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方法文章

一种用于研究应激诱导行为与生理功能缺陷的亚慢性轻度社交挫败应激小鼠模型

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DOI：

10.3791/52973

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2015年11月24日

 , 
1College of Agriculture, Ibaraki University, 2Cooperation between Agriculture and Medical Science, Ibaraki University, 3United Graduate School of Agricultural Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

本文内容

摘要

本文描述并采用了一种建立小鼠亚慢性轻度社交挫败应激模型的方法，用于研究抑郁症的致病特征，包括体重增加后出现的类似多食和多饮的症状。

摘要

生活中的应激事件常会增加人类抑郁症的发病率。为了研究抑郁症的机制，建立抑郁症的动物模型至关重要。由于抑郁症存在多种类型，因此需要多种动物模型以更深入地理解该疾病。此前已建立了一种采用改良型慢性社交挫败应激（CSDS）范式的小鼠亚慢性轻度社交挫败应激（sCSDS）模型。在该范式中，为减少攻击者造成的身体伤害，相较于原始CSDS范式，缩短了攻击者与从属小鼠之间的身体接触时间。经历sCSDS的小鼠在应激期间表现出体重增加、摄食量和饮水量增加，且在应激结束后其社交行为受到抑制。就应激诱导的进食和饮水增多并伴随体重增加的表型效度而言，sCSDS小鼠可能表现出与人类非典型抑郁症相关的某些特征。因此，sCSDS小鼠模型可能有助于研究抑郁症的致病机制。本实验方案将有助于建立sCSDS小鼠模型，尤其适用于研究应激诱导的体重增加以及类似多饮和多食症状的潜在机制。

引言

人类一生中会经历各种各样的应激事件。过度的应激常导致人类和动物产生有害的生理后果。在人类中，应激事件是诱发抑郁症等精神障碍的主要危险因素1。一项全球疾病负担研究指出，按伤残调整生命年（DALYs）和伤残生存年数衡量，抑郁症是最致残的疾病之一2。此外，抑郁症占自杀相关DALYs的最大比例3。抑郁症患者难以正常管理自己的生活，因而其生活质量常常恶化。因此，迫切需要开发有效的治疗方法，以改善这些患者的生活质量。

关于重度抑郁症已开展了大量研究，这些研究揭示遗传因素对疾病易感性的贡献约为30–40%，这可由多个微效基因位点的共同作用来解释4。由于抑郁症的致病机制复杂，其详细的病因至今仍不明确。临床报告表明，抑郁症存在多种亚型，例如忧郁型和非典型抑郁症5，分别表现为体重下降和体重增加6。尽管约25–30%的抑郁症患者表现出典型的忧郁特征，15–30%的患者表现出典型的非典型特征，但大多数患者同时具有这两种亚型的混合特征7。因此，重度抑郁症的症状表现具有高度异质性。为了寻找生物标志物并针对人类不同类型的抑郁症开发客观的治疗方法，建立多种不同的抑郁症动物模型至关重要8。

已通过多种方法建立了抑郁症的动物模型，包括习得性无助、慢性不可预测性轻度应激以及慢性社交挫败应激（CSDS）9-12。Toyoda 及其同事建立了大鼠和小鼠的 CSDS 模型13-17，以阐明与抑郁症相关的代谢变化和行为表现。鉴于抑郁症动物模型需通过表面效度进行评估18，建立模型所依赖的实验背景至关重要。此外，Golden et al.19 详细报道了构建 CSDS 小鼠模型的方法。已知 CSDS 小鼠的社会行为缺陷可通过长期抗抑郁药物治疗而恢复，但急性治疗无效；在脑源性神经营养因子调控方面，其表现出的症状与抑郁症患者相似6。

Goto et al.13 通过改进 Golden et al.19 的方法，先前已建立了亚慢性轻度社交挫败应激（subchronic and mild social defeat stress, sCSDS）小鼠模型。sCSDS 小鼠在体重增加和体内水分含量升高的同时，表现出类似多饮和多食的症状13。本报告提供了建立 sCSDS 小鼠模型的实验方案，并探讨了该模型的应用价值。

