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方法文章

T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌

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DOI：

10.3791/52976

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2016年1月13日

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于检测CD4+ T细胞在抗原呈递过程中通过预先感染的树突状细胞（DC）发生易感感染（transinfection）时捕获细菌的实验方案。我们展示了如何完成以下必要步骤：原代细胞的分离、DC的感染、DC与T细胞共轭物的形成，以及细菌在T细胞中易感感染的检测。

摘要

最近，我们发现与已有描述相反的情况：CD4+ T细胞（适应性免疫细胞的典型代表）可通过一种称为“转感染”（transinfection）的过程，从受感染的树突状细胞（DCs）中捕获细菌。本文描述了在抗原呈递过程中发生的转感染过程的分析方法。该过程的揭示依赖于使用来自转基因OTII小鼠的CD4+ T细胞，这些T细胞携带一种特异性识别卵清蛋白肽段（OVAp）的T细胞受体（TCR），因此能够与负载了该特异性OVAp的感染性树突状细胞形成稳定的免疫复合物。通过活细胞成像技术可监测绿色荧光蛋白（GFP）标记的细菌在DC与T细胞间传递的动态过程，同时可通过流式细胞术对细菌转感染进行定量分析。此外，还可采用一种更为灵敏的方法——基于使用庆大霉素（gentamicin）的定量法，该抗生素为非穿透性氨基糖苷类，可杀灭胞外细菌而无法杀灭胞内细菌。这一经典方法此前已在微生物学中用于研究细菌感染效率。本文详细阐述从原代细胞分离到转感染定量的完整实验流程。

引言

当病原体感染宿主时，通常会激活先天性和适应性免疫反应，这是清除细菌所必需的。先天性免疫是防止大多数感染的第一道防线。先天性免疫能够精确识别在多种微生物群体中保守存在的成分（即病原体相关分子模式，PAMPs）1。先天性免疫的机制包括物理屏障（如皮肤）、化学屏障（如抗菌肽、溶菌酶）以及先天性白细胞，后者包括吞噬细胞（巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及自然杀伤细胞2。这些细胞通过直接接触攻击或通过吞噬作用（包括对病原体的 engulfing 和杀灭）来识别并清除病原体。与适应性免疫不同，该系统不能提供终身防御，而适应性免疫则赋予针对病原体的免疫记忆。适应性免疫系统是第二道防线，能够识别并针对多种微生物和非微生物物质的特异性抗原作出反应3。适应性免疫系统的主要组分是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞。B细胞参与体液免疫，分泌针对病原体或外源性蛋白质的抗体。而T细胞则介导细胞免疫，通过分泌细胞因子调节免疫反应，或杀伤被病原体感染的细胞4。

抗原呈递细胞（APC），包括树突状细胞和巨噬细胞，是先天免疫系统的重要组成部分，能够识别并吞噬病原体，并将细菌组分加工为抗原，通过主要组织相容性复合体（MHC）5-7呈递至细胞表面。APC吞噬病原体后，通常迁移至引流淋巴结，在此与T细胞相互作用。T淋巴细胞通过其T细胞受体识别特异性的肽-MHC复合物。在抗原呈递过程中，抗原负载的APC与淋巴细胞之间形成的界面即为免疫突触（IS）8,9。某些细菌可在吞噬后存活，并在APC内部系统性扩散。在此情况下，受感染的APC可作为细菌的储存库或"特洛伊木马"，促进细菌传播10。在免疫突触形成过程中，APC与淋巴细胞之间发生的紧密接触，同时也为膜组分、遗传物质和外泌体的交换提供了平台，并可能被某些病毒利用以感染T细胞；这一过程称为跨感染（transinfection）11-13。

某些致病性细菌（单核细胞增生李斯特菌, 鼠伤寒沙门氏菌 和 Shigella flexneri能够侵入T淋巴细胞 体内 并改变其行为14-16 我们最近报道，T淋巴细胞在抗原提呈过程中，能够通过跨感染方式从先前已被感染的树突状细胞（DCs）中捕获细菌。16T细胞通过转感染捕获细菌的效率比直接感染高得多（1,000–4,000倍）。T细胞能够捕获致病性和非致病性细菌，表明转感染是由T细胞驱动的过程。值得注意的是，转感染T（tiT）细胞可快速杀灭所捕获的细菌，且其杀菌效率高于专业吞噬细胞。16这些结果打破了免疫学中的一个教条，表明适应性免疫细胞能够执行原本被认为是先天性免疫所独有的功能。此外，我们发现 tiT 细胞可分泌大量促炎性细胞因子，并能抵御细菌感染。 体内.

