基于短暂性脑缺氧-缺血的血栓性脑卒中模型

摘要

血栓栓塞性卒中模型是优化再通治疗的重要工具。本文报道一种基于短暂性脑缺氧-缺血（tHI）损伤的小鼠血栓性卒中模型，该模型可诱发血栓形成和脑梗死，并在与卒中患者相似的治疗时间窗内对组织型纤溶酶原激活物（tPA）介导的纤维蛋白溶解表现出良好反应。

摘要

卒中研究在将神经保护疗法转化为临床实践的过程中经历了诸多挫折。相比之下，临床实际应用的疗法（tPA溶栓）在目前占主导地位的基于机械闭塞的实验模型中却很少产生疗效。这种基础研究与临床应用之间的脱节提示，有必要在临床前卒中研究中采用对tPA有反应的模型。为此，本文建立并描述了一种简单且对tPA有反应的血栓性卒中模型。该模型通过在成年小鼠中短暂闭塞单侧颈总动脉，并通过面罩输送7.5%的氧气，持续30分钟，同时将动物直肠温度维持在37.5 ± 0.5 °C。尽管单独进行单侧颈动脉结扎或低氧处理仅能短暂抑制脑血流，但两者联合可导致持续的再灌注障碍、纤维蛋白和血小板沉积，以及大脑中动脉供血区域的大面积梗死。重要的是，在tHI后0.5、1或4小时经尾静脉注射重组tPA（10 mg/kg），可时间依赖性地降低死亡率和梗死体积。这一新型卒中模型操作简便，可在不同实验室间标准化，便于实验结果的比较。此外，该模型无需开颅或引入预制栓子即可诱导血栓形成。鉴于这些独特优势，tHI模型为临床前卒中研究工具库增添了一项有价值的手段。

引言

溶栓和再通是临床实践中治疗急性缺血性卒中最有效的疗法¹。然而，大多数临床前神经保护研究是在一种短暂性机械阻塞模型（线栓法大脑中动脉阻塞）中进行的，该模型在血管阻塞解除后脑血流迅速恢复，且组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓几乎无法带来额外益处。有观点认为，卒中模型选择的不合理至少在一定程度上导致了神经保护疗法难以向患者转化^2,3。因此，目前越来越呼吁在临床前研究中采用对tPA有反应的血栓栓塞性卒中模型，但这类模型也存在技术难题（见讨论部分）^4-7。本文介绍一种基于单侧短暂性低氧-缺血（tHI）损伤的新型血栓性卒中模型，并描述其对静脉注射tPA治疗的反应⁸。

tHI卒中模型是基于Levine法（单侧颈总动脉永久性结扎后，在密闭舱内暴露于短暂缺氧环境）发展而来的，该方法最初于1960年为成年大鼠实验所创立⁹。原始的Levine法后来逐渐被遗忘，因其仅导致不稳定的脑损伤；但当Robert Vannucci及其同事于1981年将其重新引入作为新生鼠缺氧缺血性脑病（HIE）模型时，同一处理在幼龄啮齿类动物中却能产生一致的神经病理改变¹⁰。近年来，一些研究者通过调整缺氧舱内的温度，将Levine-Vannucci模型重新改良用于成年小鼠¹¹。有理由推测，原始Levine法中脑损伤不一致的结果可能源于成年啮齿类动物在缺氧舱内体温波动所致。为验证这一假设，我们对Levine法进行了改良，通过面罩给予缺氧气体，同时在手术台上将啮齿类动物的核心体温维持在37 °C ¹²。结果正如预期，严格控制体温显著提高了缺氧缺血（HI）所致脑病理改变的可重复性。HI损伤还可引发凝血、自噬以及灰质和白质损伤¹³。其他研究者也已采用HI模型来研究卒中后的炎症反应¹⁴。

