我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
膜受体与配体的相互作用介导了多种细胞功能。这些分子相互作用所引发的结合动力学及下游信号转导可能受到结合与信号发生所处力学环境的影响。最近一项研究表明，机械力可调控T细胞受体（TCR）对抗原的识别及其激活过程。这得益于我们开发并命名为荧光生物膜力探针（fBFP）的一项新技术，该技术结合了单分子力谱与荧光显微镜技术。fBFP利用超软的人类红细胞作为灵敏的力传感器，配合高速相机和实时成像追踪技术，在力、空间和时间分辨率上分别达到约1 pN（10-12 N）、约3 nm和约0.5毫秒。利用fBFP，可在施加力学调控的条件下精确测量单个受体-配体结合动力学，同时在单个活细胞上成像结合所触发的细胞内钙信号。该新技术可用于研究其他细胞中在力学调控下的膜受体-配体相互作用及其信号转导过程。
引言
细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的黏附由细胞表面受体、ECM蛋白和/或脂质之间的结合介导1结合使细胞能够形成功能性结构1，以及识别、交流和响应环境1-3. 与可溶性蛋白质不同（例如，细胞因子和生长因子）从三维（3D）液相结合到细胞表面受体，而细胞黏附受体则通过狭窄的连接间隙与其配体结合，连接两个相对的表面，从而在二维（2D）界面上限制分子扩散4-7与传统结合实验通常测量的三维动力学相比（例如，表面等离子共振（SPR），二维动力学必须通过原子力显微镜（AFM）等专门技术进行定量分析8-10，流室11,12，微量移液器13,14，光镊15 和生物膜力探针（BFP）16-21.
不仅仅是为细胞凝聚提供物理连接，黏附分子还是细胞与其周围环境进行通讯的信号机制的重要组成部分。目前，人们越来越关注配体与黏附分子结合如何启动细胞内信号传导，以及初始信号如何在细胞内传递。直观来看，受体-配体结合的特性可能会影响其所诱导的信号。然而，由于传统生化检测方法存在诸多局限性，难以通过这些基于群体反应的实验手段解析细胞外相互作用与细胞内信号事件之间的机制性关系。 例如，时间分辨率较差，且完全缺乏空间分辨率。现有的可在活细胞上同时实现生物物....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案遵循佐治亚理工学院人类研究伦理委员会的指南，并已获得其批准。
1. 人红细胞的分离、生物素标记及渗透压调节
注意：步骤 1.1 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行操作。
- 从指尖采血获取 8-10 µl（一滴）血液，加入 1 ml 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中（表 1 和 2）。轻轻涡旋或用移液器混匀，于 900 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，再洗涤一次。
- 在小烧杯中称取 3.5–4 mg Biotin-PEG3500-NHS 连接剂（表 1），用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液溶解，使终浓度为 3 mg/ml。
- 将 171 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、10 µl 红细胞压积液和 1049 µl Biotin-PEG3500-NHS 连接剂溶液混合，在室温下孵育 30 分钟。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液洗涤红细胞一次，再用 N2-5% 缓冲液洗涤两次（表 1 和 2）。
- 同时，将连接剂瓶盖稍松开，放入底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，抽真空 5 分钟，然后向干燥器中充入氩气。盖紧瓶盖，取出瓶子，用塑料封口膜密封（表 1
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
BFP 技术由 Evans 实验室于 1995 年首次建立17。这种皮牛顿力测量工具已被广泛用于检测固定在表面的蛋白质之间的相互作用，以分析黏附分子与其配体相互作用的二维动力学16,19,20,30，测量分子弹性21,29，以及确定蛋白质的构象变化21。对于荧光 BFP（fBFP），需额外配备一组与落射荧光相关的设备及其配套软件系统（表 1）（图 1A–C）。
fBFP 系统由硬件系统（光学、机械和电气组件）和软件系统（表1 和 图1A、B）组成。该系统的主体是一台倒置显微镜（图1A，中间），配备可实现明场和落射荧光显微成像的光学组件，实验载台和移液器操纵器安装于其上。荧光光源控制器（图1A，左上角）用于提供交替激发光。双相机系统“DC2”将光束分为两路，分别传.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
一次成功的fBFP实验需要考虑几个关键因素。首先，为了确保力的计算可靠，微移液管、红细胞（RBC）和探针小球应尽可能接近同轴对齐。红细胞在移液管内的投影长度应约为一个探针移液管的直径，以使红细胞与移液管之间的摩擦可忽略不计。对于典型的人类红细胞，最佳移液管直径为2.0–2.4 µm，此条件下方程117,30的拟合效果最佳。其次，为了确保在力钳实验和热波动实验中的测量主要针对单个分子键，必须将黏附频率维持在20%以下10,13,30。在此过程中，应严格控制非特异性黏附（通常通过BSA充分封闭将非特异性黏附控制在<5%）。此外，仅应从具有单一力下降事件的黏附记录中收集数据——这是单分子行为的典型特征（类似于单分子FRET中荧光的单步消失现象）。第三，荧光染料的加载浓度应根据具体情况优化，以获得最佳成像质量。第四，在每次实验前，必须仔细评估染料加载对T细胞或其他目标细胞的毒性。例如，应测量并比较染料加载前后受体-配体相互作用的结合亲和力。如果染料加载导致结合亲和力发生显著变化，则需考虑更换染料或调整加载浓度。第五，建议使用末端生物素标记的蛋白质，以便实现方便、特异且牢固的偶联，同时保持蛋白质.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
本论文相关研究及朱实验室中fBFP技术的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI044902、AI077343、AI038282、HL093723、HL091020、GM096187和TW008753的支持。我们感谢Evan Evans发明了这一强大的实验工具，并感谢Evans实验室成员Andrew Leung、Koji Kinoshita、Wesley Wong和Ken Halvorsen在构建BFP过程中的帮助。同时感谢朱实验室其他成员Fang Kong、Chenghao Ge和Kaitao Li在仪器开发方面的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4 • H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| 碳酸钠（Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制 |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% 缓冲液配制 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% 缓冲液配制 |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% 缓冲液配制 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% 缓冲液配制 |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | 珠粒功能化 |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | 红细胞生物素化 |