本文介绍了用于研究小鼠模型中细菌转感染过程的不同实验方案。该模型基于使用来自转基因OTII小鼠的CD4+ T细胞，这些T细胞表达一种特异性识别卵清蛋白肽段323-339（OVAp）的T细胞受体（TCR），在I-Ab17分子背景下，可特异性地与负载了OVAp的细菌感染骨髓来源树突状细胞（BMDCs）18,19相互作用，形成稳定的免疫突触。

可通过荧光显微镜观察和追踪T细胞的易感感染。此外，利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌所发出的荧光，还可通过流式细胞术检测被感染的细胞16,20。此外，还可采用一种更为灵敏的方法——庆大霉素存活实验，对T细胞易感感染进行定量分析，从而检测大量事件。庆大霉素是一种无法穿透真核细胞的抗生素，因此使用该抗生素可区分在抗生素处理后仍存活的胞内细菌与已被杀死的胞外细菌21。

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方案

注意：实验方案已获马德里自治大学研究伦理委员会批准，并在马德里自治大学动物福利与健康负责人监督下，依照西班牙及欧洲相关指南实施。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，由经过培训且具备资质的人员采用二氧化碳（CO2）吸入法实施安乐死。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的分化与感染

注意：图1总结了此第一步。从此时起，所有操作均应在生物安全柜中进行，并仅使用无菌培养基、器械、移液器吸头和培养皿。

  1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的分化
    1. 从一只 C57/BL6 小鼠中解剖出胫骨和股骨 22 转移至含有10 ml RPMI培养基的塑料培养皿中。
    2. 用无菌剪刀切除每个骨骺，暴露骨髓，骨髓具有特征性的鲜红色。
    3. 使用无菌注射器在无菌培养皿中将含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）注入骨组织内部（PBS/BSA/EDTA缓冲液）。
    4. 收集细胞悬液，于4 °C下在预冷的离心机中以600 x g离心。
    5. 将细胞重悬于 1 ml 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（0.15 M NH₄Cl）中4Cl, 10 mM KHCO₃3 并加入0.1 mM EDTA，在室温下孵育30秒，以去除红细胞。
    6. 加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，通过细胞滤器（70 μm）过滤以去除骨碎片和细胞团块，然后以相同转速（600 xg）离心，因细胞团块已被过滤去除。
    7. 计数细胞并调整至 5 x 105 细胞/ml，加入含10% FBS的RPMI培养基（含50 μM β-巯基乙醇、1 mM 丙酮酸钠），并以20 ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rm-GM-CSF）作为终浓度。
    8. 将该悬液加入无菌、符合微生物质量要求的15 cm培养皿中，并在CO₂培养箱中培养。2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2).
    9. 每三天，将非贴壁细胞和用 5 mM EDTA 在 PBS 中解离的细胞离心沉淀，重悬于 5 x 105 细胞密度为 cells/ml，加入含 20 ng/ml rm-GM-CSF 的新鲜培养基。
  2. 树突状细胞的成熟与抗原负载
    1. 第9天，将细胞重悬于5 x 105 密度为 cells/ml 的细胞置于含有 20 ng/ml rm-GM-CSF 的培养基中，然后加入 20 ng/ml 脂多糖（LPS），以诱导细胞高表达 MHC-II，于未经组织培养处理的无菌 15 cm 培养皿中孵育 24 小时。
    2. 经LPS刺激一天后，使用针对小鼠CD11c、MHCII和Gr-1的抗体对部分DC细胞进行染色，通过流式细胞术检测DC的分化情况。DC流式细胞术分析示例见 图3A 和 3B.
      1. 孵育DCs（5 x 105 以每样本50 μl PBS/BSA/EDTA缓冲液中含2.5 μg/ml终浓度的抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体对细胞/样本进行封闭。随后，分别在PBS/BSA/EDTA缓冲液中加入MHCII（I-A/I-E）、CD11c和Gr-1抗体，其工作浓度分别为1:100、1:200和1:500，抗体偶联不同的荧光染料，每样本添加50 μl。
      2. 最后，用 PBS/BSA/EDTA 缓冲液洗涤树突状细胞，并根据制造商说明书进行流式细胞术分析。
        注意：如果细胞分化良好，则可进行抗原加载。
    3. 用不含抗生素的 RPMI 10% FBS 洗涤 DCs，并在塑料管中加入 1 ml 含 10 μg/ml OTII OVAp（OVA 323-339；I S Q A V H A A H A E I N E A G R）的 RPMI 10% FBS 培养基，与细胞共同孵育，每管细胞数量为 5 × 10⁶6 树突状细胞在37 ºC下孵育至少1小时。作为阴性对照，树突状细胞不与OVAp共同孵育。
  3. 树突状细胞的感染
    1. 以感染复数（MOI）为10（每个DC感染10个细菌）的细菌感染DC，于CO₂培养箱中孵育1小时2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2).
    2. 用 PBS 洗涤 DC 细胞 3 次，再用含 10% FBS 的 RPMI 培养基洗涤 1 次，每次以 450 × g 离心，以去除大部分胞外细菌。最后，将细胞重悬于不含抗生素的含 10% FBS 的 RPMI 培养基中，浓度为 20 × 10⁶ 个细胞/mL6 cells/ml