HI卒中模型的一个独特特征是其严格遵循血栓形成的Virchow三要素，包括血流停滞、内皮损伤（例如由HI引起的氧化应激所致）以及高凝状态（HI诱导的血小板活化）（图1A）¹⁵。因此，HI模型可能捕捉到一些与真实世界缺血性卒中相关的病理生理机制。基于这一思路，我们进一步改进了HI模型，采用单侧颈总动脉可逆性结扎（从而建立短暂性HI损伤），并检测了该模型对tPA溶栓治疗联合或不联合依达拉奉的反应。依达拉奉是一种自由基清除剂，已在日本获批用于发病24小时内缺血性卒中的治疗⁹。我们的实验表明，仅30分钟的短暂HI即可诱发血栓性梗死，而tPA与依达拉奉联合治疗具有协同保护作用⁸。本文详细描述了tHI模型的手术操作步骤及方法学考量，该模型可用于优化急性缺血性卒中的再灌注治疗策略。

方案

本方案已获得埃默里大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。

1. 实验准备

1. 手术前至少15分钟，将连接热泵的加热垫调至37 °C，准备好手术台，并在手术台上使用3 ml注射器筒作为颈枕。准备含有2%异氟烷的医用空气麻醉气体。
2. 准备已高压灭菌的镊子、剪刀、显微持针器、止血钳、棉签和缝合线。备好组织胶和眼药膏。
3. 设置低氧系统及温度控制器，配备加热灯和直肠探头。准备低氧气体，其中含2%异氟烷、7.5% O₂，余量由92.5% N₂平衡。
4. 术前1小时，通过皮下注射缓释美洛昔康（4.0 mg/kg）对小鼠进行镇痛处理。

2. 短暂性脑缺氧-缺血（图1B）

1. 将10至13周龄、体重22至30 g的雄性C57BL/6小鼠置于麻醉诱导舱中，使用3%异氟烷麻醉，直至小鼠对足部挤压无反应，随后使用电子剃毛器去除右侧颈部毛发。
2. 将小鼠置于手术台上，通过流速为2 L/min的医用空气连接2%异氟烷进行麻醉。使用医用胶带将前肢沿颈部两侧的卷垫向外固定。
3. 用聚维酮碘对切口手术部位进行清洁，随后使用酒精和棉签擦拭。
4. 在解剖显微镜下，使用直镊和显微剪在皮肤中线外侧约0.2 cm处做一条0.5 cm长的右侧颈部切口。
5. 使用精细有齿镊分离筋膜和组织，暴露右侧颈总动脉（RCCA）。用精细无齿镊小心地将右侧颈总动脉与迷走神经分离。
6. 在RCCA上用两条预先剪好的5-0丝线（可松解）打活结，然后使用4-0单丝尼龙缝线缝合皮肤图1C).
7. 双眼涂抹眼膏以防止干燥。
8. 迅速将小鼠转移至缺氧系统，并将面罩罩住其口鼻，通入含2%异氟烷的7.5% O₂₂ 在流速为   0.5-1 L/min，持续30分钟。
   1. 缺氧期间，使用带有加热灯的温度控制器将直肠温度维持在37.5 ± 0.5 °C。监测呼吸频率，保持在80–120次/分钟。在缺氧过程中维持体温高于37 °C对于形成一致的脑梗死至关重要。呼吸频率降低通常发生在缺氧20分钟后。若呼吸频率降至40次/分钟以下，应移除面罩，恢复常氧供气。 此 耗时1-2分钟，不计入 进入30分钟缺氧持续期。
9. 缺氧处理后，将小鼠转移至手术台，松开两侧颈外动脉（RCCA）的两根缝线，用组织胶闭合切口，然后将小鼠放回笼中。若缺氧后两个活结意外全部松脱，则排除该动物。
10. 监测小鼠5-10分钟，待其从缺氧和麻醉中恢复。将湿润的食物放入笼内，并将小鼠送回动物饲养设施。
    注意：在tHI后24小时表现出轻度至重度环行行为的动物与脑梗死相关。大多数出现癫痫症状的动物在死亡前 24 小时时间点 tHI 后

