生物膜荧光探针力:受体 - 配体动力学并行和定量结合诱导细胞内信号作用于单细胞

Summary

我们描述了一种同时测量力调节的单个受体-配体结合动力学和单个 T 淋巴细胞中钙信号传导实时成像的技术。

Abstract

膜受体 - 配体相互作用介导许多细胞功能。结合动力学和由这些分子之间的相互作用引起的下游信号很可能受到机械环境中结合和信号发生。最近的一项研究表明，机械力可以调节抗原识别由与触发T细胞受体（TCR）的。这成为可能，我们开发了一种新技术，荧光地称为生物膜力探针（fBFP），它结合了单分子力谱荧光显微镜。使用超软人类红细胞作为敏感的力传感器，一个高速摄像机和实时成像跟踪技术，该fBFP是〜1 PN（10 ^-12 N）〜3纳米和〜0.5毫秒力，空间和时间分辨率。随着fBFP，可以精确地测量力下单调节受体 - 配体结合动力学，同时结合图像触发细胞内的CALcium信令在单个活细胞。这种新技术可以用来研究其他膜受体 - 配体相互作用和信号下机械调节的其它细胞。

Introduction

细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）的粘附是由细胞表面受体，细胞外基质蛋白和/或脂 ​​质¹之间的结合介导的。结合允许细胞以形成功能结构^1，以及认识，沟通，并做出反应的环境^1-3。不像可溶性蛋白（ 例如 ，细胞因子和生长因子）从一个三维（3D），其结合流体相到细胞表面受体，细胞粘附受体形成具有跨越窄交界间隙及其配体桥接两个相对的表面，限制分子键扩散在二维（2D）接口^4-7。与此相反，以三维动力学是由传统的结合分析（ 例如 ，表面等离子体共振或SPR）常用的测量，2D动力学已与诸如原子力显微镜^{（AFM）8-10}专门技术来量化，流室^11,12，微管^13,14，光镊子¹⁵和生物膜力探针^{（BFP）16-21。}

以上仅仅提供物理连锁蜂窝内聚力，粘附分子是信令机械为细胞与其周围环境进行通信的主要组成部分。出现了在理解越来越大的兴趣如何粘附分子的配体接合启动细胞内信号传导，以及如何在初始信号被转导的细胞内。直观地，受体 - 配体的性质的结合可影响它诱导的信号。然而，很难使用，因为它们的许多限制， 例如 ，一个差时间分辨率和完全缺乏空间分辨率的生物化学分析的传统合奏解剖外相互作用和细胞内信号事件之间的机械关系。现有的方法，使生物物理（2D受体....

Protocol

该协议遵循的指导方针，并已获得由佐治亚理工学院的人类研究伦理委员会。

1.人类红细胞分离，生物素和渗透压调节

注:步骤1.1应该由受过训练的医疗专业人员如护士进行，与机构审查委员会批准的协议。

1. 得到的血液8-10微升（一滴）从手指刺，并添加至1ml的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（ 表1和2）。轻轻涡旋或吸取的混合物离心1分钟，在900×g下。弃上清，洗一次。
2. 在小烧杯称量3.5-4毫克生物素- PEG3500-NHS接头（ 表1）。将其溶解在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，使最终浓度为3毫克/毫升。
3. 混合171微升的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，10微升RBC包和1049微升生物素 - PEG3500-NHS交联剂溶液和在室温下孵育30分钟。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液洗一次红细胞，然后两次用N2-5％缓冲液（ 见表1和2）。
4. 同时，将连接器瓶在玻璃真空干燥器填充在底部和真空5分钟干燥剂瓶盖松动，并填写氩气干燥器。拧紧瓶盖，并采取了瓶子。密封该瓶用塑料石蜡膜（ 表1），将其放入一个容器中填充有在-20℃的底部，并存储干燥剂。
   注意:涉及使用生物素 - PEG3....

Results

的BFP技术是在1995年¹⁷率先由埃文斯实验室，这picoforce工具已被广泛用来测量固定化在表面上的蛋白质的相互作用，从而分析二维粘附分子动力学与它们的配体^16,19,20相互作用^{， 30，}测量分子的弹性^21,29，并确定蛋白的构象变化^21。对于fBFP，一组额外的与相应的软件系统（ 表1）加落射荧光关联装置（ 图1A - C）。

所述fBFP系统由一个硬件系统（光学，机械和电气部件）和一个软件系统（ 表1和图1A，B）的。倒置显微镜（ 图1A，中间）与光学元件使明视野和落射荧光显微镜组成的主体所述fBFP系统，在其上实验阶段和吸管操纵器被安装。的荧光光源控制器（ 图1A，左上角）是用来提供交变激励灯。的双凸轮系统"DC2"将光分为两.......

