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方法文章

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

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DOI：

10.3791/52975

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2015年8月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。

摘要

膜受体与配体的相互作用介导了多种细胞功能。这些分子相互作用所引发的结合动力学及下游信号转导可能受到结合与信号发生所处力学环境的影响。最近一项研究表明，机械力可调控T细胞受体（TCR）对抗原的识别及其激活过程。这得益于我们开发并命名为荧光生物膜力探针（fBFP）的一项新技术，该技术结合了单分子力谱与荧光显微镜技术。fBFP利用超软的人类红细胞作为灵敏的力传感器，配合高速相机和实时成像追踪技术，在力、空间和时间分辨率上分别达到约1 pN（10-12 N）、约3 nm和约0.5毫秒。利用fBFP，可在施加力学调控的条件下精确测量单个受体-配体结合动力学，同时在单个活细胞上成像结合所触发的细胞内钙信号。该新技术可用于研究其他细胞中在力学调控下的膜受体-配体相互作用及其信号转导过程。

引言

细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的黏附由细胞表面受体、ECM蛋白和/或脂质之间的结合介导1结合使细胞能够形成功能性结构1，以及识别、交流和响应环境1-3. 与可溶性蛋白质不同（例如，细胞因子和生长因子）从三维（3D）液相结合到细胞表面受体，而细胞黏附受体则通过狭窄的连接间隙与其配体结合，连接两个相对的表面，从而在二维（2D）界面上限制分子扩散4-7与传统结合实验通常测量的三维动力学相比（例如，表面等离子共振（SPR），二维动力学必须通过原子力显微镜（AFM）等专门技术进行定量分析8-10，流室11,12，微量移液器13,14，光镊15 和生物膜力探针（BFP）16-21.

不仅仅是为细胞凝聚提供物理连接，黏附分子还是细胞与其周围环境进行通讯的信号机制的重要组成部分。目前，人们越来越关注配体与黏附分子结合如何启动细胞内信号传导，以及初始信号如何在细胞内传递。直观来看，受体-配体结合的特性可能会影响其所诱导的信号。然而，由于传统生化检测方法存在诸多局限性，难以通过这些基于群体反应的实验手段解析细胞外相互作用与细胞内信号事件之间的机制性关系。 例如，时间分辨率较差，且完全缺乏空间分辨率。现有的可在活细胞上同时实现生物物理（二维受体-配体结合动力学）和生化（信号转导）观测的方法，包括可调节刚度的基底22弹性体微柱阵列23 并整合了荧光检测功能的流室/微流控装置24-26然而，信号传导和受体-配体结合的读数通常需要通过不同方法分别获取，这使得解析结合特性与信号事件之间的时间和空间关系变得困难。

传统的BFP是一种具有高时空分辨率的超灵敏力谱技术17使用一种可变形的红细胞（RBC）作为力传感器，可实现对单分子二维动力学、力学特性及构象变化的测量14,16,19-21,27-29基于荧光成像的蓝光荧光蛋白（fBFP）可在单分子水平上将受体-配体结合动力学与结合触发的细胞信号传导相关联。通过该实验装置， 原位 在T细胞中观察到表面机械刺激条件下的细胞信号转导活动27fBFP 具有广泛的应用性，可用于研究其他分子在其他细胞中介导的细胞黏附和信号传导。