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方案

动物实验经茨城大学动物护理与使用委员会以及日本文部科学省（MEXT）批准，并符合其相关指南（通知第71号）。本方案的完整概述见图1。

1. 仪器

  1. 准备两种类型的笼子：单只饲养笼（宽 [W] × 深 [D] × 高 [H] = 143 mm × 293 mm × 148 mm）和“社交挫败（SD）”笼（W × D × H = 220 mm × 320 mm × 135 mm）。
  2. 如图2所示，使用一块5 mm厚的丙烯酸透明隔板将SD笼分隔为两个隔间，隔板上设有15个圆形孔洞（呈3 × 5矩阵排列，直径8 mm）。
  3. 准备云杉木屑垫料、纯化饮食颗粒饲料和饮水瓶。此外，准备纸巾、口罩和乳胶手套。
  4. 进行社交互动测试时，准备一个由灰色聚氯乙烯材料制成的开放场装置（W × D × H = 40 cm × 40 cm × 40 cm）、一个钢制配重块（190 g），以及一个塑料互动箱（W × D × H = 10 cm × 10 cm × 13 cm；100 g），其上带有三个金属丝网窗口（W × D = 5 cm × 5 cm）（图3）。
  5. 在动物设施的行为测试室内安装CCD摄像机（2.8–12 mm；F = 1:1.4；1/3英寸CCD）和自动追踪系统。在测试室内放置合适的架子用于放置小鼠笼具，使小鼠在测试前至少适应测试室环境30分钟。

2. 环境适应

  1. 从动物 breeding 公司获取 7 周龄的雄性 C57BL/6JJmsSlc（B6）小鼠和 5 个月以上的雄性 Slc:ICR（ICR）小鼠。
  2. 将两组 B6 小鼠（每组 n = 12）分别转移至实验设施；其中一组（筛选用 B6 小鼠）用于筛选具有攻击性的 ICR 小鼠，另一组（实验用 B6 小鼠）用于建立 sCSDS 模型。
  3. 将 12 只 ICR 小鼠（n = 12）引入实验设施，以筛选其攻击性行为。
  4. 将小鼠在单个笼具中单独饲养 1 周，维持 12 小时光照-12 小时黑暗循环（约 100 lux 荧光光照，光照开启时间为 08:00），环境温度恒定（约 23 °C），湿度恒定（约 40%），以使小鼠适应实验环境。在各笼具之间放置白色塑料板作为隔板，防止小鼠受到邻近小鼠行为的影响。
  5. 自由提供纯化饮食颗粒饲料和反渗透水。使用 AIN-93G 饲料，因其成分明确，而其他非纯化饲料颗粒的成分可能存在批间差异。
  6. 每天测量小鼠的体质量、摄食量（FI）和饮水量（WI）。根据实验起始日计算体质量增量（BWG）。

3. ICR 小鼠攻击性行为的筛选

  1. 如上所述，在适应环境1周后，于饲养室光照强度约为300 lux的下午（14:00–17:00），使用B6小鼠（入侵者；8周龄）对ICR小鼠（居住者）进行居住者-入侵者实验，每次试验持续3分钟。
    1. 具体而言，每天对每只ICR小鼠进行3次试验，连续5天（共15次试验），尽可能使用多只不同的B6小鼠，以确定哪些ICR小鼠对入侵者表现出高度攻击性。在试验过程中，记录攻击潜伏期及攻击行为持续时间（伴随攻击性啃咬的快速动作）。
  2. 通过每次试验后检查B6入侵小鼠身上的损伤伤口，识别出高度攻击性的ICR小鼠。
  3. 计算攻击潜伏期小于30秒的试验所占比例，作为攻击性评分的第一个指标。
  4. 计算攻击潜伏期小于3分钟的试验所占比例，作为攻击性评分的第二个指标。
  5. 根据第一个指标评估攻击性得分；当第一个指标相同时，使用第二个指标进行判断。
  6. 选择攻击性得分高但无过度攻击行为的ICR小鼠作为攻击性ICR小鼠，并在后续一系列实验中重复使用这些小鼠至约12月龄；然而，在每次实验前均需按照上述方法重新进行筛选，以确认ICR小鼠的攻击性。
  7. 每次筛选试验结束后，记录筛选用B6小鼠的受伤程度。 若小鼠受伤， 应将其单独隔离于一个笼具中，并通过监测其体重增长、食物摄入量和饮水量来观察恢复情况。 若伤口严重并影响小鼠的生理状态或行为表现， 应根据当地IACUC指南实施安乐死。