3. 激光散斑对比成像

注意：尽管这不是tHI模型的必要步骤，但可以使用二维激光散斑对比成像系统¹⁶来表征短暂性缺氧缺血（tHI）期间或之后脑血流（CBF）的变化。若需记录tHI过程中的CBF变化，应在步骤2.6完成后立即进行。或者，若需比较tHI损伤后CBF的恢复情况，可在步骤2.10之后执行这些操作。

1. 将麻醉后的小鼠 置于俯卧位，在头皮上做一条长约1 cm的正中切口，暴露颅骨但不打开。
2. 根据仪器制造商的操作说明，在血流成像仪下监测双侧大脑半球的脑血流（CBF），并在颈总动脉闭塞手术（步骤2.6）后立即开始记录脑血流，持续记录50分钟。
3. 使用MoorFLPI软件按照制造商说明，以16色伪彩图显示任意单位的CBF图像，并实时分析选定区域（图2）。
4. 完成CBF图像记录后，用组织胶闭合头皮切口，并将动物放回笼中。

4. tPA 给药

1. 通过尾静脉向动物注射溶剂或10 mg/kg重组tPA（220-300 μl） 0.5、1 或 4 小时时给予 1 mg/m tPA 双侧颈总动脉结扎加低氧处理后（图4).

5. 多种不同选项下的脑损伤检测

注意：为采集脑组织样本，需在tHI后1、4或24小时处死小鼠。

1. 通过梗死体积定量分析 在 体内 损伤后24小时采用此前所述的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法。¹⁷
   1. 在经心灌注前30分钟，按每克体重约0.1 ml的剂量向动物腹腔注射1.4 M甘露醇溶液。随后经心灌注小鼠，先用PBS灌注，再灌注10 ml 2% TTC
   2. 用手术器械在10分钟后取出动物的脑组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜，随后使用振动切片机切成1 mm厚的切片。
   3. 使用数码显微镜拍摄一系列四张脑切片图像，利用ImageJ软件将梗死体积量化为梗死区域（右侧白色区域）与未受损对侧半球区域的比值。
2. 或者，在1小时时通过免疫荧光检测血栓形成 在tHI损伤后。
   1. 将固定好的脑组织在O.C.T.包埋剂中冷冻，并使用冷冻切片机将脑组织切成12 μm厚度的切片。
   2. 将脑切片与兔抗纤维蛋白原抗体（1:100）孵育，随后加入羊抗兔Alexa Fluor 488荧光染料（1:200），在荧光显微镜下观察荧光信号。
3. 或者，通过尾静脉注射 100 µl 进行血管阻塞 tHI 损伤后 4 小时注射 2% 伊文思蓝染料。
   1. 处死小鼠，在伊文思蓝注射后迅速剪下头部，将脑组织放入4%多聚甲醛中。注意：此过程需5-10分钟 伊文思蓝循环显示前肢和后肢均呈蓝色。
   2. 使用滑动式切片机将固定的大脑组织切成100 μm厚度的切片，并在荧光显微镜下使用680 nm发射滤光片观察荧光。

结果

采用二维激光散斑对比成像技术（LSCI）¹⁶，比较了30分钟短暂性单侧颈动脉闭塞（tCCAO）、30分钟低氧暴露（7.5% 氧气）以及低氧条件下30分钟单侧颈动脉结扎（tHI）对脑血流（CBF）变化的影响。实验结果显示，在常氧条件下进行tCCAO可使结扎侧半球的CBF下降至基线值的约50%，在解除颈动脉闭塞后（图2A中的R），CBF迅速恢复至基线值的85%以上。单独暴露于全身性低氧环境可使CBF降低至基线值的约75%，在恢复常氧环境后短暂反弹至约130%（图2B）。相比之下，在低氧条件下进行颈动脉结扎（tHI）可在约10分钟内使同侧半球CBF迅速下降至基线值的20%以下，在解除结扎并恢复常氧环境20分钟后，CBF极少恢复至30%以上。然而，对侧半球（L）的CBF在低氧期间在基线值的20%至50%之间波动，并在tHI损伤后迅速恢复至80%以上（图2C）。

在tCCAo（30分钟）或tCCAo联合30分钟缺氧（tHI）后24小时， 体内 采用TT...