| 制霉菌素 | Sigma-Aldrich | N6261 | 红细胞渗透压调节 |
| 氢氧化铵（NH₄OH）4OH | Sigma-Aldrich | A-6899 | 玻璃珠硅烷化 |
| 甲醇 | BDH | 67-56-1 | 玻璃珠硅烷化 |
| 30% 过氧化氢（H₂O₂）2O2) | J. T. Barker | 1986年1月 | 玻璃珠硅烷化 |
| 乙酸（冰醋酸） | Sigma-Aldrich | ARK2183 | 玻璃珠硅烷化 |
| 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS） | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | 玻璃珠功能化 |
| 硼硅酸盐玻璃珠 | Distrilab 颗粒技术 | 9002 | 玻璃珠功能化 |
| 链霉亲和素−马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | S9415 | 玻璃珠功能化 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | 配体功能化 |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | 细胞内钙荧光染料加载 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 细胞内钙荧光染料负载 |
| Quantibrite PE 珠 | BD 生物科学 | 340495 | 密度定量 |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | BD LSR II | 密度定量 |
| 毛细管 0.7-1.0 mm x 30 英寸 | Kimble Chase | 46485-1 | 微移液管制作 |
| 弗拉明/布朗微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | 微量移液器制作 |
| 移液管微力器 | Narishige | MF-900 | 玻璃微量移液管制作 |
| 矿物油 | Fisher Scientific | BP2629-1 | 腔室组装 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-G | 腔室组装 |
| 显微注射器 | World Precision Instruments | MF34G-5 | 腔室组装 |
| 1 ml 注射器 | BD | 309602 | 腔室组件 |
| 微量移液器支架 | Narishige | HI-7 | 腔室组装 |
| 使用数控加工自制机械部件和适配器 | 生物物理仪器 | 所有部件均根据 CAD 设计进行定制。 | BFP系统 |
| 显微镜（TiE 倒置） | 尼康 | MEA53100 | BFP 系统 |
| CFI Plan Fluor 40倍物镜（数值孔径0.75，工作距离0.72 mm，弹簧） | 尼康 | MRH00401 | BFP 系统 |
| 相机，GE680，640 × 480，GigE，1/3" CCD，单色 | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP系统 |
| Prosilica GC1290 - ICX445，1/3"，C接口，1280 × 960，单色，CCD，12位ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP系统 |
| 手动亚微米探头，配备高分辨率远程控制 | Karl Suss | PH400 | BFP 系统 |
| 防振台（5’ × 3’) | TMC | 77049089 | BFP系统 |
| 三维手动平移台 | 纽波特 | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD 软件 | SOLIDWORKS 公司 | 版本 2012 SP5 | BFP系统 |
| LabVIEW 软件 | 国家仪器公司 | 版本 2009 | BFP系统，BFP程序 |
| 三维压电平移台 | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP 系统 |
| 线性压电驱动器 | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP系统 |
| Micromanager 软件 | 版本 1.4 | fBFP系统，荧光成像程序 | |
| 双卡（DC-2） | Photometrics | 77054724 | fBFP 系统 |
| 双通道Cam发射滤光片（T565LPXR） | Photometrics | 77054725 | fBFP系统 |
| 荧光相机 | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP系统 |
| 塑料石蜡膜（Parafilm） | Bemis Company, Inc | PM996 | 瓶口密封 |
| 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH 8.5） | 8.4 g/L 碳酸钠（Na2CO3)，10.6 克/升碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | ||
| 磷酸盐缓冲液（pH 6.5–6.8） | 27.6 g/L 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄)2PO4 • H2O)，28.4 g/L 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4) | ||
| N2-5% 缓冲液（pH 7.2） | 20.77 g/L 氯化钾（KCl），2.38 g/L 氯化钠（NaCl），0.13 g/L 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，0.71 克/升无水磷酸氢二钠（Na2HPO4)，9.70 g/L 蔗糖 |
参考文献
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
