寄生的红细胞（PfRBC）。还可利用前瞻....
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方案
本方案需要招募用于寄生虫培养的血清和红细胞供体，以及用于外周血单个核细胞（PBMC）分离的HIV阳性及未感染供体。所有研究必须经过机构审查委员会批准，所有供体在采血前须签署知情同意书。
警告：处理人类血液样本和人类疟原虫需采取预防措施。始终穿着实验服、佩戴手套，并在二级生物安全柜中操作。若发生意外经皮暴露于人类疟原虫的情况，应立即向健康与安全部门报告，以接受预防性治疗。处理 HIV 阳性血液时还需采取额外的安全防护措施：穿着背后系扣的实验服，戴双层手套（外层应为乳胶手套），所有操作均须在二级生物安全柜中进行。禁止使用任何玻璃器皿或尖锐物品，禁止使用抽吸装置。所有被污染的物品在丢弃前须置于 Virox 溶液或漂白剂中至少浸泡 1 小时。使用后，所有工作表面须用 Virox 擦拭并进行 1 小时紫外线照射消毒。请注意，各机构均有其特定的生物安全规定，必须严格遵守。若发生意外暴露于 HIV 感染血液的情况，应立即向健康与安全部门报告，以便评估是否需要采取暴露后预防措施。
注意：P. falciparum 疟原虫存在不同的株系。本实验使用了ITG株系，但也可使用其他不同株系。有关冻存和复苏Plasmodium falciparum寄生虫的详细操作指南可参见MR4网站13。
1. 制备疟原虫培养用RPMI-A培养基
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结果
图中显示了NKT细胞产生IFNγ的水平（图2），通过CD56+CD3+γδ-设门获取NKT细胞群体（数据未显示）。细胞在染色前培养72小时。染色后，在流式细胞仪上采集100,000个CD3+细胞，以获得足够数量的NK、NKT和γδ细胞（目标细胞）。每张图中至少显示5,600个NKT细胞。TNF的产生采用相同方法检测（数据未显示）。图中结果清楚表明，在暴露于PfRBC的情况下，HIV阳性个体来源细胞的IFNγ产生水平低于HIV阴性个体。
流式细胞术分析具有较强的主观性，因此为每个实验设置所有适当的对照至关重要（见图2）。背景水平通过FMO样本进行计算，从而能够真实反映细胞因子染色结果。使用PMA/离子霉素刺激的细胞作为阳性对照（数据未显示）。PMA和离子霉素是T细胞产生细胞因子的强效刺激剂。若这些样本中未检测到IFNγ的产生，则很可能是染色方案存在问题，但也可能与其他因素有关，例如细胞活力下降或试剂失活。
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讨论
我们的实验方案已优化，以更真实地研究HIV与疟疾共感染 体外首先，疟原虫培养需要新鲜的人类红细胞和血清。这是获得健康疟原虫群体的关键。不能使用疟原虫裂解物替代活体疟原虫，因为使用活体疟原虫时，细胞因子的产生更为迅速且强烈。 P. falciparum 感染的红细胞（PfRBC） 17,18此外，自然杀伤细胞等细胞类型的活化需要完整的恶性疟原虫感染红细胞（PfRBC），使用疟原虫裂解物则效率低下。这可能是由于PfRBC与白细胞之间需要直接接触，或由于与细胞表面受体相互作用的疟原虫来源配体本身不稳定所致。 18疟原虫感染红细胞（PfRBC）培养物在实验前也必须充分同步化（方案4）。同步化的PfRBC可提高实验数据的可重复性。尽管本方案描述的是使用滋养体阶段的PfRBC进行共培养，但该方法可轻松修改用于环状体阶段PfRBC的研究。
人类白细胞可被人工感染HIV，该方法已用于疟疾与HIV共感染的研究20。然而，这种方法无法模拟慢性HIV感染所导致的免疫失调。在本共培养体系中，我们使用从慢性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
C.A.M.F. 和 L.S. 参与了实验方案的设计、数据的获取与分析，以及文章的撰写。
作者谨此感谢 Kain 博士、Loutfy 博士、Wasmuth 博士和 Ayi 博士所做出的贡献。
C.F. 获得了加拿大治疗网络/安大略省艾滋病治疗网络（OHTN）博士后奖学金的支持。L.S. 获得了安大略省艾滋病治疗网络（OHTN）青年研究者发展奖的支持。本研究工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（MOP-13721 和 115160）以及 CIHR 新研究者催化剂基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙氨酸 | Sigma | A7377 | |
| 抗体（见另一表格） | |||
| BD Cytofix/Cytoperm 与 BD GolgiPlug | BD | 555028 | 包含布雷菲德林 A、Cytofix/Cytoperm 缓冲液和 Perm/Wash 缓冲液 |
| BD Vacutainer ACD 溶液 A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer 肝素钠 | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS（无钙、无镁） | Corning | 21-031-CV | |
| 胎牛血清 | Sigma | F1051 | 使用前需热灭活 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| 庆大霉素（10 mg/ml） | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 染色试剂盒 | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| 次黄嘌呤 | Sigma | H9636 | |
| 离子霉素 | Sigma | I3909 | |
| MEM 非必需氨基酸（10 mM） | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 粉末 | Life-Technologies | 31800-022 | |
| 含 L-谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| 碳酸氢钠（粉末，细胞培养级） | Sigma | S5761 | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 11360 | |
| Tris（Trizma 碱） | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| 台盼蓝（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | 取决于所用抗体 |
| 寄生虫气体混合物 | 特殊订购 | 3% CO2, 1% O2, 平衡 N2 | |
| 设备 | |||
| 0.2 μm 滤器单元 | |||
| 载玻片 | |||
| T25 培养瓶 | |||
| T75 培养瓶 | |||
| 50 ml 离心管 | |||
| 24 孔培养板 | |||
| 未封口巴斯德吸管 | |||
| 封口巴斯德吸管 | |||
| 无菌移液管 | |||
| 血细胞计数板 | |||
| 流式细胞仪（三激光） | |||
| 用于流式细胞术的抗体 | |||
| 抗 TNF 抗体 | eBiosciences | 551487 | FITC（荧光染料） 2 μl |
| 抗 IFNγ 抗体 | Biolegend | 506507 | PE（荧光染料） 20 μl |
| 抗 CD8 抗体 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7（荧光染料） 1 μl |
| 抗 CD14 抗体 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | 生物素（荧光染料） 0.5 μl 链霉亲和素 PE-TR（荧光染料） 0.1 μl |
| 抗 CD56 抗体 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5（荧光染料） 5 μl |
| 抗 γδ 抗体 | Biolegend | 331212 | APC（荧光染料） 5 μl |
| 抗 CD3 抗体 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7（荧光染料） 5 μl |
| 抗 CD4 抗体 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue（荧光染料） 1 μl |
参考文献
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
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