讨论

脑卒中是人口老龄化社会日益重要的重大健康问题。全球范围内，脑卒中是仅次于心脏病的第二大死亡原因，2010年约有590万例死亡事件，占全球总死亡人数的11.1%¹⁸。2010年，脑卒中也是全球伤残调整生命年（DALYs）损失的第三大原因，相较于1990年的第五位有所上升¹⁹。这些流行病学数据凸显了对急性（缺血性）脑卒中更有效治疗手段的迫切需求。然而，尽管在临床前神经保护治疗方面进行了大量研究，目前在美国食品药品监督管理局（FDA）批准的急性缺血性脑卒中特异性治疗手段仍仅有tPA溶栓疗法，而许多在动物研究中曾显示出潜力的神经保护剂在临床试验中均告失败。将神经保护疗法成功转化至临床应用面临诸多挑战，当前的研究重点集中在规范实验室操作、多数据集的荟萃分析以及通过国际合作提升临床前脑卒中研究的质量^20,21。然而，也有少数观点认为，转化困难的根本原因在于迄今为止大多数临床前脑卒中研究采用了机械性血管闭塞模型（例如经腔内缝线法大脑中动脉闭塞）^2,3。由于机械性血管闭塞模型极少引发血栓形成，且在机械阻塞解除后脑血流再灌注发生过快，这类模型既无法对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年雄性小鼠	Charles River	C57BL/6	10–13 周龄（22–30 g）
便携式实验动物麻醉系统	VetEquip	901807	麻醉
医用空气（压缩）气罐	Airgas	UN1002	麻醉
异氟烷	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-25	麻醉
多站式实验动物麻醉系统	Surgivet	V703501	缺氧系统
7.5% O2 与 92.5% N2 混合气罐	Airgas	UN1956	缺氧系统
带加热灯的温度控制器	Cole Parmer	EW-89000-10	温度控制器
直肠探头	Cole Parmer	NCI-00141PG	温度控制器
解剖显微镜	Olympus	SZ40	手术装置
带加热垫的热泵	Gaymar	TP700	手术装置
精细弯头镊子（带齿）	FST	11370-31	手术器械
精细弯头镊子（光滑）	FST	11373-12	手术器械
显微剪刀	FST	15000-03	手术器械
显微持针器	FST	12060-01	手术器械
Halsted-蚊式止血钳	FST	13008-12	手术器械
5-0 丝线缝合线	Harvard Apparatus	624143	手术耗材
4-0 尼龙单丝缝合线	LOOK	766B	手术耗材
组织胶	Abbott Laboratories	NC9855218	手术耗材
Puralube Vet 软膏	Fisher	NC0138063	预防眼部干燥
MoorFLPI-2 血流成像仪	Moor	780 nm 激光源	激光散斑对比成像
甘露醇	Sigma	M4125	体内 TTC
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Sigma	T8877	体内 TTC
振动切片机	Stoelting	51425	用于 体内 TTC 的脑切片
数码显微镜	Dino-Lite	AM2111	全脑成像
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
山羊抗兔 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	免疫组织化学
冷冻切片机	Vibratome	ultrapro 5000	用于免疫组织化学的脑切片
伊文思蓝	Sigma	E2129	检测血管灌注
切片机	Electron Microscopy Sciences	5000	用于组织学的脑切片
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	Sigma	T48402	安乐死
荧光显微镜	Olympus	DP73
Meloxicam SR	ZooPharm		非甾体抗炎镇痛药