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方案

本方案遵循佐治亚理工学院人类研究伦理委员会的指南，并已获得其批准。

1. 人红细胞的分离、生物素标记及渗透压调节

注意：步骤 1.1 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行操作。

  1. 从指尖采血获取 8-10 µl（一滴）血液，加入 1 ml 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中（表 1 和 2）。轻轻涡旋或用移液器混匀，于 900 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，再洗涤一次。
  2. 在小烧杯中称取 3.5–4 mg Biotin-PEG3500-NHS 连接剂（表 1），用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液溶解，使终浓度为 3 mg/ml。
  3. 将 171 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、10 µl 红细胞压积液和 1049 µl Biotin-PEG3500-NHS 连接剂溶液混合，在室温下孵育 30 分钟。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液洗涤红细胞一次，再用 N2-5% 缓冲液洗涤两次（表 1 和 2）。
  4. 同时，将连接剂瓶盖稍松开，放入底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，抽真空 5 分钟，然后向干燥器中充入氩气。盖紧瓶盖，取出瓶子，用塑料封口膜密封（表 1），放入底部装有干燥剂的容器中，于 -20 °C 保存。
    注意：涉及使用 Biotin-PEG3500-NHS 连接剂的步骤（包括步骤 1.2–1.4，但 1.3 中的孵育和洗涤除外）应尽快完成。
  5. 将制霉菌素用 N2-5% 缓冲液稀释至终浓度为 40 µg/ml。将 5 µl 生物素化红细胞与 71.4 µl 制霉菌素溶液（表 1）混合，在 0 °C 下孵育 1 小时。用 N2-5% 缓冲液洗涤两次，然后悬浮于含 0.5% BSA 的 N2-5% 缓冲液（表 1）中，置于冰箱（4 °C）保存。

2. 玻璃珠硅烷化

  1. 珠子表面清洗
    1. 称取50 mg玻璃珠粉末，并将其重悬于500 µl去离子水中。
    2. 在50 ml烧杯中，将0.5 ml 30% H2O2（表1）与9.5 ml去离子水混合，然后加入2 ml浓NH4OH（表1），并将该溶液置于加热板上加热至沸腾。
    3. 将玻璃珠加入沸腾的溶液中，继续煮沸5分钟，每隔1分钟轻轻摇动溶液。
    4. 煮沸后，将约5 ml热珠悬液转移至15 ml离心管中，加入室温去离子水补足体积。在3,500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
    5. 再转移5 ml热珠悬液加入已清洗的珠子中，补加去离子水，充分混匀后再次离心。重复此步骤，直至总共使用约50 ml去离子水，共清洗4至5次。
    6. 将珠悬液转移至1 ml小瓶中。用甲醇（表1）通过离心（17,000 × g，5分钟）清洗珠子3次，最后将珠子重悬于1 ml 100%甲醇中。
  2. 珠子表面巯基化
    1. 向50 ml离心管中加入45.6 ml甲醇、0.4 ml乙酸（表1）、1.85 ml去离子水、1.15 ml 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）（表1）以及1 ml步骤2.1中制备的珠悬液，在室温下孵育3小时。
    2. 反应结束后，用新鲜甲醇洗涤一次以去除所有反应物，将珠子重悬于500 µl甲醇中。将该浓缩的玻璃珠悬液均匀分装至一组20个干燥洁净的带螺口盖玻璃小瓶中。用干燥氩气流吹扫，同时缓慢旋转小瓶，使珠子在瓶壁上形成一层均匀的干燥薄膜。
    3. 将装有珠子的小瓶放入预热至120 °C的烘箱中加热5分钟，取出后迅速将瓶盖松松盖上。将小瓶置于底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，用真空泵抽真空直至冷却。
    4. 用干燥氩气吹扫已抽真空的干燥器，使其恢复至常压。打开干燥器盖子，迅速重新拧紧小瓶盖。用塑料封口膜密封小瓶，并在干燥避光的储存盒中室温保存。
    5. 使用前，取其中一瓶干燥珠子，用磷酸盐缓冲液（表1和表2）洗涤一次，重悬于50 µl磷酸盐缓冲液中，4 °C保存。该浓缩珠子制剂在后续步骤中称为“MPTMS珠子”。
      注意：若储存得当，MPTMS珠子的功能可保持长达三个月。