4. sCSDS

  1. 在初次应激暴露前7天（第-6天）引入实验用B6小鼠，并将小鼠单独饲养于单个笼中，以使其适应环境。
  2. 在第1天前3天（即第-2天），将具有攻击性的ICR小鼠移入每个SD笼的一个隔间内，该笼通过丙烯酸隔板分隔，使小鼠可在SD笼中建立领地（数量与实验用B6小鼠相同）。
  3. 使用白色分隔板将SD笼进行分隔，方式同上述单笼条件。
  4. 对于非应激对照组B6小鼠，准备数量为小鼠总数一半的SD笼，用于成对饲养；将两只小鼠放入SD笼中由隔板分隔的同一隔间内，持续10天。
  5. 在第1天完成每日BWG、FI和WI测量后，于下午（14:00–16:00）在饲养室光照强度约为300 lux的条件下，将实验用B6小鼠放入SD笼的一个隔间（居民鼠的家笼）中，并记录从首次攻击性咬合开始的物理接触时间，以完成居民-入侵者测试。
  6. 在第1天，将物理接触时间设定为从首次攻击性咬合起5分钟，由观察者统计ICR小鼠对对手背部或侧腹区域的攻击性咬合次数（如Miczek et al.20所述），以确定B6小鼠所受身体应激的程度。
  7. 物理接触结束后，立即救出实验用B6小鼠，检查并记录其毛发状态和伤口情况，随后将其转移至SD笼中与ICR小鼠相邻的另一隔间，直至次日再次暴露于身体应激。
  8. 由于SD笼中的丙烯酸隔板为透明材质并带有孔洞，实验用B6小鼠每天将连续24小时暴露于来自相邻隔间ICR小鼠的多种情绪性应激刺激，包括视觉、听觉和嗅觉刺激。
  9. 每日测量对照组B6小鼠的BWG、FI和WI，随后将其放入SD笼的各个隔间中，每只小鼠单独放置一天。
  10. 在第2天完成每日BWG、FI和WI测量后，将实验用B6小鼠引入其他ICR小鼠的领地，使其再次暴露于身体应激。
  11. 在第2天，将物理接触时间设定为从首次攻击性咬合起4.5分钟，并统计攻击性咬合次数。
  12. 每日移动对照组B6小鼠至不同的隔间，并更换配对组合，以随机化配对位置和伙伴。
  13. 每天将物理接触时间减少0.5分钟，至第10天时，物理接触时间设定为从首次攻击性咬合起0.5分钟。
  14. 在第7天，更换所有SD笼各隔间中约一半的木屑垫料。
  15. 在第10天最后一次身体应激暴露后，将实验用B6小鼠转移至单笼饲养。同样，在第10天将对照组B6小鼠也转移至单笼饲养。
  16. 若在第1至第10天的任一试验中，某只ICR小鼠在5分钟内未表现出任何攻击性咬合行为，则终止该次试验，并用备用的具有攻击性的ICR小鼠替换，为该实验用B6小鼠重新进行一次替代试验。
  17. 若小鼠出现伤口，应将其隔离于单笼中，并通过监测其体重增长、食物摄入量和饮水量来观察恢复情况。根据IACUC指南给予镇痛处理。若伤口严重并影响小鼠的生理或行为，应依据当地IACUC指南实施安乐死。