2. 从OTII转基因小鼠中分离CD4+ T淋巴细胞

注意：图1总结了此第二步。应使用淋巴结而非脾脏来分离CD4+ T细胞，因为淋巴结中CD4+淋巴细胞的比例（约50%）高于脾脏（约25%），因此纯化效果更佳。

  1. 制备单细胞悬液的淋巴结
    1. 从OTII转基因小鼠中取出腹股沟、腋窝、臂部、颈部和肠系膜淋巴结23，并转移至含有10 ml RPMI 10% FBS培养基的塑料培养皿中。
    2. 在无菌操作台中使用两张磨砂载玻片研磨淋巴结。将淋巴结置于一张磨砂载玻片的磨砂面上，用另一张磨砂载玻片的磨砂面进行研磨，直至组织完全破碎。
    3. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤单细胞悬液。
    4. 通过细胞筛（70 μm）过滤细胞，以去除结缔组织，并用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤。
    5. 将细胞重悬于1 ml ACK裂解缓冲液中，在室温下孵育1分钟，以去除红细胞。
  2. CD4+ T细胞的分离
    1. 重复步骤2.1.3的洗涤操作，计数细胞后将其以100 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于PBS/BSA/EDTA缓冲液中。加入针对CD8、IgM、B220、CD19、MHC II类分子（I-Ab）、CD11b、CD11c和DX5的生物素化抗体（1:250稀释），冰上孵育30分钟，用于后续CD4+ T细胞的阴性筛选。
    2. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤细胞，然后将细胞（100 × 106 个细胞/ml）与链霉亲和素磁珠按制造商说明书推荐浓度混合，冰上孵育15分钟。
    3. 用PBS/BSA/EDTA缓冲液洗涤细胞，并在CD4+ T细胞分离前通过细胞筛（30 μm）过滤。
    4. 根据制造商说明书，使用磁性细胞分选仪通过阴性筛选法分离CD4+ T细胞。
    5. 计数细胞，并用RPMI 10% FBS培养基（不含抗生素）调整至4 × 106 个细胞/ml。
    6. 固定分离得到的CD4+ T细胞（3 × 105 个细胞），置于冰上，用于后续通过流式细胞术检测纯度24。CD4+ T细胞纯化的示例见图3C。