3. 磁珠功能化

  1. 共价包被蛋白质于微珠上
    1. 取一定体积（例如, 2.5 µl) 蛋白质储备液，与等体积的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液混合，配制成溶液1。
      注意：体积取决于蛋白储存液的浓度以及微珠表面蛋白期望的最终位点密度。
    2. 在一小烧杯中称取2-3 mg MAL-PEG3500-NHS连接剂（表1）并用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液溶解，使其终浓度达到 0.231 mg/ml。
    3. 将溶液1与3.1.2中配制的连接剂溶液等体积混合，室温孵育30分钟，制备溶液2。
    4. 同时，将装有连接剂的瓶子（瓶盖松开）放入玻璃真空干燥器中，干燥器底部放入干燥剂，抽真空5分钟，然后用氩气填充干燥器。拧紧瓶盖，取出瓶子，用塑料封口膜密封，放入底部装有干燥剂的容器中，于-20 °C.
      注意：涉及使用 MAL-PEG3500-NHS 连接剂的步骤（包括 3.1.2–3.1.4，但 3.1.3 中的孵育步骤除外）需尽快完成。
    5. 混合 5 µl MPTMS微珠与溶液2混合并加入磷酸盐缓冲液（表1) 以制成终体积 250 µl.
    6. 在室温下将珠子孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后重新悬浮于 100 µl 磷酸盐缓冲液，并于 4 °C.
  2. 制备蛋白/链霉亲和素（SA）包被的微珠
    1. 遵循方案 3.1.1–3.1.4。
    2. 混合 5 µl MPTMS微珠与溶液2的混合 5 µl 4 mg/ml 链霉亲和素-马来酰亚胺（SA-MAL）（表1）溶液，然后加入磷酸盐缓冲液，使最终体积达到 250 µl.
    3. 在室温下将珠子孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，最后重悬于 100 µl 磷酸盐缓冲液，并在 4 °C.
  3. 将链霉亲和素包被到玻璃珠上
    1. 混合 5 µl MPTMS 微珠的 5 µl 4 mg/ml SA 溶液，并加入 140 µl 磷酸盐缓冲液
    2. 在室温下孵育珠子过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后重新悬浮于 50 µl 磷酸盐缓冲液，并于 4 °C.
  4. 将生物素化蛋白包被到SA包被的磁珠上
    1. 混合 5 µl SA包被的珠子与蛋白质（体积根据所需的包被密度而定），并加入磷酸盐缓冲液，使最终体积达到 100 µl.
    2. 在过夜孵育混合物 4 °C 或在室温下孵育3小时，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后重悬于 50 µl 磷酸盐缓冲液中保存于 4 °C.

4. 细胞制备

注意：为纯化细胞，请遵循与所用细胞类型相对应的标准细胞纯化方案，例如T细胞27或某些细胞系21,29。

  1. 进行fBFP实验时，细胞悬液制备完成后，加入溶于DMSO的Fura2-AM（表1），使其终浓度为2 µM，室温孵育30分钟，然后洗涤一次。将标记荧光的细胞悬液避光保存，直至使用。

5. 微量移液器与细胞腔室的准备

  1. 制备微移液管
    1. 使用玻璃切割器将长玻璃毛细管（表 1）切割成约 3 英寸长的短段。将其中一段安装到微移液管拉制仪（表 1）上，点击“拉制”按钮，使仪器加热毛细管中部，并从两端拉伸，从而形成两根具有尖端的毛细管（原始微移液管）。
      注意：根据产品说明书，理想的原始移液管形态应具有 6–8 mm 的锥形部分和 0.1–0.5 µm 的尖端。
    2. 将一根原始微移液管安装至微移液管成型器的移液管夹持器上（表 1）。加热以熔化成型器上的玻璃小球。将原始移液管的尖端插入玻璃小球内部。待玻璃小球冷却后，向外拉动原始移液管使其断裂，仅保留尖端留在球内。重复此操作，直至获得所需孔径的尖端。
      注意：微移液管尖端内径示例：红细胞（RBC）为 2.0–2.4 µm，微珠约为 1.5 µm，T 细胞为 2–4 µm，杂交瘤细胞为 7 µm。
  2. 构建细胞腔室
    注意：细胞腔室基于自制的腔室支架构建，该支架由两块金属方片（铜/铝）和连接它们的手柄组成（图 1D）。
  3. 使用玻璃切割器将一块 40 mm × 22 mm × 0.2 mm 的盖玻片切割为两块 40 mm × 11 mm × 0.2 mm 的小片（盖玻片 1 和 2）。用真空脂将盖玻片 1 黏附在腔室支架的顶部，使其横跨两块金属方片；同样地，将盖玻片 2 黏附在底部，从而形成一个平行盖玻片的细胞腔室（图 1D）。
  4. 使用移液管在两块盖玻片之间注入 200 µl 实验缓冲液。确保缓冲液与两块盖玻片均接触。轻轻旋转并晃动腔室，使缓冲液流至腔室两端。
  5. 小心地将石蜡油注入实验缓冲区两侧，以密封缓冲液，防止其暴露于空气中。分别在缓冲区的上部、中部和下部区域注入探针微珠悬液（例如，pMHC 包被的微珠）、红细胞（RBCs）和靶细胞（例如，T 细胞）。