Discussion

一个成功的实验fBFP限嗣继承了一些关键的考虑因素。首先，对于力计算是可靠的，微量，红细胞，和探针珠应该对齐接近同轴越好。红细胞的吸移管内的投影应约一个探针移液器直径，使得红细胞和吸管之间的摩擦是微不足道的。对于一个典型的人RBC，最优吸管直径为2.0-2.4微米，这将产生等式1 ^17,30的最佳拟合。第二，以确保在力钳测定及热波动分析测量大多为单键，也可以保持在20％以下具有粘着频率^10,13,30。这里，非特异性粘连应仔细控制（通常<5％的足够阻挡与BSA）。此外，数据应仅由一个单一的力降粘附事件收集 - 的单分子行为标志​​（类似于单步消失荧光在单分子的FRET）。三，装载荧光染料的浓度应根据具体情况逐案进行优化以达到最佳成像品质。第四，染料加载到T细胞或其他感兴趣的细胞毒性需要每次实验前要仔细检查。例如，受体 ​​- 配体相互作用后染料加载的结合亲和力需要被测量和比较，没有染料加载。如果结合亲和力显着改变，由于染料加载，不同的染料或不同的加载浓度必须加以考虑。第五，末端生物素标记的蛋白质是首选方式，方便，专属性强，强耦合，它保留了蛋白质的天然倾向。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸二氢钠一水合物 （NaH2PO4 &H2O）	Sigma-Aldrich	S9638	磷酸盐缓冲液制备
Anhy.磷酸氢二钠 （Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	S7907	磷酸盐缓冲液制备
物 碳酸钠 （Na2CO3）	Sigma-Aldrich	S2127	碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液制备
物 碳酸氢钠 （NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S5761	碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液制备
物 氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5%缓冲液制备
物 氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541	N2-5%缓冲液制备
物 磷酸二氢钾（KH2PO4）	Sigma-Aldrich	P5655	N2-5%缓冲液制备
物 蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389	N2-5% 缓冲液制备
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	珠子功能化
生物素-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC 生物素化
制霉菌素	Sigma-Aldrich	N6261	RBC 渗透压调节
氢氧化铵 （NH4OH）	Sigma-Aldrich	A-6899	玻璃珠硅烷化
甲醇	BDH	67-56-1	玻璃珠硅烷化
30% 过氧化氢 （H2O2）	J. T. Barker	Jan-86	玻璃珠硅烷化
乙酸（冰）	Sigma-Aldrich	ARK2183	玻璃珠硅烷化
3-巯基丙基三甲氧基硅烷 （MPTMS）	Uct Specialties， llc	4420-74-0	玻璃珠功能化
硼硅酸盐玻璃珠	Distrilab Particle Technology	9002	玻璃珠功能化
链霉亲和素−马来酰亚胺	Sigma-Aldrich	S9415	玻璃珠功能化
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	配体功能化
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	细胞内钙荧光染料负载
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	细胞内钙荧光染料负载
Quantibrite PE 珠	BD Biosciences	340495	密度定量
流式细胞仪	BD Biosciences	BD LSR II	密度定量
毛细管 0.7-1.0 mm x 30 英寸	Kimble Chase	46485-1	微量移液器制作
火焰/棕色微量移液器拉拔	器 萨特仪器	P-97	微量移液器制作
移液器 microforce	Narishige	MF-900	微量移液器制作
矿物油	Fisher Scientific	BP2629-1	腔室组件
显微镜盖板	Fisher Scientific	12-544-G	腔室组件
微量注射器	World Precision Instruments	MF34G-5	腔室组件
1 ml 注射器	BD	309602	腔室组件
微量移液器支架	Narishige	HI-7	腔室组件
使用 CNC 加工的自制设计的机械零件和适配器制造。	生物物理仪器	所有部件均根据 CAD 设计定制。	BFP 系统
显微镜（TiE 倒置）	尼康	MEA53100	BFP 系统
物镜 CFI 平场 荧光 40x （NA 0.75， WD 0.72 mm， Spg）	尼康	MRH00401	BFP 系统
相机， GE680， 640 x 480， GigE， 1/3" CCD， 单色	Graftek Imaging	02-2020C	BFP 系统
Prosilica GC1290 - ICX445， 1/3"， C-Mount， 1280 x 960， Mono.， CCD， 12 Bit ADC	Graftek Imaging	02-2185A	BFP系统
手动亚微米探头，带高分辨率遥控器	Karl Suss	PH400	BFP 系统
防振台 （5' x 3'）	TMC	77049089	BFP 系统
3D 手动平移平台	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD 软件	SOLIDWORKS Corp.	2012 SP5	BFP 系统
LabVIEW 软件	National Instruments	2009 版	BFP 系统，BFP 程序
3D 压电平移台	Physik Instrumente	M-105.3P	BFP 系统
线性压电累加器	Physik Instrumente	P-753.1CD	BFP 系统
Micromanager 软件		1.4 版	fBFP 系统，荧光成像程序
双摄像头 （DC-2）	光度测量	77054724	fBFP 系统
双摄像头发射滤光片 （T565LPXR）	光度	77054725	fBFP 系统
荧光相机	滨松	ORCA-R2 C10600-10B	fBFP 系统
塑料石蜡膜（封口膜）	Bemis Company， Inc	PM996	瓶密封
碳酸盐/碳酸氢钠缓冲液 （pH 8.5）			8.4 g/L 碳酸钠 （Na2CO3）、10.6 g/L 碳酸氢钠 （NaHCO3）
磷酸氢盐缓冲液 （pH 6.5-6.8）			27.6 g/L 磷酸二氢钠 （NaH2PO4 &H2O），28.4 克/升 Anhy。磷酸氢二钠 （Na2HPO4）
N2-5% 缓冲液 （pH 7.2）			20.77 g/L 氯化钾 （KCl）、2.38 g/L 氯化钠 （NaCl）、0.13 g/L 磷酸二氢钾 （KH2PO4）， 0.71 g/L 无。磷酸氢二钠 （Na2HPO4），9.70 g/L 蔗糖