3. 庆大霉素保护法测定T细胞转感染

注意：图2 总结了本实验方案的第三步。

  1. T 细胞转感染
    1. 在 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中，将分离的 CD4+ T 细胞与感染的树突状细胞（DC 细胞）按 1:1 比例共孵育 30 分钟，以形成免疫突触（DC 细胞已感染 1 小时并经洗涤以去除游离细菌）。
    2. 在 24 孔培养板中加入 0.5 ml 分离的 CD4+ T 细胞（2 × 106 个细胞）和 0.1 ml 感染的 DC 细胞（2 × 106 个细胞）。作为阴性对照，直接以感染复数（MOI）为 10 的细菌感染 0.5 ml CD4+ T 细胞，孵育 30 分钟。
    3. 设置额外对照组，使用聚碳酸酯 transwell 小室（孔径 3 μm）将感染的 DC 细胞与 T 细胞分隔，以阻止 DC 与 T 细胞的直接接触。将 0.1 ml DC 细胞加入 transwell 小室内，0.5 ml CD4+ T 细胞加入 24 孔板的下室中。
    4. 最后，各孔补加 RPMI 培养基至总体积为 0.6 ml，确保所有样品体积相等。
    5. 免疫突触形成 30 分钟后，加入 100 μg/ml 的庆大霉素，继续在 CO2 培养箱（37°C，5% CO2）中孵育 1 小时，随后收集细胞。
  2. 再次分离 CD4+ T 细胞
    1. 收集非贴壁细胞，并用 PBS/BSA/EDTA 缓冲液重悬。大多数 DC 细胞仍贴附于塑料培养板上。轻轻涡旋离心管，确保细胞充分解聚。保留 500 µl 细胞上清液作为对照，以验证庆大霉素的杀菌效果。
    2. 从含有 DC 细胞和 T 细胞的混合样本中再次分离 CD4+ T 细胞，方法同步骤 2.2，尽管大多数 DC 细胞已贴壁。将对照样本置于冰上保存。仅采用污染率低于 2% 的实验数据。转感染后 CD4+ T 细胞纯化的示例结果见 图 3D。
  3. 裂解 T 细胞并接种至细菌培养基琼脂平板
    1. 用 PBS 洗涤 CD4+ T 细胞两次。
    2. 计数细胞，并以 2 × 106 个细胞/ml 的浓度用 PBS 重悬。
    3. 在 500 μl T 细胞悬液中加入 500 μl 0.1% Triton X-100，使终浓度为 1 × 106 个细胞/ml，以裂解细胞并释放胞内细菌。
    4. 对裂解后的细胞进行 3 次连续十倍稀释，并将每种稀释液各取 50 μl 接种至细菌培养基琼脂平板。将平板分为 4 区，分别接种不同稀释度的裂解细胞。代表性结果见 图 4。
      1. 作为对照，同时将共轭复合物保存的细胞上清液接种至琼脂平板，以确认庆大霉素有效。另设感染的 DC 细胞作为额外对照。若发生低水平 DC 污染（<2%），应减去相应菌落形成单位（CFUs）的数值。

4. 通过流式细胞术定量T细胞的跨感染

注意：图2 总结了此步骤。

  1. T 细胞转感染
    1. 按照步骤 1.3 感染骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），但本步骤中使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌。
    2. 根据制造商说明书，用细胞示踪染料氯甲基氨基香豆素（CMAC）在 37 °C 下对 CD4+ T 细胞（来自步骤 2.2 中分离的淋巴结）染色 30 分钟。
    3. 用含 10% 胎牛血清（FBS）的 RMPI 培养基（不含抗生素）将标记后的 CD4+ T 细胞洗涤两次。
    4. 将感染后的树突状细胞（与细菌共孵育 1 小时后）与标记的 CD4+ T 细胞在 37 °C 下共孵育 30 分钟，以促进免疫突触形成，同时包括步骤 3.1.1 中所述的所有对照组。
  2. 感染后 CD4+ T 细胞的染色
    1. 在树突状细胞与 T 细胞形成免疫突触 30 分钟后，收集细胞并用 PBS/BSA/EDTA 缓冲液洗涤。
    2. 用 PBS/BSA/EDTA 缓冲液洗涤两次后，通过轻柔涡旋离心管使聚集的细胞分散。
    3. 在室温下用含 3% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液（0.2 ml/管）固定样本 15 分钟，随后用 PBS 洗涤。
    4. 在冰上用含抗小鼠 CD16/CD32 单克隆抗体（2.5 μg/ml）的 PBS/BSA/EDTA 溶液（50 μl/样本）孵育 15 分钟，以阻断树突状细胞的 Fc 受体。
    5. 在冰上用含兔抗细菌抗体（终浓度为 10 μg/ml）的 PBS/BSA/EDTA 溶液（50 μl/样本）孵育 30 分钟，以标记胞外细菌。
    6. 用 PBS/BSA/EDTA 洗涤细胞后，在冰上用含藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠 CD11c 抗体以及另一种荧光染料（如 Alexa Fluor 647）标记的抗兔二抗（稀释比例为 1:200）的 PBS/BSA/EDTA 溶液（100 μl/样本）孵育 30 分钟。
    7. 洗涤细胞后，通过流式细胞术分析样本。务必包括使用非荧光细菌进行转感染的 T 细胞样本作为阴性对照，以及仅用实验中每种荧光染料单独标记的样本，用于补偿校正和调整流式细胞仪参数25。代表性分析结果见图 5。
      注意：若细菌不表达 GFP，为区分胞内与胞外细菌，可先标记胞外细菌，随后用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液固定并透化样本 5 分钟，再用另一种荧光染料对总细菌（胞内 + 胞外）进行染色。