6. BFP 实验

用于DNA分析的带压电控制器的荧光显微镜装置，包含示意图。
图1：fBFP装置结构。（A）fBFP硬件系统的整体外观图。（B）fBFP硬件系统的示意图。（C）双摄像头系统“DC2”（橙色），其上安装了高速相机（蓝色）和荧光相机（白色）。（D）显微镜载物台，可适配实验腔室及三个微管操纵系统。（E 和 F）实验腔室内BFP设置的显微图像。（E）微管组装结构，显示探针微管（左侧）、目标微管（右上方）和辅助微管（右下方）。（F）探针微珠的放置。通过辅助微管操控一个探针微珠，并将其附着于红细胞（RBC）顶端，以形成力探针。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 打开显微镜（表1）和光源。将样品室放置在显微镜主载物台上（图1A，D）。
  2. 安装三支BFP微移液管（图1D。左侧：探针，用于抓取红细胞；右侧：靶标，用于抓取细胞或微珠；右下侧：辅助管，用于抓取微珠）。
    1. 使用微注射仪（表1）将实验缓冲液从后端填充至微移液管中。取下移液管固定器（表1），将其置于较低位置，使液体从尖端滴落。迅速将微移液管插入固定器尖端，并确保插入过程中无气泡进入微移液管。拧紧固定器螺丝。
    2. 将每个移液管固定器安装到对应的微操作器上。推动微移液管使其尖端进入样品室的缓冲液区域。调节微移液管的位置，并在显微镜视野中找到它们。
  3. 移动样品室载物台，逐一寻找三种组分的聚集区域（红细胞、靶标和探针微珠）。通过旋转操作器旋钮调节相应微移液管的位置，使微移液管尖端接近某一细胞/微珠。通过调节对应微移液管内的压力，吸住该细胞/微珠。三支微移液管将分别捕获其对应的组分。
  4. 移动样品室载物台，寻找远离已注入组分聚集区的空旷区域作为实验操作区域。切换显微镜观察模式，使图像显示在计算机屏幕上的程序视野中。将三支微移液管尖端上的组分全部移入程序的视野范围内。
  5. 对齐探针微珠与红细胞，小心操控探针微珠至红细胞顶端，短暂轻触红细胞表面后轻轻回撤。调节辅助微移液管的压力，轻轻吹出微珠，使其粘附在红细胞顶端（图1F）。移开辅助微移液管，对齐靶标与探针微珠（图2A）。

用于红细胞- T细胞相互作用的微量移液装置示意图，包含边缘追踪与强度图分析。
图2：BFP实验装置示意图及其测试循环。（A）视频显微图像显示一个力探针（左侧）和一个目标T细胞（右侧），分别由各自的移液管吸持。静止的力探针由一个膨胀的红细胞（RBC）和附着其上的配体包被微珠构成。表达受体的目标T细胞固定在压电位移器上，与探针相对排列。绿色框标示了感兴趣区域（ROI）。蓝色线条表示边缘追踪轨迹。插图展示了在橙色标记区域中，两个相对表面上的配体（pMHC，微珠侧）与受体（TCR，T细胞侧）配对情况。（B）（A）中微珠边缘的强度分布图。在x方向上的ROI区域以x轴（像素编号）表示，y方向上30个像素进行binning后取平均的光强度（灰度值）作为纵轴。（C）在力钳实验的一个测试循环中，红细胞的形变、微珠位置以及目标细胞（T细胞）位置的变化。垂直与水平虚线分别表示红细胞顶端的零力位置和时间进程。每个图中蓝色线条表示红细胞形变的线边缘追踪结果。在黏附频率实验（缺少“钳制”和“解离”步骤）和热波动实验（缺少“解离”步骤）中，采用相同但步骤较少的流程。

  1. 在程序中，于视野窗口内使用程序提供的工具测量探针微移液管的相应半径（Rp），红细胞（RBC）R0），红细胞与探针微珠之间的圆形接触面积（Rc），从而可以估算红细胞的弹簧常数（k）可通过以下公式计算17,30,
    Permeability equation for porous media; formula κ=πRpΔp/(1-Rp/R0)ln[4R0²/(RpRc)].