5. 社交回避测试（社交互动测试）

  1. 在第11天上午（09:00–12:00）进行社会回避行为测试。
  2. 测试前30分钟，将对照组和实验组B6小鼠的笼子转移至行为测试室内的架子上（环境光照低于20 lux，架子处光照为低于1 lux的弱光），使其适应环境。
  3. 为减少顺序效应，交替测试对照组和实验组B6小鼠。
  4. 每次测试前，使用浸有70%乙醇的纸巾清洁开放场装置（场地中心光照为20 lux）和塑料互动箱，以去除粪便、尿液及任何气味残留。
  5. 将一只来自单笼饲养的陌生ICR小鼠（未用作攻击者）放置在开放场装置附近。
  6. 将一只B6小鼠放入空的互动箱开放区域中，如图4所示。使用自动分析系统（见步骤5.10所述）监测并分析其行为，持续2.5分钟。
  7. 第一次试验结束后，将B6小鼠从场地中移出，并放回其饲养笼中。
  8. 随后，将陌生的雄性ICR小鼠（社会目标）放入互动箱中，再将B6小鼠重新引入开放场区域，监测其行为2.5分钟。
  9. 第二次试验结束后，将B6小鼠和ICR小鼠均放回各自的饲养笼中，并按上述方法清洁场地和互动箱。
  10. 对每只B6小鼠重复上述步骤以检测其社会行为。每次试验期间，使用CCD相机记录俯视视角的视频。
    1. 行为测试结束后，参照Goto et al.13的方法，计算每次试验中小鼠在互动区域（秒）和角落区域（秒）停留的时间。以小鼠身体中心位置判断其所处区域。
    2. 按照Krishnan et al.21发表的方法，计算社会互动评分：100 ×（有目标时的互动时间）/（无目标时的互动时间）。

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结果

为了监测为期10天内的身体应激程度，研究人员手动统计了ICR小鼠的攻击性咬伤次数。图5A显示了每只小鼠所受攻击性咬伤次数的个体数值。在早期阶段，咬伤次数存在较大变异性（第1天约为10–120次），但在后期阶段变异性降低（第10天约为5–20次）。图5B表明，随着时间推移，小鼠所受攻击性咬伤的平均次数逐渐减少，原因是身体接触的持续时间缩短（从5分钟减少至0.5分钟）。

在暴露于sCSDS小鼠10天后，实验组小鼠表现出体重增长的变化，以及每日食物和水摄入量的变化。对照组与实验组小鼠之间的总体重增长存在显著差异（p < 0.0001，非配对双尾Student’s t-检验）。对照组小鼠的总体重增长（BWG）约为0.5 g，而实验组小鼠约为2.0 g（图6）。两组小鼠之间的总食物摄入量（FI）存在提示性差异（p = 0.0904，非配对双尾Student’s t-检验），对照组和实验组小鼠分别摄入了约30 g和3...

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讨论

在sCSDS小鼠与接受标准CSDS方案（每天与攻击者发生5至10分钟身体接触）的CSDS小鼠之间，体重存在明确差异19。sCSDS小鼠在应激期间表现出体重增加（BWG），而标准CSDS小鼠在应激期间则出现体重下降21,22,23。在为期10天的应激期内，两种方案在与攻击者发生身体接触的总时长方面存在显著差异。原始CSDS范式总共包含50或100分钟的攻击者与从属小鼠之间的身体互动（全剂量CSDS），而sCSDS方法的总互动时间仅为27.5分钟（半剂量CSDS）。尽管标准CSDS小鼠所承受的身体应激强度尚不明确19，但已确认sCSDS小鼠平均每天遭受约30次攻击性咬击。如Goto et al.13所述，与标准CSDS小鼠相比，sCSDS小鼠是一种较轻度的抑郁模型（标准CSDS小鼠在最后一次挫败应激后社交回避可持续超过1个月）21，因为sCSDS小鼠在最后一次挫败应激后1个月内可恢复正常。此外，Savignac et al.24报道，与攻击者相对短暂的身体接触可能在应激期间加...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

作者感谢东京农工大学的 Kentaro Nagaoka 博士和茨城县的 Wataru Iio 博士提供的有益讨论。本研究部分得到了日本文部科学省（MEXT）资助的茨城大学农医合作项目（IUCAM）以及日本农林水产省（MAFF）资助的具有健康促进功能的农产品与食品开发研究项目（NARO）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
单个笼具Charles River Laboratories Japan宽度 [W] × 深度 [D] × 高度 [H] = 143 × 293 × 148 mm
M型笼具Natsume SeisakushoW × D × H = 220 × 320 × 135 mm
WhiteflakeCharles River Laboratories Japan由云杉木材制成的刨花垫料
AIN-93GOriental Yeast纯化饮食颗粒饲料
KimtowelNippon Paper Crecia Co.纸巾
旷场实验装置O’Hara & Co.由灰色聚氯乙烯材料制成

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