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结果

本文介绍了如何从感染的小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）向T细胞进行细菌转感染，以及如何通过两种不同方法——流式细胞术和庆大霉素保护实验——来检测细菌转感染。图1总结了细胞制备的流程。通过将骨髓细胞在GM-CSF中培养9天来诱导生成树突状细胞。随后，使用LPS对DC进行成熟处理，以增加其膜表面MHCII的表达，便于后续负载卵清蛋白特异性肽段（OVAp）。作为对照，部分DC不负载OVAp。将负载与未负载OVAp的DC均以感染复数（MOI）为10的细菌进行感染。另一方面，从OTII转基因小鼠的淋巴结中分离CD4+ T细胞，该T细胞可特异性识别OVAp。图2展示了进行并定量T细胞转感染的实验流程，包括适当的阴性对照。如前所述，部分DC未负载OVAp，在此情况下DC与T细胞之间存在相互作用，但由于缺乏OVAp，无法形成免疫突触。另一个对照组则使用聚碳酸酯transwell小室（孔径3 μm）将DC与T细胞分隔开，以阻止二者之间的直接接触；DC被置于transwell内部，因其体积较大而无法穿过该...

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讨论

T细胞或T淋巴细胞是一类白细胞，在细胞介导的免疫中发挥核心作用，属于适应性免疫应答。26T细胞对感染具有抗性 体外 但有部分报道称它们也可能被感染 体内14,15. 抗原提呈细胞与T细胞在免疫突触过程中的紧密接触，为生物物质的交换提供了平台13，包括某些病毒，如HIV11最近研究表明，与传统观念相反，作为适应性免疫细胞典范的T细胞也能够通过从感染的树突状细胞（DCs）进行的转感染，有效摄取细菌。11,16. 本文展示了定量测定T细胞细菌转感染的详细方案 体外 来自感染的BMDCs。

抗原识别可增强T细胞的细菌转感染16。我们通过使用来自OTII转基因小鼠的CD4+ T细胞（该T细胞识别特定的OVAp抗原）、负载OVAp的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）以及感染了不同细菌的小鼠（本文数据来自Salmonella enterica）来展示这一现象。将来自OTII小...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了西班牙科学与创新部基金 BFU2011-29450、BFU2008-04342/BMC 以及西班牙高等科学研究理事会（CSIC）基金 PIES201020I046 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI菲舍尔科技SH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
Na 丙酮酸盐赛默飞世尔科技SH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323–339)GenScript
70 μm 细胞筛BD352350
 30 μm 注射器滤器 无菌BD340598
AutoMacs ClassicMiltenyi Biotec130-088-887
庆大霉素Normon624601.6
TranswellCostar3415
LB 培养基Pronadisa1231
琼脂Pronadisa1800
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
Triton X-100
CD8 生物素标记BD 生物科学553029
IgM 生物素标记ImmunoStep克隆 RMM-1
B220 生物素标记BD 生物科学553086
CD19 生物素标记BD 生物科学553784
MHC-II 生物素标记 (I-A/I-E)BD 生物科学553622
CD11b 生物素标记ImmunoStep11BB-01mg
CD11c 生物素标记ImmunoStep11CB3-01mg
DX5 生物素标记BD 生物科学553856
Gr-1 生物素标记BD 生物科学553125
CD16/CD32ImmunoStepM16PU-05MG
抗沙门氏菌抗体ABD Serotec8209-4006
CD11c-PEBD 生物科学553802
CD4-APCTonbo 生物科学20-0041-U100
Gr-1-APCBD 生物科学553129
MHC-II (I-A/I-E) FITCBD 生物科学553623
Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附InvitrogenA-21245
CMAC (7-氨基-4-氯甲基香豆素)Life TechnologiesC2110
BSASIGMAA7030-100G
链霉亲和素磁珠Miltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD 生物科学

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T Trans well
T细胞通过树突状细胞的转感染捕获细菌
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