    其中 Δp 是探针移液管尖端的吸力压力。

    注：根据胡克定律，结合力 F，可通过弹簧常数与探针微珠位移的乘积来量化（d), 即, F = d (图2C).
  2. 将所需的红细胞弹簧常数输入程序中（请参见第6.6节实验方案。在力钳实验和黏附频率实验中，弹簧常数通常设为0.25或0.3 pN/nm；在热涨落实验中则设为0.1 pN/nm），程序将返回以厘米水柱为单位所需的吸液压力。调节连接探针移液管的水箱高度，直至达到所需的吸液压力。
  3. 在红细胞顶点处画一条水平线，相邻窗口将显示沿此线各像素的亮度（灰度值）曲线。将阈值线拖动至曲线深度约一半的位置图 2A，B).
    注意：亮度曲线上位于阈值线以下的最低点表示微珠边界的位罝，因此仅允许存在一个局部最小值。若出现两个或以上的局部最小值，则表明图像质量不理想（可能由于图像失焦，或探针微珠与红细胞对位不佳所致）。
  4. 选择所需的实验模式：热波动分析、黏附频率分析或力钳分析。根据需要设置参数（例如，撞击力 = 15 pN，加载速率 = 1,000 pN/s，接触时间 = 1 秒，夹紧力 = 20 pN（用于力钳测定）等。
    1. 点击“Start”按钮，程序将驱动目标移液管并使目标与探针发生接触和分离（详见代表性结果部分）。数据采集将同步进行，实时记录探针微珠的位置。点击“Stop experiment”按钮以停止程序，此时将弹出窗口，允许保存所获取的数据。

7. 荧光 BFP (fBFP) 实验

  1. 要使用BFP系统的荧光功能，请打开激发光源（表1）以及荧光相机（表1），由一个独立的程序控制（表1）。在程序中设置荧光成像参数，包括增益、曝光时间、激发通道（本实验中为 340 nm 和 380 nm 光） 等等. 按照BFP实验方案中的所有准备步骤操作，包括对准探针与靶标，以便在340 nm或380 nm激发光照射下观察靶细胞的活体荧光图像。
  2. 使用切片工具对细胞在整个记录期间所处的区域进行大致切片。
    注意：由于采用了接近-接触-回撤循环，细胞会反复前后移动，因此被扫描的区域远大于细胞本身。
  3. 单击“Record”以使340 nm和380 nm的光交替激发细胞内荧光染料（Fura2），系统将每隔约一秒交替记录一对相应的荧光图像。同时，在程序中单击“Start”以启动BFP实验，用于分析分子相互作用，以及启动荧光成像实验以监测细胞内钙信号。系统将生成受体-配体结合的原始数据文件（参见 图6A 如下）以及以 .tiff 格式存储的一系列钙信号荧光图像。

8. 数据分析

  1. BFP 数据分析
    1. 黏附频率实验的数据分析
      1. 依次检查每个循环的“力-时间”信号，简单记录哪些循环包含黏附事件，哪些不包含，并进行汇总，得到平均黏附频率。
      2. 收集每次黏附事件的断裂力，即键断裂前线性递增力的峰值。在一系列递增速率下收集足够数量的断裂力数据后，从每个递增速率下的断裂力分布中，利用动态力谱分析推导受体-配体解离的力依赖性解离速率18,31。
    2. 热波动实验的数据分析
      1. 依次检查每个循环的夹持阶段信号，该信号可能包含多个键结合与解离事件。以“力-时间”信号中夹持阶段的热波动水平（小球位置连续70个时间点滑动区间的标准差的平均值）作为参考，区分键的结合与解离事件，因为键的形成对应热波动的降低。
      2. 将从键解离瞬间（热波动恢复至正常水平时）到下一次键形成瞬间的时间间隔定义为等待时间，将键从结合到解离的持续时间定义为键寿命，这两者均在数据检查过程中收集。计算平均等待时间和平均键寿命，它们分别反映零力条件下结合速率（on-rate）和解离速率（off-rate）的倒数16,30。
    3. 力钳实验的数据分析
      1. 记录所有寿命事件的参数，包括平均力、键寿命、序列号以及起始时间和结束时间，以便绘制累积寿命曲线（例如，图6C，黄色曲线）。
      2. 在一系列不同作用力下收集足够数量的寿命事件。将它们按不同力区间分组，得到每个力区间内的平均寿命，从而共同生成“平均寿命-力”关系曲线（图4）。
  2. 钙荧光成像数据分析
    1. 调整强度阈值，使340 nm和380 nm两个通道的荧光图像均能清晰显示细胞轮廓且无背景噪声（图5A, B）。然后逐帧查看基于340 nm/380 nm强度比值生成的伪彩色图像（图6B），以反映细胞内Ca2+信号强度水平，进而生成“归一化Ca2+强度-时间”曲线（图6C）。利用伪彩色荧光图像生成视频，以逐秒显示荧光强度变化。

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结果

BFP 技术由 Evans 实验室于 1995 年首次建立17。这种皮牛顿力测量工具已被广泛用于检测固定在表面的蛋白质之间的相互作用，以分析黏附分子与其配体相互作用的二维动力学16,19,20,30，测量分子弹性21,29，以及确定蛋白质的构象变化21。对于荧光 BFP（fBFP），需额外配备一组与落射荧光相关的设备及其配套软件系统（表 1）（图 1A–C）。

fBFP 系统由硬件系统（光学、机械和电气组件）和软件系统（表1 和 图1A、B）组成。该系统的主体是一台倒置显微镜（图1A，中间），配备可实现明场和落射荧光显微成像的光学组件，实验载台和移液器操纵器安装于其上。荧光光源控制器（图1A，左上角）用于提供交替激发光。双相机系统“DC2”将光束分为两路，分别传...

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讨论

一次成功的fBFP实验需要考虑几个关键因素。首先，为了确保力的计算可靠，微移液管、红细胞（RBC）和探针小球应尽可能接近同轴对齐。红细胞在移液管内的投影长度应约为一个探针移液管的直径，以使红细胞与移液管之间的摩擦可忽略不计。对于典型的人类红细胞，最佳移液管直径为2.0–2.4 µm，此条件下方程117,30的拟合效果最佳。其次，为了确保在力钳实验和热波动实验中的测量主要针对单个分子键，必须将黏附频率维持在20%以下10,13,30。在此过程中，应严格控制非特异性黏附（通常通过BSA充分封闭将非特异性黏附控制在<5%）。此外，仅应从具有单一力下降事件的黏附记录中收集数据——这是单分子行为的典型特征（类似于单分子FRET中荧光的单步消失现象）。第三，荧光染料的加载浓度应根据具体情况优化，以获得最佳成像质量。第四，在每次实验前，必须仔细评估染料加载对T细胞或其他目标细胞的毒性。例如，应测量并比较染料加载前后受体-配体相互作用的结合亲和力。如果染料加载导致结合亲和力发生显著变化，则需考虑更换染料或调整加载浓度。第五，建议使用末端生物素标记的蛋白质，以便实现方便、特异且牢固的偶联，同时保持蛋白质...

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披露

作者无任何利益冲突可披露。

致谢

本论文相关研究及朱实验室中fBFP技术的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI044902、AI077343、AI038282、HL093723、HL091020、GM096187和TW008753的支持。我们感谢Evan Evans发明了这一强大的实验工具，并感谢Evans实验室成员Andrew Leung、Koji Kinoshita、Wesley Wong和Ken Halvorsen在构建BFP过程中的帮助。同时感谢朱实验室其他成员Fang Kong、Chenghao Ge和Kaitao Li在仪器开发方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4 • H2OSigma-AldrichS9638磷酸盐缓冲液的制备
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907磷酸盐缓冲液的制备
碳酸钠（Na2CO3)Sigma-AldrichS2127碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)Sigma-AldrichS5761碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS7653N2-5% 缓冲液配制
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541N2-5% 缓冲液配制
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% 缓冲液配制
蔗糖Sigma-AldrichS0389N2-5% 缓冲液配制
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1珠粒功能化
Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1红细胞生物素化
制霉菌素Sigma-AldrichN6261红细胞渗透压调节
氢氧化铵（NH₄OH）4OHSigma-AldrichA-6899玻璃珠硅烷化
甲醇BDH67-56-1玻璃珠硅烷化
30% 过氧化氢（H₂O₂）2O2)J. T. Barker1986年1月玻璃珠硅烷化
乙酸（冰醋酸）Sigma-AldrichARK2183玻璃珠硅烷化
3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）Uct Specialties, llc4420-74-0玻璃珠功能化
硼硅酸盐玻璃珠Distrilab 颗粒技术9002玻璃珠功能化
链霉亲和素−马来酰亚胺Sigma-AldrichS9415玻璃珠功能化
BSASigma-AldrichA0336配体功能化
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201细胞内钙荧光染料加载
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650细胞内钙荧光染料负载
Quantibrite PE 珠BD 生物科学340495密度定量
流式细胞仪BD 生物科学BD LSR II密度定量
毛细管 0.7-1.0 mm x 30 英寸Kimble Chase46485-1微移液管制作
弗拉明/布朗微量移液器拉制仪Sutter InstrumentsP-97微量移液器制作
移液管微力器NarishigeMF-900玻璃微量移液管制作
矿物油Fisher ScientificBP2629-1腔室组装
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-544-G腔室组装
显微注射器World Precision InstrumentsMF34G-5腔室组装
1 ml 注射器BD 309602腔室组件
微量移液器支架NarishigeHI-7腔室组装
使用数控加工自制机械部件和适配器 生物物理仪器所有部件均根据 CAD 设计进行定制。BFP系统
显微镜（TiE 倒置）尼康MEA53100BFP 系统
CFI Plan Fluor 40倍物镜（数值孔径0.75，工作距离0.72 mm，弹簧）尼康MRH00401BFP 系统
相机，GE680，640 × 480，GigE，1/3" CCD，单色Graftek Imaging02-2020CBFP系统
Prosilica GC1290 - ICX445，1/3"，C接口，1280 × 960，单色，CCD，12位ADCGraftek Imaging02-2185ABFP系统
手动亚微米探头，配备高分辨率远程控制Karl SussPH400BFP 系统
防振台（5’ × 3’)TMC77049089BFP系统
三维手动平移台纽波特462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD 软件SOLIDWORKS 公司版本 2012 SP5BFP系统
LabVIEW 软件国家仪器公司版本 2009BFP系统，BFP程序
三维压电平移台Physik InstrumenteM-105.3PBFP 系统
线性压电驱动器Physik InstrumenteP-753.1CDBFP系统
Micromanager 软件版本 1.4fBFP系统，荧光成像程序
双卡（DC-2）Photometrics77054724fBFP 系统
双通道Cam发射滤光片（T565LPXR）Photometrics77054725fBFP系统
荧光相机HamamatsuORCA-R2 C10600-10BfBFP系统
塑料石蜡膜（Parafilm）Bemis Company, IncPM996瓶口密封
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH 8.5）8.4 g/L 碳酸钠（Na2CO3)，10.6 克/升碳酸氢钠（NaHCO₃）3)
磷酸盐缓冲液（pH 6.5–6.8）27.6 g/L 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄)2PO4 • H2O)，28.4 g/L 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4)
N2-5% 缓冲液（pH 7.2）20.77 g/L 氯化钾（KCl），2.38 g/L 氯化钠（NaCl），0.13 g/L 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，0.71 克/升无水磷酸氢二钠（Na2HPO4)，9.70 g/L 蔗糖

参考文献

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